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1、整理8 超薄切片与半薄切片第8讲 半薄/超薄切片技术取材固定脱水渗透包埋聚合修块切片染色背景：肉眼光学显微镜透射电镜分辨率0.2mm0.2m0.2nm应用范围可观察头发丝、双面刀刀刃的厚度可观察细胞的结构(最大有效倍数:1000)可观察细胞内的结构,分辨DNA、蛋白质等生物大分子、单个金属原子（放大倍数可达百万倍）观察半薄切片观察超薄切片 现有的透射电镜生物制品制备技术分为两类：一类是透射电镜的基本制备技术，包括超薄切片和负染色法；另一类是生物制品特殊技术，包括冷冻蚀刻法、冰冻割断术、电镜细胞化学术、免疫电镜术、电镜放射自显影技术、X线微区分析技术等。 基本概念一、生物样品制备技术的重要性1、

2、决定电镜图像分辨率的两个因素1）电镜本身的分辨本领2）样品的结构和反差，而样品的结构与反差在很大程度取决于样品制备技术2、电镜样品应具备的基本条件1）样品必须彻底干燥；2）样品要进行提高反差处理2）样品要进行提高反差处理4）样品耐受电子束的轰击5）充分保存好生物样品的超微结构二、TEM样品制备技术分类1、超薄切片技术（普通）2、冷冻超薄切片技术3、冷冻置换和低温包埋技术 4、金属投影技术5、表面复型技术6、冷冻(断裂)蚀刻及复型技术7、免疫电镜技术8、电镜细胞化学技术 7、8、9是TEM，SEM共有9、电镜放射自显影技术三、超薄切片技术概述1、超薄切片样品厚度在10100nm之间的切片，超薄切

3、片TEM专用石蜡切片h=10m(550m)2、制作超薄切片的必要性1) 增加电子透射能力2) 电镜的场深大，切片太厚，上下结构重 叠,使得图像不清楚3) 减少色差4) 减少样品对电子的吸收3、对超薄切片的要求 细胞的细微结构保存良好，没有明显的物质凝聚、丢失、添加等人工效应 切片厚度500700为宜 ,小于1000 太薄：高，反差低太厚：低，反差好，结构重叠，电子甚至 不能穿透 切片应耐电子束的强烈照射，不变形，升华 切片能够适当被染色，保证一定的反差 切片均匀，无皱褶、刀痕，无染色剂或其他 化学物质的沉淀普通超薄切片技术：1、取材 二、固定 三、脱水 四、渗透与包埋 五、超薄切片 六、电子染

4、色 一、取材1、含义：指从生物体上取下要观察的组织块。注意：由于水解酶的作用可引起细胞自溶2、取材操作规则:快,小, 冷,准,稳,轻(防损伤) 快：动作迅速,快取,投入固定液 小：样品体积小,动1mm3,植宽1，长34mm 冷：04 准：取的部位准，有代表性、目的性 轻：操作轻巧，避免拉、锯、压A、按样品类别分为：动物材料麻醉解剖 戊二醛预固定（ 04， 25）在预冷的玻板上细切（1mm3） 戊二醛前固定(13h) 漂洗（1030min） 1锇酸后固定(12h)植物材料叶片宽1，长34，有时需脱蜡根茎果实1mm3单细胞：洗去有机成分固定预包埋切块B、按取材地点分为： 野外取材：冰壶实验室室内取

5、材1.2 取材方法 材料放在洁净的韧性较大的纸上滴上预冷的固定液用刀片将组织切下并修小用牙签或镊子将组织块移至盛有预冷的固定液的小瓶中。植物材料的取材可以先切成薄片，经适当固定后再切成小方块继续固定。 二、固定（一）固定的基本知识1、概念：用化学或物理方法迅速将细胞、组织杀死,同时把从细胞间的联系到细胞器的分子结构等全部组织的活体形态、精细结构及其组成真实的保存下来.2、常用的固定方法 化学方法：锇酸（OsO4), 戊二醛 （C5H8O2),甲醛(HCHO)，高锰酸钾KMnO4、 重铬酸钾、丙烯醛 物理方法：冷冻，干燥，高温3、固定的目的 把细胞中的动态系统定格，要求生命过程立即停止,细胞和它

