二氧化硫水溶液提取黑加仑中花色苷和酚类物质的研究.docx
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二氧化硫水溶液提取黑加仑中花色苷和酚类物质的研究
二氧化硫水溶液提取黑加仑中花色苷和酚类物质的研究
J.E.CacaceandG.Mazza
摘要：
水果、蔬菜、红葡萄酒有益人体健康主要归因于其中存在的花色苷及酚类物质。
本文通过单因素实验研究了不同SO2浓度（28、300、700、1100、1372ppm）、温度（6、20、40、60、74℃）、液固比（6、20、40、60、74ml/g）对黑加仑中酚类物质的提取的影响。
通过响应面法优化了花色苷和总酚的产量，以及提取液抗自由基和抗氧化活性。
实验结果表明，酚类物质的提取效果受SO2浓度、液固比和提取温度的影响，花色苷和总酚的最佳提取条件为SO2浓度1000−1200ppm，液固比为19L/kg冻浆果，浸提温度升高，浸提的速率增加，因而总酚和花色苷萃取平衡的时间将减少。
然而，由于花色苷在较高的温度下会降解，因此建议提取温度为30-35℃。
抗氧化活性试验的结果也同时受这三个因素影响，并且液固比约高，抗氧化效果越差。
关键词：
花色苷；酚类；黑加仑（黑醋栗）；二氧化硫；黄酮醇；提取工艺；抗氧化性；功能性食品；保健品
前言
研究表明水果、蔬菜中黄酮类化合物和其它植物化学物质对预防癌症、冠心病、中风有作用[1，2]。
同时，黄酮和一些酚类物质还表现出多种生物活性，如消炎、抗菌，抗氧化和舒张血管的作用[2，3]。
目前已经出现具有抗氧化活性的水果、蔬菜、谷物的产品[4，5]，研究表明，其抗氧化活性与黄酮类化合物的结构有着密切的关系[6-8]，同时，从越桔属、悬钩子属、虎耳草科酷栗属的浆果中得到花色苷和酚类化合物也具有抗氧化活性[9，10]。
对富含花色苷的植物的调查表明，浆果是酚类化合物的最重要来源之一[11]。
黑加仑是9中研究的浆果中活性第二强的[12]。
黑加仑中的花色苷主要是矢车菊-3-葡萄糖甙，飞燕草-3-葡萄糖苷，矢车菊-3-芸香糖甙，和飞燕草-3-芸香糖甙[11，13]。
其中矢车菊-3-葡萄糖甙的抗氧化活性已被认为是目前商业用抗氧化剂（BHA、VE）活性的两倍[7]。
另外，浆果中的黄酮醇、有机酸等物质也具有明显的抗氧化作用，如甜樱桃和蓝莓中含有的羟基肉桂酸可抑制食物中脂肪的氧化[14]。
高浓度的羟基肉桂酸衍生物，尤其是咖啡因和P-香豆酸[15，16]，还有黄酮醇，如杨梅素，槲皮素，山萘酚，也是在黑加仑中发现[16-18]。
采用液体溶剂提取植物中的化学物质是产品生产的重要一步。
其中有两个基本概念：
过程平衡和提取速率，分别表示从植物组织中提取化合物的多少和溶出速率。
植物组织中的化合物会溶解到浸提的溶液中直至达到平衡。
平衡方程为：
（1）
其中m是平衡常数，
是目标化合物的在提取液中的质量分数，
是目标化合物占干原料的质量分数[19，20]。
m是溶质、溶剂和温度的特征常数。
目前有采用不同的溶剂和酸化方式从葡萄酒渣[21]和草莓[22]中提取花色苷的研究，向日葵中萃取花色苷的效果也受萃取溶剂影响显著[23，24]。
有研究表明，随着提取液中SO2的增加，葡萄（Vitisvinifera）中的花色苷提取率也增加[25]。
Gao和Mazza的研究表明[23]，从葵花籽壳中萃取花色苷受溶剂类型的影响，二氧化硫水溶液的提取效果优于乙酸和乙醇水溶液，并且尽量使用二氧化硫水溶液作为提取溶剂是减少萃取过程中有机溶剂损耗和降低成本的解决方法。
萃取的效果还将取决于何快速地使目标化合物在提取液中达到平衡浓度。
浓度梯度越大，扩散系数较大，物料的粒径越小，萃取的速率越快。
因此葵花籽壳破碎越彻底[23]，葡萄酒渣[26]的粒径越小，将获得更高的花色苷和酚类化合物提取率。
温度升高，粘度系数下降，扩散系数就越大[27]。
虽然有用二氧化硫水溶液作为提取液解决提取过程中花色苷热降解的报道[28]，但是从黑加仑中萃取酚类化合物，特别是萃取花色苷的最优条件迄今尚未见报道。
响应面法已经成功地用于葵花籽壳中提取花色苷产量的优化[23]，同时也被用来选择最好的提取溶剂，温度，提取时间，以最大限度地提高脱脂琉璃苣粉的抗氧化活性[29]。
本次试验目的是为了优化黑加仑中酚类化合物的提取，试验条件可按比例扩大。
1.原料和方法
1.1原料的制备：
