南开大学硕士环境分子生物学实验报告.docx

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南开大学硕士环境分子生物学实验报告

2012年环境分子生物学实验报告

 

 

实验一:

16SrRNA靶向变性梯度凝胶电泳指纹图谱分析微生物菌群

一、实验原理

由于微生物体内16S核糖体RNA的基因编码区含有一定的保守序列和非保守序列,保守序列可应用与PCR引物的设计,非保守序列则可应用于不同种类微生物间的比较鉴定。

双链DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时,其迁移行为决定于其分子大小和电荷。

不同长度的DNA片段能够被区分开,但同样长度的DNA片段在胶中的迁移行为一样,因此不能被区分。

试验首先提取水样样品的DNA,用根据实验目的设计的引物进行PCR扩增,PCR产物用DGGE等方法分析,借此评估土壤微生物遗传物质多样性。

聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,为最常用的分子生物学技术之一。

典型的PCR由

(1)高温变性模板;

(2)引物与模板退火;(3)引物沿模板延伸三步反应组成一个循环,通过多次循环反应,使目的DNA得以迅速扩增。

其主要步骤是:

将待扩增的模板DNA置高温下(通常为93℃-94℃)使其变性解成单链;人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合,两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短;耐热的DNA聚合酶(Taq酶)在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入,以目的基因为模板从5’到3’方向延伸,合成DNA的新互补链。

DGGE可以根据序列将相同长度的DNA片段混合物分开。

分离的原理是基于DNA片段在含有梯度变性化合物(通常是尿素和甲酰胺的混合物)配制的聚丙烯酰胺凝胶中的序列特异性熔点不同实现的。

在5’端引入GC夹(GC-clamp)可以保护DNA片段不会完全变性。

DGGE能对微生物群落进行快速的分析和比较。

利用DGGE可使组成的多样性一目了然,不同序列的片段将停留在不同的位置,其中每一条带原则上代表一种细菌系群。

染色后,在凝胶中DNA分子停止迁移的位置会看到条带。

理论上,DGGE指纹图谱可以区分不长于500bp的PCR扩增产物上的一个碱基对的差别。

该技术在快速比较不同环境中的微生物群落和监测某一特定的群落在不同时间的组成变化中非常有效。

二、设备与仪器

PCR仪,电泳仪,凝胶成像系统,高速冷冻离心机,台式离心机,移液枪及枪头,离心管等。

三、实验步骤

1、地表水细菌基因组DNA提取

1)实验试剂

裂解液:

0.05MTris-HCl(pH8.0),0.1MNaCl,0.1MEDTA(pH8.0),1%SDS;

Tris饱和酚:

用1MTris-HCl(pH8.0)饱和的新鲜苯酚,含0.1%的8-羟基喹啉,pH>7.8;

酚/氯仿/异戊醇:

Tris饱和酚中加入氯仿和异戊醇,体积比为25:

24:

1;

TE:

0.01MTris-HCl,0.001MEDTA,pH8.0;

1×TAE电泳缓冲液:

0.04MTris,0.02MHAc,0.05MEDTA,pH8.0;

0.5×TBE电泳缓冲液;

无水乙醇,70%乙醇。

2)实验步骤

取1.5mL地表水样4000r/min离心10min,弃上清。

重复六次后,加入500μL裂解液充分悬浮。

加入500μLTris饱和酚,混匀,室温放置10min,4000r/min离心10min。

吸取上层水相转移至新离心管,加入等体积的酚/氯仿/异戊醇,颠倒混匀后4000r/min离心10min。

(若有必要,可重复操作一次。

吸取上层水相转移至新离心管,加入两倍体积无水乙醇,充分沉淀后10000r/min离心10min,弃去上清液。

加入1mL70%乙醇,充分悬浮后10000r/min离心10min,弃去上清液,晾干10min。

加入50μLTE溶解,得到细菌基因组DNA。

取10μL样品进行电泳检查(Marker为λDNA/HindⅢ酶切),剩余样品-20℃保存。

 