6、周围组织中的半液体内含物立即凝固而不分解,接近细胞有机体的生活状态 防止以后的制备过程中丢失或添加成分 使其在电镜下有良好的电子反差4、固定的标准 细胞内膜结构线条清晰连续不断，细胞基质无明显溶泡和颗粒凝集5、固定液的作用：1）组成： 固定液：固定剂缓冲液2）作用： 破坏细胞的酶活性系统 稳定细胞物质成分，并保存之 接近细胞生活状态的渗透压,使细胞不收缩或膨胀 在组分的分子之间建立交联，提供骨架稳定细胞器的空间构型 提供一定的电子反差（二）常用的固定剂1、常用、理想固定剂应具备的条件1）渗透力强，穿透速度快，能迅速达到组织块的各部位，立即杀死细胞，以尽量减小死后变化2）稳定细胞成分和结构，使各

7、种结构成分凝固或变性，以保证后续的各种处理中物质不溶 解、不丢失3）使细胞不变形，保持各种结构生活时形状，不产生人工假象，以保证电镜图像的真实性。4) 能保存一定的酶活性,以供细胞化学的测定5) 最好提供一定的反差 ,并有防腐作用2、理想固定剂1）锇酸（OsO4)优点： 几乎和细胞内所有成分发生化学结合 对氮具有较强亲和力，对含有蛋白质的细胞结构固定作用良好 可保存脂肪,形成脂肪-锇复合物 Z=76，增加膜的反差 对磷脂蛋白、核蛋白保护很好锇酸缺点： 不能固定糖元、碳水化合物、核酸，对微管固定效果差 酶的钝化剂，不能用于细胞化学研究 分子量大,渗透能力差，要求组织块小 固定时间不宜过长 可与乙

8、醇、醛类氧化还原反应生成沉积 有挥发性、剧毒2）戊二醛（ C5H8O2）优点： 固定迅速，样品块可以大于1mm3 能保存糖元、蛋白质、核蛋白，核酸，尤其对微 管，内质网等固定效果最好，对细胞内结构有较 强的亲和力 可长时间固定（7天），适于野外取材 不易使酶失活，适于细胞化学研究 不挥发，但容易经皮肤吸收，对呼吸道粘膜有 刺激性缺点： 不保存脂肪 无电子染色作用 对缓冲液的要求严格双固定法：指用戊二醛对样品前固定，漂洗后使用锇酸对样品进行后固定，这种使用两种化学试剂分别前后对样品进行固定的方法称为双固定法。3) 甲醛（HCHO） ：甲醛戊二醛 滲透速度快、固定迅速，对酶活 性的保护优于 戊二醛

9、，经济方便4) 高锰酸钾（KMnO4) 磷脂蛋白，对神经髓脂质很好，细胞膜性结 构、叶绿素固定良好。(3)甲醛-Formaldehyde 优点：渗透组织的能力比戊二醛强，对于致密组织（种子）固定作用好；细胞精细结构保存质量不如戊二醛，但酶活性的保存优于戊二醛；缺点：不能较好的固定细胞基质，脱水后大部分细胞基质将丢失；常用多聚甲醛戊二醛的混合固定液。(4)高锰酸钾优点：强氧化剂，较好固定脂蛋白; 对神经髓鞘、叶绿体及其他各种膜结构的研究均可作为固定剂； 只用于某些常用固定剂难以固定的植物和酵母样品，且一般不需要用锇酸后固定.（3）缓冲液和附加剂1、缓冲液：一种仿效细胞外液成分，对细胞富有生理保护