单个速冻的黑加仑；2000年生产季节（M&GBrothersFarm,Abbotsford,BC）采摘后在-36℃下冻藏，直到使用。
浆果放在液氮预冷粉碎机（modelED-5,ArthurH.ThomasCo.,Philadelphia,PA）中捣碎，机器转速为520r/min，使用6mm的筛网和2.0mm的刀刃间距。
在-25℃下用筛子（modelOctagon200,EndecottsLimited,London,U.K.）根据美国筛分标准筛分5（4.0mm），7（2.8mm），10（2.0mm），16（1.18mm），18（1.0mm），60（0.25mm）控制粒度分布。
筛子在使用前后分别称重并记录，差值即为样品在粘附在筛子上的质量。
粒度分布和平均粒径通过查与筛子孔径大小相对应的颗粒质量概率分布图获得[20]。
经破碎的浆果在0℃冷室中编号并保存于-36摄氏度与氮气密封容器中，并在2周之内使用。
1.2提取工艺：
在4L的玻璃烧杯中加入经破碎的冷冻样品和2.5L提取溶剂，提取溶剂为二氧化硫水溶液，制备方法为将Na2S2O3溶液用醋酸调节pH至3.8。
影响因素为二氧化硫浓度，温度，浆果的重量等。
搅拌器为一直径6.35cm的翼型轴流叶轮（modelA310Lightnin,MixingEquipmentCo.Inc.,Rochester,NY）。
当烧杯在恒温水浴锅中升温至特定温度时，按固液比加入浆果样品，固液比根据干浆果的重量计算。
在提取过程中，定期取3ml提取液用分光光度计检测280或520nm处吸光度，直至吸光度读数不再变化，此时即达到平衡。
此过程建立了一个与以往的萃取用固定的时间差[22，26]或单独用时间[23，29]作为变量所不同的研究方法。
这种技术用在这里可以更彻底的提取到目标物，因而可以获得每个条件下的最大提取量。
此时，平衡时间便成为了另外的一个变量，平衡时间可由酚类化合物浓度与萃取时间曲线获得。
用SigmaPlot公司的软件（SPSSInc.,Chicago,IL）拟合出最佳曲线并获得酚类物质的最高预测值。
用公式
（1）计算平衡常数m，花色苷和酚类化合物的提取率F（%）用下面公式计算：
和
（mg/g）分别表示平衡时每g冻浆果中提取的花色苷质量和冻浆果原料中花色苷含量。
1.3混合条件：
将转速控制在1210r/min，来获得雷诺数10000的湍流效果[30]，为了确保混合效果相同，搅拌叶轮和容器的几何尺寸，叶轮的安装位置，叶轮与容器直径的比例在整个试验过程中都固定的。
选择叶轮直径为6.35cm，容器直径为15.6cm，这样叶轮直径与容器直径的比为0.41。
叶轮距离容器底部的距离为四分之一的容器直径，即为3.9cm。
为了混合均匀，溶剂量为2.5L，并对叶轮调整至推荐位置：
距离容器底部为三分之一的液体深度[30]。
高度在浆果加入后会改变，但是依然在推荐的范围（11.7-23.4cm）之内。
叶轮相对用夹子以15°的偏心角固定在没有挡板的容器中，避免涡流的形成。
叶轮距离容器侧壁的距离控制在4.1cm。
1.4检测与分析：
在提取过程只中定期对采样检测直至最终提取结束，样品用注射器通过孔径为0.45μm的PVDF滤膜后，用分光光度计分别检测280nm，320nm，360nm和520nm处的吸光度，得到总酚、酒石酸酯、黄酮醇及花色苷的含量。
标准样品使用绿原酸，咖啡酸，槲皮素和矢车-3-葡萄糖苷。
冷冻浆果（10克）在搅拌机中按先前说那样用80％乙醇萃取后测定成分[31]。
取大约4g破碎的冷冻黑加仑，加入100mlSO2浓度为1100ppm的提取液，并在20℃恒温箱中浸泡60h，然后用no.541滤纸抽滤，滤液定容至100ml，按上述方法分析组分。
冷冻黑加仑干物质含量测定方法为：
将2-4g样品放入真空烘箱中70℃保持30h。
高效液相色谱系统组成由液相色谱系统（Agilent1100series,AgilentTechnologiesInc.,PaloAlto,CA），并个配备一个光电二极管阵列探测器，自动进样器，和一个控制模块。
每次加样5μm，柱子为一个反相C18柱（ZorbaxSB,5μm,4.6×250mm,AgilentTechnologiesInc.）和一个保护柱（Inertsil5ODS-2,5μm,30×4.6mm,Phenomenex,Torrance,CA）。
溶剂A采用甲酸/水（5:
