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1.1.2正交试验数据分析

1.2最佳工艺验证试验

例子：

口服液水提工艺研究

[实验目的]本试验采用正交试验设计，利用L9（34）正交表测定出膏率与补骨脂的转移率以确定最佳的提取条件。

[实验原理]

1.对处方中主要含水溶性有效成分的药物，根据“混煎增溶”的原理和传统用药习惯，采用中药制剂中最常用的水煎法提取各药物的有效浸膏。

2.采用L9（34）正交表进行设计，出膏率、补骨脂素与异补骨脂素含量之和为指标，对加水量、提取时间、提取次数进行3因素3水平优选，正交试验因素水平表见表1。

[实验方法]

1.按处方比例称取药材，置于圆底烧瓶中，连接冷凝管，准备提取；

2.正交试验：

按L9（34）正交设计表中条件进行提取，滤过，合并提取液，浓缩到一定量（<

50ml），定容至50ml容量瓶中，准确量取一定量（15ml）定容后提取液，置已恒定重量的蒸发皿中，干燥至恒重，计算出膏率。

3.参照中国药典2010年版补骨脂素与异补骨脂素含量测定方法，测定各提取液中补骨脂素与异补骨脂素含量，对补骨脂转移率进行极差、方差分析，确定最佳提取条件。

[补骨脂素与异补骨脂素含量测定方法]照高效液相色谱法（附录VID）测定：

色谱条件与系统适应性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；

甲醇-水（43：

57）为流动相；

检测波长246nm。

理论板数按补骨脂素峰计算应不低于3000

对照品溶液的制备精密称取补骨脂素对照品、异补骨脂素对照品适量，加甲醇制成每1ml各含补骨脂素与异补骨脂素0.02mg的溶液，即得。

供试品溶液的制备精密量取本品2ml置25mL量瓶中，加甲醇适量，超声处理30分钟，放置至室温，定容至刻度，摇匀，即得。

测定法：

分别精密称取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪中，测定，即得。

注：

补骨脂药材中补骨脂素与异补骨脂素含量按0.7%计。

表1正交试验因素及水平表

水平

因素

加水量（倍）

水煎时间（h）

煎次数煮（次）

1.5

表2正交试验设计表及结果

试验号

（加水量）

（煎煮时间）

（煎煮次数）

（空白）

出膏率

（%）

补骨脂

转移率

（倍）

（小时）

（次）

30.6285

22.9592

33.1524

42.8704

37.4696

67.4950

37.7184

45.7506

39.0198

61.9179

34.7883

32.7545

36.9784

57.1086

35.7574

30.1440

39.4699

69.8134

101.2505

105.3253

101.1742

109.1182

111.5265

107.9296

110.3407

104.9191

112.2057

111.7278

113.4678

110.9454

10.9552

6.4025

12.2936

6.0263

133.3246

125.8184

85.8577

154.6905

140.4230

134.9323

158.4344

132.7335

157.0660

170.0629

186.5215

143.3896

23.7414

44.2445

100.6638

21.957

一、出膏率极差分析：

1.因素A：

KA1=30.6285+33.1524+37.4696=101.2505

KA2=37.7184+39.0198+34.7883=111.5265

KA3=36.9784+35.7574+39.4699=112.2057

RA=KA3-KA1=10.9552

2.因素B：

KB1=30.6285+37.7184+36.9784=105.3253

KB2=33.1524+39.0198+35.7574=107.9296

KB3=37.4696+34.7883+39.4699=111.7278

RB=KB3-KB1=6.4025

3.因素C：

KC1=30.6285+34.7883+35.7574=101.1742

KC2=33.1524+37.7184+39.4699=110.3407

KC3=37.4696+39.0198+36.9784=113.4678

RC=KC3-KC1=12.2936

由RA=10.9552、RB=6.4025、RC=12.2936，得出：

RC＞RA＞RB

4.因素A极差分析折线图：

因素B极差分析折线图：

因素C极差分析折线图：

5.结论：

对出膏率进行极差分析得出最佳提取条件：

A2B3C3，加8倍水，煎煮3次，每次2小时。

二、出膏率方差分析：

（30.6285+33.1524+37.4696+37.7184+39.0198+34.7883+36.9784+35.7574+39.4699）2=11735.3889

S总=（30.62852+33.15242+37.46962+37.71842+39.01982+34.78832+36.97842+35.75742+39.46992）-11735.3889=65.6132