10、功能的溶液2、缓冲液主要作用 维持稳定的pH值 提供适当的渗透压 提供适当的离子成分使样品不抽提，不沉淀3、附加剂： 调节渗透压，NaCL, CaCL2，蔗糖，葡萄糖4.常用缓冲液（1）磷酸盐缓冲液：储备A液(0.2M):磷酸氢二钠 (Na2HPO4.2H2O)35.61g加水定容1000ml储备B液(0.2M):磷酸二氢钠 (NaH2PO4.2H2O)27.6g加水定容1000ml0.1M磷酸缓冲液（PBS），由储备A液(0.2M)和储备B液(0.2M)按上表比例合成，然后稀释定容到100ml。 优点：对细胞无毒害，便宜，易于大量配置 缺点：易产生沉淀，不稳定，易受到细菌污染巴比妥盐 对锇酸

11、适用，戊二醛不能，不长期保存二钾胂酸盐 可长期保存，有毒，有臭味（4）、固定1、固定液的配制2、固定的方法：1）按固定液的成分划分为：单固定： 戊二醛或锇酸单次固定13小时双固定： 前固定（戊），漂洗，后固定（锇）多重固定： 用三种以上的固定剂对样品进行固定 2）按固定方式分为： a. 浸泡固定 b. 体外固定 c. 原位固定 d. 灌流固定 3、固定注意事项： 1) 固定液的浓度:戊二醛1-5%,锇酸1-3% 浓度低固定时间长细胞质的抽提,组织肿胀 浓度高易损细胞微结构,OsO4或KMnO4可使蛋白质分子氧化而断裂2) 固定液的渗透压： 渗透压低细胞器或整个细胞膨胀 渗透压高细胞收缩3) p

12、H值：植物6.87.1,动7.27.44) 固定的温度：04 但低温对细胞微丝、微管有害5) 组织块的大小：0.51mm36) 固定液的用量，一般为组织块的500倍三、漂洗、脱水3.1漂洗目的:组织固定后脱水前的漂洗: 清除残留固定剂,减小固定剂和脱水剂之间的反应，避免沉淀物干扰超微结构的观察.双重固定中,在锇酸固定前的漂洗: 避免锇酸与戊二醛反应生成细小而致密的饿沉淀，破坏细胞结构.3.2 脱水目的： 将组织内的游离水彻底清除,保证包埋介质完全渗入组织内部。方法： 用一种和水及包埋剂均能相混溶的液体来取代水,常用的脱水剂是乙醇和丙酮。三 脱水(dehydrate)1. 定义： 用适当的有机溶

13、剂取代组织和细胞中的 游离态水分的过程。2. 脱水的原因： 包埋时一般使用非水溶性包埋剂，为了更好的包埋样品，提高包埋质量必须对样品脱水； 湿样品反差低、必须干燥； 含水样品在高真空下容易被破坏。3. 脱水的原则：逐级梯度脱水(80%及以前4) 305070809095(每次5 15min)100(23次，每次15min)100环氧丙烷(乙醇脱水时必须的一步骤,15min) 4. 常用的脱水剂： 乙醇、丙酮、甲醇、乙二醇、聚乙二醇、环氧丙烷、包埋剂的单体。5. 脱水注意事项: 脱水要彻底 更换液体动作要迅速 脱水时间不宜过长 固定后的 样品要充分漂洗附加步骤：块染（Block Staining

14、)在脱水前或脱水时对组织块进行的染色叫块染。（在切成片之后的染色可称为“片染”）脱水前染色：双固定 漂洗 0.54%的醋酸双氧铀染色，1h,4脱水脱水时染色：脱水至70乙醇 硝酸铅的70乙醇饱和溶液中2h,4 70乙醇漂洗 继续脱水四、渗透与包埋 目的：使包埋剂逐步渗透到组织细胞内部,以便与 细胞外的包埋剂同时聚合，以保证切出优质 的超薄切片。 步骤：渗透，包埋，聚合（一）、渗透（Infiltrate) 渗透：用另一种溶液或混合液逐渐取代组织内的脱水剂（或前介质），使细胞内外所有的空隙 被渗透液填充。 脱水剂的比例包埋剂纯包埋剂 脱水剂:包埋剂3:1 1:1 1:3 纯包埋剂渗透时间表(小时）