95V/V），溶剂B为甲醇溶液。
B溶液配置如下（v/v）：
0min，10%；0−30min,10−25%；30−50min,25−45%；50−55min,45−100%；55−60min,100%；60−65min,100−10%.流速为1.0ml/min，通过峰面积计算成分含量。
标准品为绿原酸，咖啡酸，槲皮素和矢车-3-葡萄糖甙，其标准曲线分别在280nm，320nm，360nm和525nm处测定。
提取物抗氧化活性用其清除一定浓度的DPPH·自由基的方法来表示，如Fukumoto和Mazza[7]用此方法研究了β-胡萝卜素的抗氧化活性。
同时抗氧化活性也可以用一定浓度差的提取液的抗氧化指数来表示。
因此，Wettasinghe和Shahidi参照β-胡萝卜素抗氧化活性的研究方法，将样品浓度控制在16−150ppm，并在0和90min后依次测定不同浓度样品的吸光度，便计算出抗氧化指数[29]。
A0为未加药DPPH溶液的空白吸光度，Ai为加药后DPPH溶液的吸光度，Aj为样品溶液自身的吸光度。
1.5实验方法设计：
采用响应面发优化提取效果[32]。
采用中心复合三因素五水平设计。
由18个试验点组成，包括4个中心实验。
独立变量为二氧化硫浓度，温度和固液比，二氧化硫浓度分别为28ppm，300ppm，700ppm，1100ppm和1372ppm。
固液比在6到74之间（表1）。
测定总酚提取率，平衡时间，分配系数，抗氧化活性，抗自由基的活性，等提取液的抗氧化指标。
表1.中心组合实验设计
编号
温度 （℃）
液固比 a
SO2 浓度b
1
20 （−1）
20 （−1）
300 （−1）
2
20 （−1）
20 （−1）
1100 （+1）
3
20 （−1）
60 （+1）
300 （−1）
4
20 （−1）
60 （+1）
1100 （+1）
5
60 （+1）
20 （−1）
300 （−1）
6
60 （+1）
20 （−1）
1100 （+1）
7
60 （+1）
60 （+1）
300 （−1）
8
60 （+1）
60 （+1）
1100 （+1）
9
6 （−1.68）
40 （0）
700 （0）
10
74 （+1.68）
40 （0）
700 （0）
11
40 （0）
6 （−1.68）
700 （0）
12
40 （0）
74 （+1.68）
700 （0）
13
40 （0）
40 （0）
28 （−1.68）
14
40 （0）
40 （0）
1372 （+1.68）
15
40 （0）
40 （0）
700 （0）
16
40 （0）
40 （0）
700 （0）
17
40 （0）
40 （0）
700 （0）
18
40 （0）
40 （0）
700 （0）
a按干物质计算ml/g；b通过计算得出ppm
数据分析采用软件RSREG，PLOT和REGproceduresofSAS（SASInstituteInc.,Cary,NC）拟合成二阶多项式方程来优化提取条件。
RSREG软件被用来估计模型中各个变量对结果的影响，拟合程度在0.1％的显着水平。
响应面模型中，通过保持最有效的独立变量固定在一个恒定值来获得预测模型的拟合值。
2.结果与讨论
在3天中，将冷冻黑加仑破碎，制得的黑加仑粒子的粒度分布和平均粒径几乎相同。
颗粒重量和粒径分布均匀，粒径分布见图1.获得的平均粒径为1.6mm，从而保证了试验结果不受原料取样的干扰。
图1.冷冻黑加仑经520r/min破碎机破碎后的粒度分布（采用用6毫米筛网和一个2.1毫米刀片间距）
分析结果见表2，黑加仑中花色苷含量比文献报道值要高。
但是，Banaszczyk、Pluta、Moyer等人[34]用同样的样品用乙醇在搅拌器中提取得到的花色苷含量与cv.BenLomond[10]得到的结果相似。
此外，在波兰的cv.BenLomond用水提花青素的结果也在季节性变化的范围之内[34]。
由于采用提取平衡的方法[19]，为了确保提取完全，需要采用足够长提取时间（60h），这就导致了一些非酚类化合物的溶入乙醇，就导致了吸光度在280nm处的增加。
Mok和Hettiarachchy[28]研究了用1000ppm的二氧化硫水溶液提取葵花籽壳中非花色苷多酚，García-Viguera等人[22]研究了用水溶液提取草莓中花色苷。