SA=

（KA12+KA22+KA32）-Q=25.1403

SB=

（KB12+KB22+KB32）-Q=6.9067

SC=

（KC12+KC22+KC32）-Q=27.1941

Se=S总-SA-SB-SC=6.3722

FA=

=3.95

FB=

=1.08

FC=

=4.27

出膏率方差分析

变异来源

离均差平方和

自由度

均方

25.14

12.57

3.95

0.05

6.91

3.45

1.08

27.19

13.60

4.27

误差

6.37

3.19

F0.05（2,2）=19.00

三、结果分析

通过对出膏率进行方差分析，得出A、B、C三个因素均无显著性差异，说明此三个因素对出膏率都没有显著的影响；

对出膏率极差分析：

影响出膏率的因素顺序为C＞A＞B，由K值得出，最佳提取条件：

A3B3C3，加10倍水，煎煮3次，每次2小时。

四、补骨脂转移率极差分析

KA1=22.96+42.87+67.50=133.32

KA2=45.75+61.92+32.75=140.42

KA3=57.11+30.14+69.81=157.07

RA=KA3-KA1=23.74

KB1=22.96+45.75+57.11=125.82

KB2=42.87+61.92+30.14=134.93

KB3=67.50+32.75+69.81=170.06

RB=KB3-KB1=44.24

KC1=22.96+30.14+32.75=85.86

KC2=42.87+45.75+69.81=158.43

KC3=61.92+67.50+57.11=186.52

RC=KC3-KC1=100.66

由RA=23.74、RB=44.24、RC=100.66，得出：

RC＞RB＞RA

因素A极差分析折线图：

对补骨脂转移率进行极差分析得出最佳提取条件：

五、补骨脂转移率方差分析：

（22.96+42.87+61.92+45.75+67.50+30.14+57.11+32.75+9.81）2=20622.26

S总=（22.962+42.872+61.922+45.752+67.502+30.142+57.112+32.752+9.812）-Q=2342.07

（KA12+KA22+KA32）-Q=99.00

（KB12+KB22+KB32）-Q=363.87

（KC12+KC22+KC32）-Q=1798.83

Se=S总-SA-SB-SC=80.37

=1.23

=4.53

=22.38

补骨脂转移率方差分析

方差来源

离差平方和

方差

F值

显著性

169.93

13.04

1.09

P﹥0.05

216.80

14.72

1.38

1798.83

42.41

11.49

156.51

12.51

六、结果分析

通过对补骨脂转移率进行方差分析，得出A、B、C三因素均无显著性差异，说明A、B、C三因素对补骨脂转移率都没有显著的影响；

对补骨脂转移率极差分析：

影响补骨脂转移率的因素顺序为C＞B＞A，由K值得出，最佳提取条件：

结合生产实际，最终确定的最佳工艺为：

煎煮两次，第一次8倍水，煎煮1.5小时；

第二次6倍水，煎煮1小时。

七、验证试验：

按暂定的最佳提取工艺制备3批，进行含量测定,测定结果见下表：

批号

补骨脂含量（mg/ml）

平均转移率（%）

20101122

0.2376

58.51

0.2361

58.12

20101124

0.2388

58.79

0.2350

57.84

59.00

20101127

0.2452

60.29

0.2459

60.47

RSD（%）

1.9

结果表明：

三批转移率的平均值为59.00%，RSD=1.9%<

3.0%,说明此工艺稳定，可用于大生产。

（二）成型工艺研究

举例：

黑素再生颗粒成型工艺研究

本处方共有十一味药材，所得浸膏粘稠，干燥物易吸潮，采用常压烘干、减压干燥、冷冻干燥等方式，周期长、费用高、影响因素多，且成品率低。

通过预试验，确定制剂采用一步制粒干燥方式。

（1）一步制粒干燥成型工艺研究

该品种的试验研究设备规格型号为:

PGL-30B型。

试验研究各参数如下：

浸膏相对密度：

1.20～1.22（60～75℃）一次进风温度：

90～110℃

药液温度：

60～70℃　　　　　　　　　二次进风温度：

出风温度：

60～75℃　　　　　　　　　喷速：

15～30V

实验结果见下表：

试验成型技术研究

糊精：

药液

颗粒状态

颗粒溶化性、吸湿性

工艺操作

1：

颗粒适中

易吸湿

难

好

易

颗粒中细粉多

由上述实验结果知，对于本制剂提取的药液清膏，利用试验研究设备，糊精与药液比在1：

1.5时颗粒状态、溶化性较好，不易吸潮，且所用辅料量较少；

用该比例进行制备颗粒，经检验均合格。

在此基础上，进行流动性实验。

具体实验及结果如下：

颗粒的流动性：

采用固定漏斗法进行测定，计算休止角（tgα=H/R，H=2cm），考察结果如下表：

颗粒流动性实验结果

实验号

R（cm）

α°

x±

3.24

31.7

31.63±

0.06

3.25

31.6

3.26

31.5

31.47±

3.28

31.4

从表结果分析，物料的休止角远小于45°

，流动性较好，适宜进行大生产条件下颗粒灌装。

（2）颗粒剂量、规格的选择

在前述工艺研究的基础上，进行中试制备工艺研究，实验结果见下表：

中试制备工艺结果

生药投药量

糊　精

颗　粒

折合处方量

折合日服用量

11.88kg

6kg

9.90kg

550个

18g

颗粒日服用生药为21.6g。

根据小试及多批中试数据，其日服用颗粒约为18g，考虑到生产损耗及装量差异，我们确定装量为3g/袋，每次二袋，每日三次。

（三）质量标准研究

1.薄层鉴别试验方法学考察

口服液补骨脂薄层鉴别试验方法学考察

12345

1.补骨脂阴性对照

2.补骨脂对照药材

3、4、5三批供试品

2.含量测定方法学考察

口服液补骨脂含量测定方法学考察

1.色谱条件选择：

通过试验，确定采用2010年版《中国药典》一部补骨脂药材含量测定项下的测定条件进行。

色谱柱：

C18柱（4.6mm×

150mm，5μm）；

柱温：

30℃；

流动相：

甲醇－水（45:

55）；

检测波长：

246nm；

理论塔板数：

以补骨脂素峰计n>

3000，符合药典要求；

分离度：

与相邻杂质峰分离度R>

1.5，符合药典规定。

2.对照品溶液的制备：

精密称取补骨脂素对照品0.0060g、异补骨脂素对照品0.0077g置50ml容量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度；

再精密量取溶液2ml于10ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，得补骨脂素浓度为0.0240mg/ml，异补骨脂素浓度为0.0308mg/ml的对照品溶液。

3.供试品溶液的制备：

精密量取本品（批号：

10121502）10ml于25ml量瓶中，加入甲醇10ml，超声处理（功率150W，频率100kHz）30分钟，放冷，加甲醇定容至刻度，摇匀，离心（转速为每分钟3000转）10分钟，取上清液，滤过，取续滤液，即得。

4.线性：

取补骨脂素浓度为0.1200mg/ml，异补骨脂素浓度为0.1540mg/ml的对照品溶液各1、2、4、6ml于10ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，得5个浓度梯度，分别进样20μl测定，记录色谱图（见附图1），补骨脂素与异补骨脂素测得浓度和峰面积结果见表1：

表1补骨脂素线性关系考察结果

浓度（X）

0.0120

0.0240

0.0480

0.0720

0.1200

补骨脂素（Y）

2162034

3773508

7244769

10971182

18246641

表2异补骨脂素线性关系考察结果

0.0154

0.0308

0.0616

0.0924

0.1540

异补骨脂素（Y）

2656398

4643094

8934216

13512171

21633734

以浓度X为横坐标，峰面积Y为纵坐标做线性回归，得线性方程为：

补骨脂素Y=1.4966×

108X+218475,r=0.9998；

异补骨脂素Y=1.3791×

108X+505990,r=0.9998；

补骨脂素在0.0120~0.1200mg/ml;

异补骨脂素在0.0154~0.1540mg/ml范围内线性关系良好。

5.准确度（加样回收率试验）：

精密称取已知含量的样品（批号：

10121502，已知浓度补骨脂素为0.0330mg/ml，异补骨脂素为0.0253mg/ml）3、4、5ml各3份，分别精密加入已知浓度的对照品溶液（补骨脂素浓度为0.1200mg/ml与异补骨脂素浓度为0.1040mg/ml）1ml，按1项下方法测定，计算回收率，结果见表3、4：

表3补骨脂素加样回收率结果

样品体积

（ml）

样品中

补骨脂素量

（mg）

加入

补骨脂素量（mg）

测得量

回收率

平均

RSD

0.0990

0.2188

99.87

100.62

0.8

0.2213

101.89

0.2200

100.87

0.1320

0.2516

99.65

0.2525

100.39

0.2528

100.65

0.1650

0.2851

100.12

0.2854

100.33

0.2872

101.83

表4异补骨脂素加样回收率结果

异补骨脂素量

异补骨脂素量（mg）

0.0759

0.1040

0.1795

99.66

99.83

0.7

0.1807

100.81

0.1792

99.35

0.1012

0.2050

99.78

0.2053

100.11

0.2042

99.05

0.1265

0.2296

99.12

0.2302

99.73

0.2314

100.83

结果表明，本测定方法的回收率高，平均回收率补骨脂素为100.62%，RSD=0.8%<

2.0%,异补骨脂素为99.83%，RSD=0.7%<

2.0%，符合含量测定的要求。

6.精密度

6.1重复性：

取供试品（批号：

10121502）6份，依1项下方法检测，每次进样20μl，得补骨脂素与异补骨脂素的浓度（mg/ml）分别见表5：

表5重复性实验结果

补骨脂素

（mg/ml）

0.0351

0.0253

0.0340

0.0358

异补骨脂素

0.0264

0.0261

0.0265

0.0272

0.0271

计算得补骨脂素的平均值为0.0352g/ml，RSD=1.9%<

2.0%，异补骨脂素的平均值为0.0266mg/ml，RSD=1.7%<

2.0%。

结果表明该法重复性良好。

6.2中间精密度实验：

取同一批号样品（批号10121502），在两日内，由甲、乙、丙三名操作人员每天分别精密称取样品适量，按3项下供试品溶液的制备方法制备供试品溶液并测定含量。

测定结果经统计处理，结果见下表6。

表6中间精密度试验结果

操作时间

第一天

第二天

操作人员

甲

乙

丙

补骨脂素（mg/ml）

0.0375

0.0377

0.0384

0.0382

0.0385

0.0388

0.0378

0.0381

0.0389

0.0387

0.0391

异补骨脂素（mg/ml）

0.027

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