15、脱水剂：包埋剂动物材料植物材料体外培养细胞3：1110.51：1141120.511：3122120.5二、包埋：将渗透好的样品块放入到适当的包埋模具中，灌装上纯包埋剂包埋，经加温聚合形成一种固体基质，牢固地支撑整个细胞结构或组织，同时又不混乱其空间联系，制成适于机械切割的固体包埋块。1、 包埋剂应具备的条件: 聚合有良好的切割性能，软硬度易调节 粘度低,易渗透 溶于脱水剂 电子透明度好,并具有一定的反差 聚合要充分、均匀，聚合温度要尽可能低 本身无结构 热稳定性好,可耐电子束轰击 来源丰富，且各批号性能尽可能一致 切片易染色,且对人体无害2、常用包埋剂1) 甲基丙烯酸酯 优点：分子量小，粘度

16、低,易渗透；,硬度易调节，切割性能好；电子透明度高，电子反差好；无毒性，便宜 缺点：聚合需要一定条件；聚合后体积变化大，聚合损伤大；不稳定，不耐电子束轰击易升华或蒸发2) 聚酯树脂 优点：对样品损伤小，耐电子束的轰击，聚合收缩小，适合于细菌和植物组织等硬样品， 缺点：不稳定，易脆裂3）水溶性包埋剂 常用试剂：乙二醇甲基丙烯酸酯（GMA），聚乙二醇(PEG),甲基丙烯酸羟酸酯（HPMA) 注意：GMA需低温包埋，聚合时GMA和HPMA需紫外照射 应用：适于电镜细胞化学和组织化学研究4) 环氧树脂类包埋剂： 特点：聚合收缩率低，均匀，对样品损伤小，耐轰击，但切片困难，染色后反差小，有刺激作用 常用

17、试剂：Epon-812 ,国产618，ERL4206 Epon-812：甘油多聚酯，低粘度，易渗透 加速剂：DMP-30（2，4，6三（二甲基氨 基甲基苯酚） 固化剂：DDSA（十二烷基琥珀酸酐），块软 MNA（六甲酸酐） ，块硬3. 常用配方： Epon-812配方（1961，Luft) A液： Epon812 5ml DDSA 8ml B液： Epon812 5ml MNA 7ml 最终： A液13， B液15， DMP-30 16滴（12%） 夏天：A：B=2：8（A多软） 冬天：A：B=1：9（B多硬）（2） 国产618配方: 618 12ml +DDSA 8ml +DBP(增塑剂，苯

18、二甲酸二酯丁）0.61.6ml +DMP-30 0.20.4ml (13滴）（3） ERL-4206:低粘度,易渗透4, 包埋方法:常规包埋、定向包埋: 浅槽包埋、二次包埋、加条包埋（三）、聚合 37（12h)45 (1248h) 60 (2448h)（四）、注意事项 1、一切器材均须烘干 2、配制包埋剂时，逐项加入试剂并搅拌 3、做好的包埋块置于干燥器中 4、配制包埋剂不宜长时间存放，室温下 也有一定程度聚合包埋操作中的注意事项所有试剂要防潮，最好存放在干燥器中；所用器皿应烘干；配包埋剂时，每加入一种试剂要搅拌均匀；包埋时动作要轻巧，防止产生气泡；盛放过包埋剂的容器要及时用丙酮清洗干净.皮肤

19、尽量不要接触包埋剂，以免引起皮炎；5 超薄切片修快削去表面的包埋剂，露出组织，然后在组织的四周以和水平面成45度的角度削去包埋剂，修成金字塔形，顶面修成梯形或长方形，每边的长度为0.2mm0.3mm。五 超薄切片（一）、载网和支持膜A. 载网: 1、作用： 承载样品,以便后续染色和观察 2、分类 从材料:铜,镍,钼,金,银,铂,不锈钢,尼龙，碳 形状上分:圆型,蜂窝,正方形,长方形单孔型,狭逢型 大小:d=23mm,h=0.1mm 目：一英寸的线段上具有的孔的数目 常用180230目（让70电子束通过）3、载网的特点 大孔径(目数少)：电子透过率高，支持性差，在低倍、分辨率低、大视野场合下使用