2、细菌16SrRNA基因V3区扩增

取2.0μL基因组DNA作为PCR模板,按照下表顺序和体积将反应液加入0.5mL的薄壁PCR管中,总体积50μL。

引物1:

5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’

引物2:

5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’

表:

试剂

体积(μL)

终浓度

模板

2.0

--

引物1(10μM)

1.0

0.2μM

引物2(10μM)

1.0

0.2μM

10×PCRBuffer(含Mg2+)

5.0

10mMdNTPs

1.0

0.2mM

Taq聚合酶

1.0

2U

ddH2O

39.0

--

总体积

50.0

--

轻轻混匀并瞬间离心,放入PCR仪进行扩增,共35个循环。

PCR反应条件:

94℃,5min,预变性;

94℃,1min变性;

52℃,1min退火;

72℃,3min延伸;

72℃,5min,最后一次延伸。

PCR总时间约3.5h。

PCR完成后取5μL样品进行电泳检查(Marker为DL2000),剩余样品-20℃保存。

 

3、变性梯度凝胶电泳图谱分析微生物菌群

1)前期准备

30%丙烯酰胺储备液:

含30%丙烯酰胺和0.8%亚甲双丙烯酰胺,避光保存于4℃。

1×TAE:

0.04MTris,0.02MHAc,0.05MEDTA,pH8.0。

10%过硫酸铵(APS):

0.1gAPS溶于1.0mL水,-20℃保存一周。

含变性剂8%丙烯酰胺凝胶溶液(现用现配):

低浓度变性剂:

4.2mL30%储备液+1.92mL去离子甲酰胺+2.016g尿素+9.9mL1×TAE;

高浓度变性剂:

4.2mL30%储备液+3.84mL去离子甲酰胺+4.032g尿素+8.0mL1×TAE。

四甲基乙二胺(TEMED)

去离子甲酰胺

2)实验步骤

(1)将丙烯酰胺储备液放置至室温,安装胶板和注射器等装置。

(2)分别配制含30%和60%的变性剂的8%胶溶液各16mL。

配置低浓度和高浓度变性的胶溶液各16mL加入比色管中,各加入14.4μL的TEMED和144μL的10%的APS,迅速混匀并吸入注射器中,终浓度0.09%。

(3)用注射器吸取凝胶溶液装胶,各吸取16mL凝胶溶液,体积设置14.5mL。

放上梳子,凝固1h。

清洗吸取胶液的管子。

(4)配制7L的1×TAE并微波预热至60℃。

(5)胶凝固后,将胶板安装至电泳装置。

打开搅拌器设定60℃加热。

(6)取出梳子,清洗上样孔。

(7)关闭循环泵,上样。

(8)160V电泳4h。

(9)结束电泳,用0.5mg/mLEB染色。

(10)观察并拍照。

 

四、实验结果与分析

1、地表水细菌基因组DNA提取

分别是来自新开湖和马蹄湖的水样。

实验结果分析:

圈红线的两个样品是我提取水样DNA的电泳效果。

中间亮条带是Marker。

DNAMarker是分子量不同的DNA片段,主要用途就是DNA分子凝胶电泳时,加样用做对比来检测琼脂糖凝胶是否有问题。

DNA分子的大小在凝胶中,DNA片段迁移距离(迁移率)与碱基对的对数成反比,因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较,便可测出未知片段的大小。

但是当DNA分子大小超过20kb时,普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。

此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小,因此,就用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时,分子大小不宜超过此值。

不同构型DNA的移动速度次序为:

供价闭环DNA(covalentlyclosedcircular,cccDNA)>直线DNA>开环的双链环状DNA。

当琼脂糖浓度太高时,环状DNA(一般为球形)不能进入胶中,相对迁移率为0(Rm=0),而同等大小的直线双链DNA(刚性棒状)则可以长轴方向前进(Rm>0),由此可见,这三种构型的相对迁移率主要取决于凝胶浓度,但同时,也受到电流强度、缓冲液离子强度等的影响。