当用高效液相法测定样品成分时，花色苷的含量和分光光度计检测的结果相近，但是，用高效液相测定的总酚含量明显要低，这可能是因为蛋白质在280nm附近有吸收，干扰了吸光度检测的结果。
表2.破碎冻黑加仑的成分a
样品
总酚b
酒石酸酯c
黄酮醇d
花色苷e
干物质含量（%）
1f
89.4
2.8
2.1
15.8
22.9
2
91
2.7
1.8
14.9
22.1
3
86.3
2.8
1.9
15.2
22.4
平均
88.9 ± 2.4
2.8 ± 0.08
1.9 ± 0.14
15.3 ± 0.44
22.5 ± 0.41
1g
21.7
2.2
1.6
15.7
2
19.5
2
1.3
14.2
3
18.7
1.9
1.3
13.5
平均
20.0 ± 1.6
2.0 ± 0.12
1.4 ± 0.17
14.5 ± 1.1
a以mg每g干物质表示下列数值：
b绿原酸；c咖啡酸；d槲皮素；e矢车-3-葡萄糖甙；f由分光光度计所测吸光度计算所得；g用HPLC测定的结果。
对总酚产率回归模型进行方差分析，从表3中可以看出，回归模型达到显著水平（P<0.01），而误差项不显著，说明回归方程与实际情况吻合较好。
而花色苷产率，酒石酸酯产率、黄酮醇产率（数据未列出）无统计学意义（P>0.1）。
对总酚和花色苷的提取平衡时间也非常显着（p<0.01）。
不过，对于抗氧化活性指标的响应面分析模型（表4）显示该模型无显着性变异性，其原因是由于其抗氧化活性太低，无法由β-胡萝卜素的抗氧化活性测定测定。
但是用DPPH法检测出很强的清除自由基的活性，并且其模型具有显著性和变异性。
回归系数和变异系数和调整后的总酚、花色苷产率、提取时间以及黑加仑提取物抗氧化指数的二阶回归方程见表5.。
表3.总酚和花青素提取率，分配系数，以及平衡时间的响应面数据
总酚
花色苷
编号
提取率a
分配系数
平衡时间b
提取率c
分配系数
平衡时间b
1
25.4
0.13
128
12.2
0.25
130
2
32.1
0.18
52
13.4
0.37
55
3
33.3
0.06
68
12.7
0.09
70
4
55.6
0.11
48
13.4
0.12
51
5
23.5
0.12
45
11.4
0.21
32
6
35.6
0.3
15
13.3
0.38
38
7
26.6
0.05
18
13.1
0.08
22
8
39.2
0.31
10
13.7
0.12
22
9
36.4
0.09
135
13.5
0.14
136
10
23.4
0.2
20
9.7
0.11
20
11
23.7
0.47
62
11.6
1.17
80
12
41.3
0.12
29
13.3
0.1
29
13
24.3
0.04
88
11.7
0.08
92
14
40.6
0.3
32
12.5
0.13
40
15
36.9
0.09
40
13.1
0.13
42
16
31.4
0.16
33
12
0.13
37
17
32.5
0.07
22
12.8
0.16
46
18
31
0.11
40
13.7
0.17
40
model
***d
**
***
NS
**
***
linear
***
***
***
*
**
***
quadratic
NS
*
**
NS
**
NS
cross-product
*
NS
NS
NS
NS
NS
R2
0.928
0.841
0.944
0.63
0.813
0.921
effects
SO2浓度
***
**
***
NS
NS
**
温度
**
NS
***
NS
NS
***
液固比
***
**
*
NS
***
NS
a.总酚的产率以冻干浆果计算（mg/g）；b.以min计；c.花色苷提取率（以矢车-3-葡萄糖苷计）以冻干浆果计算（mg/g）；d.***表示在P<0.01水平上显著，**表示在P<0.05水平上显著，*表示在P<0.1水平上显著
表4.清除自由基活性，抗氧化活性，及抗氧化指数响应面分析数据
编号
清除自由基活性a
抗氧化活性
抗氧化指数 （%）
1
−4.02
892
85.8
2
−3.75
694
83
3
−3.53
711
58.5
4
−4.30
745
42.8
5
−4.14
937
87.9
6
−4.16
747
87
7
−4.99
1331
70.1
8
−6.14
501
70.4
9
−4.43
1189