20、 小孔径(目数多)：反之4、载网的清洗： 目的：清洁，除去静电 新网：丙酮或乙醇浸洗，双水洗 旧网：溶膜酸碱,超声,离子蚀刻直径：2-3mm，厚度：0.03-0.02mm B. 支持膜的制备 1、特点: 本身无结构 电子透明度高 机械强度高,耐电子束的轰击,稳定性好 不与样品发生反应 厚度适中,150 2、常用支持膜 福尔莫瓦膜（Formvar):聚乙烯醇缩甲醛，0.2%0.5%氯仿溶液，机械强度高，制作简易 火棉胶膜：强度低，制作简易，12醋酸异戊酯溶液 帕罗丁膜：30醋酸戊酯溶液，强度稍高于火棉胶膜 碳膜：机械轻度高，化学稳定好。适于高分辨率样品，需专用仪器：真空喷镀仪 复合膜：有机膜碳膜

21、（50100） 微孔支持膜(微筛)：高分辨率用哈气法、甘油法、气压法（二）、制刀1、刀的种类：玻璃刀，钻石刀2、玻璃刀的制作: 玻璃要求:硬,含硅高（7275%),h=48mm，宽25mm、38mm，长30cm 步骤：洗涤玻璃条，并晾干制成小方块，对角折断检查刀刃 检查的标准： 中左端平直无缺损 右端稍上翘 显微镜下刀刃有明亮的应力线 制刀的手段 手工制刀， 专用制刀机制刀（LKB7800)（三） 装水槽1. 方法: 装塑料模具水槽 自制胶带水槽2. 槽液的要求 不与材料发生化学反应 干净无杂质 液面与刀口基本平行 低粘度,蒸发量小 有一定的表面张力,有利于漂浮切片 3.常用的槽液： 双蒸水、

22、二甲基亚砜（DMSO）、甘油水溶液等（四）修块1.目的 除去组织周围多余的包埋介质和 不感 兴趣的部分，以提供较大的有效观察面积 含组织块的区域和不含组织块的区域硬度 不同，经过修块，尽可能除去组织块外的 空白包埋介质，使要切的部分硬度一致， 切出高质量的切片 修成一定形状、大小的包埋块截面，便于 连续切片2. 修块的方法 手工修块： 粗修：四棱台型 细修：小四棱台塔型或二层四棱台型 （Mesa型），顶面积0.1mm2， 四个侧面要整齐、规则 机械修块： （专用修块机或超薄切片机），先修顶面暴露样品，后修四个侧面（五）、切片1、超薄切片机 (Ultramicrotome) 按进刀原理分为： 机

23、械推进式：AO型 热膨胀式：I膨胀切片厚 LKB(，），CQR1 冷缩式 LKB切片机构造 切片的原理 加热线圈金属臂膨胀推进样品 电动机驱动样品臂上下运动切削2、切片操作步骤： 装块装刀对刀加水切片捞片3、切片原则： 1）刀角、前角，切速参数的选择原则： 软硬适中的包埋块，45刀角，35前角， 25mm/s 包埋块硬,小刀角,切速小； 包埋块软,大刀角,切速大 较薄样品,切速大20mm/s 要获得较大面积的切片，切速1mm/s2) 预先制作半薄切片的原则: 半薄切片的定义： 切片的厚度介于普通切片和超薄切片 之间的切片,0.52m 半薄切片的作用： 精确定位样品特征位置点， 并筛选包埋块4、