2、细菌16SrRNA基因V3区扩增

实验结果分析:

和上图一样,圈红线的两个条带是我提取DNA的PCR产物的检测结果。

条带还算清晰,就是有轻微拖尾现象,这可能是由于电压过大,DNA跑的过快的原因。

PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。

短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5’端之间,是需要扩增的特定片段。

短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的,以一个原始模板为例,

在第一个反应周期中,以两条互补的DNA为模板,引物是从3’端开始延伸,其5’端是固定的,3’端则没有固定的止点,长短不一,这就是“长产物片段”。

进入第二周期后,引物除与原始模板结合外,还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。

引物在与新链结合时,由于新链模板的5’端序列是固定的,这就等于这次延伸的片段3’端被固定了止点,保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。

不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加,而“长产物片段”则以算术倍数增加,几乎可以忽略不计,这使得PCR的反应产物不需要再纯化,就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。

而这些产物长度一致,固然在交替上的条带位置一致。

3、变性梯度凝胶电泳图谱分析微生物菌群

DGGE电泳图像

从左数第五个是我的样品。

图像里的DNA条带过于密集,分的不是也别好。

这可能是由于时间紧凑,电压过大的原因。

图中,每一个竖条带代表了这个基因组的一个群落组成情况,不同条带之间,条带的亮度代表量的大小,可以看出优势群众是哪些,也可以通过不同条带之间的比对,来分析同一来源基因组的群落变化,也可以用来分析不同来源基因组之间群落组成的差异。

 

实验二:

细菌培养和菌落PCR

一、实验原理

微生物通常是肉眼看不到的微小生物,而且无处不在。

在无菌条件下,用接种环挑取微生物,把它由一个培养皿转接到另外一个培养皿中进行培养,是微生物学研究中最常用的基本操作。

固体培养基是用琼脂或其他凝胶物质固化的培养基。

分散的微生物在适宜固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体,称为菌落。

不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落一般都具有稳定的特征,可以称为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。

培养平板是被用于获得微生物纯培养的最常用的固体培养形式。

大多数细菌、酵母菌以及许多真菌和单细胞藻类都能方便的通过平板分离法活的纯培养,主要有涂布平板法、稀释倒平板法,平板划线法等,本实验采取平板划线法。

平板划线分离法具体操作为:

先制无菌琼脂培养基平板,待充分冷却凝固后,用接种环以无菌蘸取少量待分离的含菌样品,在无菌琼脂平板表面有规则地划线。

划线的方式有连续划线、平行划线、扇形划线或其他形式的划线。

通过这样在平板上进行划线稀释,微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少,并逐步分散开来。

经培养后,可在平板表面形成分散的单个菌落。

但单个菌落并不一定是由单个细胞形成的,需再重复划线l~2次,并结合显微镜检测个体形态特征,才可获得真正的纯培养物。

 

二、实验步骤

1、细菌培养(大肠杆菌)

1)牛肉膏蛋白胨培养基的配制

培养基配方:

牛肉膏

5.0g

蛋白胨

10.0g

NaCl

5.0g

琼脂

20.0g

蒸馏水

1000mL

pH7.0

2)实验步骤:

(1)称药品按实际用量计算后,按配方称取各种药品放入大烧杯中。

牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量,用热水溶解后倒入大烧杯;也可放在称量纸上称量,随后放入热水中,牛肉膏便与称量纸分离,立即取出纸片。

蛋白胨极易吸潮,故称量时要迅速。

(2)加热溶解在烧杯中加入少于所需要的水量,小火加热,并用玻璃棒搅拌,待药品完全溶解后再补充水分至所需量。

若配制固体培养基,则将称好的琼脂放入已溶解的药品中,再加热融化,此过程中,需不断搅拌,以防琼脂糊底或溢出,最后补足所失的水分。

(3)调pH检测培养基的pH,若pH偏酸,可滴加1滴1mol/LNaOH,边加边搅拌,并随时用pH试纸检测,直至达到所需pH范围。

若偏碱,则用1mol/LHCl进行调节。

pH的调节通常放在加琼脂之前。

应注意pH值不要调过头,以免回调而影响培养基内各离子的浓度。

(4)过滤液体培养基可用滤纸过滤,固体培养基可用4层纱布趁热过滤,以利结果的观察。

但是供一般使用的培养基,该步可省略。

(5)分装按实验要求,可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。

分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上面造成污染。

分装量:

固体培养基约为试管高度的1/5,灭菌后制成斜面。

分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜。

半固体培养基以试管高度的1/3为宜.灭菌后垂直待凝。

(6)加塞试管口和三角瓶口塞上硅胶泡沫塞。

(7)包扎加塞后,可将若干支试管用牛皮纸扎在一起,并用绳子扎好。

将三角瓶的硅胶泡沫塞外包一层牛皮纸。

(8)培养基的灭菌时间和温度,需按照各种培养基的规定进行,以保证灭菌效果和不损培养基的必要成份。

培养基经灭菌后,必须放37℃温室培养24h,无菌生长者方可使用。

2、菌落PCR扩增细菌16SrRNA基因

(1)从平板上挑取少许白色菌落,将其置于20μL双蒸水中,95~100℃保温5~10min。

(2)将离心管15000r/min室温离心5min,取上清液作为模板进行PCR检测。

引物F:

5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’

引物R:

5’-AAGGAGGTGWTCCARCC-3’

表:

试剂

体积(μL)

终浓度

模板

2.0

--

引物1(10μM)

1.0

0.2μM

引物2(10μM)

1.0

0.2μM

10×PCRBuffer(含Mg2+)

5.0

10mMdNTPs

1.0

0.2mM

Taq聚合酶

1.0

2U

ddH2O

39.0

--

总体积

50.0

--

轻轻混匀并瞬间离心,放入PCR仪进行扩增,共35个循环。

PCR反应条件:

94℃,5min,预变性;

94℃,30s变性;

56℃,40s退火;

72℃,60s延伸;

72℃,5min,最后一次延伸。

PCR总时间约1.5h。

PCR完成后取5μL样品进行电泳检查(Marker为DL2000),剩余样品-20℃保存。

(3)取适量扩增产物进行电泳分析。

三、实验结果与分析

有轻微的条带,量比较少。

 

实验思考题:

1、PCR-DGGE检测的基本原理是什么?

由于微生物体内16S核糖体RNA的基因编码区含有一定的保守序列和非保守序列,保守序列可应用与PCR引物的设计,非保守序列则可应用于不同种类微生物间的比较鉴定。

双链DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时,其迁移行为决定于其分子大小和电荷。

不同长度的DNA片段能够被区分开,但同样长度的DNA片段在胶中的迁移行为一样,因此不能被区分。

2、为什么要在上游5端添加GC夹?

变性梯度凝胶电泳(DGGE)是一种根据DNA片段的熔解性质而使之分离的凝胶系统。

核酸的双螺旋结构在一定条件下可以解链,称之为变性。

核酸50%发生变性时的温度称为熔解温度(Tm)。

Tm值主要取决于DNA分子中GC含量的多少。

DGGE将凝胶设置在双重变性条件下:

温度50~60℃,变性剂0~100%。

当一双链DNA片段通过一变性剂浓度呈梯度增加的凝胶时,此片段迁移至某一点变性剂浓度恰好相当于此段DNA的低熔点区的Tm值,此区便开始熔解,而高熔点区仍为双链。

这种局部解链的DNA分子迁移率发生改变,达到分离的效果。

Tm的改变依赖于DNA序列,即使一个碱基的替代就可引起Tm值的升高和降低。

为了提高DGGE的突变检出率,可以人为地加入一个高熔点区——GC夹。

GC夹(GCclamp)就是在一侧引物的5′端加上一个30~40bp的GC结构,这样在PCR产物的一侧可产生一个高熔点区,使相应的感兴趣的序列处于低熔点区而便于分析。

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