67.6
10
−5.36
569
80.5
11
−5.21
1142
91.8
12
−5.56
263
51.6
13
−3.59
822
74.2
14
−5.50
416
63.8
15
−4.64
656
70.8
16
−4.75
555
72.1
17
−4.18
369
75.9
18
−4.36
348
70.3
model
*b
NS
***
linear
**
NS
***
quadratic
NS
NS
NS
cross-product
NS
NS
***
R2
0.772
0.627
0.977
effects
SO2 浓度
NS
NS
**
温度
*
NS
***
液固比
*
NS
***
a．μMDPPH/μM；b.***表示在P<0.01水平上显著，**表示在P<0.05水平上显著，*表示在P<0.1水平上显著
表5.总酚、花色苷产率、提取时间以及黑加仑提取物抗氧化指数回归方程的方差分析表
总酚
花色苷
变量a
提取率
平衡时间
提取率
平衡时间
抗氧化指数（%）
intercept
25.41***
241.5***
12.2***
338.0***
96.83***
X1
0.014*c
−0.16***
0.0012*
−0.29***
X2
−4.06**
−6.30***
X3
−1.20**
−2.85**
−0.49***
X12
5.1×10-5*
4.5×10-5***
X22
−0.0015*
0.032***
−0.00054***
0.025**
X32
X1X2
0.0004**
0.0040**
X1X3
0.0008***
−0.0012*
0.0031**
−0.00058***
X2X3
0.00047*
0.044*
X1X2X3
−1.2×10-5**
−5.5×10-5*
9.9×10-6***
model
***
***
**
***
***
R2
0.945
0.919
0.508
0.946
0.968
a多项式方程为
，X1为SO2浓度，X2为温度，X3为液固比
随着液固比的增加，花色苷和总酚产量也随之增加，达到平衡所需时间减少（图2），在SO2浓度为300ppm时比在1100ppm时这种趋势更加明显。
提取温度从20℃上升至60℃时花色苷提取率并没有增加，但是提取平衡所需时间缩短了，温度通过影响扩散系数而会影响一个特定物质的提取率，提高温度会增加扩散系数，从而使扩散速度增加，提取时间缩短。
在SO2浓度为1100ppm，液固比为60mL/g时，提取温度从20℃升高至60℃时，花色苷的提取率降低，这个可能是由于花色苷在高温下会热降解造成的。
图2.
总酚的提取率会受三个因素的影响，但是主要还是受二氧化硫的浓度和液固比的影响。
随着液固比的增加，总酚提取率明显增加（图3A），尤其是在温度比较低的时候，总酚提取率与液固比保持线性增长，以干基绿原酸当量计算，从25mg增加到78mg。
总酚化合物在高温下增长缓慢，可能是由于一些热敏感物质的热降解或二氧化硫在高温下从提取液中挥发造成的。
Kalt等人报道温度对从蓝莓中提取总酚比提取花色苷的影响要小[35]。
在SO2浓度较高的情况下，增加液固比有利于总酚的提取，但是在SO2浓度较低的情况下其效果不明显（图3B）。
提取的限制步骤为SO2浓度低，在高浓度SO2时，溶剂的溶解性能增加，然后增加液固比可以获得一个较高的总酚提取率。
图3
总酚的提取率随着SO2浓度的增加而增加，但是在高的液固比时增幅比较明显。
花色苷的提取也随SO2浓度的增加而增加，但效果不显着。
SO2对提取效果的影响确切机制还不清楚，但是有报道[23]说SO2与细胞壁作用，有可能是溶解度增加、扩散改善的原因。
随着SO2浓度的增高，从葡萄[25]，葵花籽壳中[23，28]提取花色苷的产率也增加。
在室温下用纯水提取黑加仑中花色苷和总酚的产率与用最低SO2浓度（28ppm）提取的效果差不多[9]，溶剂的组成会影响溶剂的密度，粘度，进而影响扩散速度和提取率，它还影响活度系数，从而改变一个特定化合物在溶剂中的溶解度。
同时受溶剂组成影响的还有介电常数，此属性是衡量正反带点粒子间电荷相互作用强度的，也与一个溶剂的溶解性能有关。
因此通过改变压力和温度，减少溶剂的介电常数（
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