24、切片厚度的判断颜色厚度()切片厚度分辨率反差暗灰色400太薄高小铅灰色400500较薄高小银灰或银白500700适中好好米黄、金黄7001000较厚低好紫色(蓝)1000以上 不能用5、展片、捞片6、超切注意事项 切片是否成功，对刀是关键 槽液用新鲜的重蒸水 切片时的温度2025，相对湿度60%， 室内无空气流动，清洁，防止震动 不损坏封固刀槽的石蜡,否则漏水7、切片缺陷产生的原因及排除方法六、电子染色1. 电子染色(Electron Staining) 1) 概念: 利用高密度的重金属染色剂（铅、铀）与细胞某些微细结构或成分结合，以增加样品局部的电子散射能力，提高电镜图像反差的方法。 2)

25、原理： 结合重金属多的区域，t大电子散射 能力强电子密度大图像深暗 反之.2、常用染色剂(Pb,U盐） 1)铀盐：醋酸铀（醋酸双氧铀）UO2(CH2COO)22H2O 特点: A.可以和细胞中大多数成分结合，可以提高核 酸、蛋白质和结缔组织的反差，对膜的染色差 B.有放射性，发射荧光，有毒，见光分解2)铅盐：柠檬酸铅（枸橼酸铅） 特点： A、密度大，对细胞各种结构都有亲和力， 尤其提高细胞膜系统和脂类物质的反差， 对核糖体、糖元等着色。常用 B、铅盐毒性大（防止皮肤吸收引起铅中 毒），易与CO2产生沉淀3)高锰酸钾(KMnO4): 对膜染色好，与铀盐配合使用，当MNA做硬化剂 的环氧树脂包埋剂

26、制作超切时发生化学反应。 方法：1的KMnO4室温下染色10min（二）环境保护法律法规体系3）规划实施的经济效益、社会效益与环境效益之间以及当前利益与长远利益之间的关系。3、染色的方法: A.单染: 铅盐单染,铀盐单染4.将环境影响价值纳入项目的经济分析 铅盐比铀盐好,注意CO2的干扰（2）可能造成轻度环境影响的建设项目，编制环境影响报告表，对产生的环境影响进行分析或者专项评价； B.双染色:除了房地产市场外，在不同职业和地点的工资差别中也可以发现类似的情形。 醋酸双氧铀前染2030min3.建设项目环境影响评价文件的审查要求 漂洗掉多余染液 柠檬酸铅后染，15min半薄切片技术介绍（6）列

27、出选定的评价方法，并作简单介绍。半薄切片进行光学显微镜观察的目的：可以根据半薄切片精确定位。了解样品包埋质量，以确定是否继续做超薄切片；（5）建设项目对环境影响的经济损益分析。与石蜡切片、超薄切片进行对比研究环境影响评价工程师课主持进行下列工作：半薄切片的优点：3.划分评价单元克服了超薄切片盲目性和电镜视野的局限性清晰度、分辨率远优于石蜡切片，视野也大于超薄切片，有利于获得高质量的光镜图像也是电镜超薄切片技术中一种有效定位方法。电镜超薄技术中如何应用呢？电镜是观察组织细胞超微结构的一种手段。但由于切片太小，有时难于观察到目标结构，为此需大量制备样品，造成工作量大且消耗多。为使超薄切片能精确地切

28、到目标部位，在做超薄切片前要做半薄切片来进行定位。应用：胚胎学，病理学，动植物细胞学研究中一种普遍的切片方式半薄切片主要步骤取材固定漂洗、脱水渗透、包埋半薄切片半薄切片染色FAA固定液制备：福尔马林5-冰醋酸5-70%酒精90应用：半薄/石蜡切片适用：一般固定根、茎、叶、花药、子房组 织切片。补充说明： 幼嫩材料用50%酒精代替70%酒精，防止材料收缩；加入5%甘油可防固定液蒸发和材料变硬。卡诺固定液12纯酒精15ml30ml氯仿5ml 冰醋酸5ml1ml渗透迅速，固定根尖和花药只需30-60分钟，但固定时间不能太久，一般不超过一天Leica RM2265旋转薄切片机制作半薄切片（厚度0.25-5m）使用步骤： 1.接通电源，打开主开关 2.选择切片厚度 3.安放包埋块于切片头中央位置，旋转固定螺丝，将样品