catenin信号通路持续激活介导肿瘤放疗抵抗性机制研究Word文档下载推荐.docx

1、A领域A、 基础医学 B、临床医学 C、预防医学与卫生学D、药学 E、中西医结合 F、其他申报学科医学细胞生物学是否偿还否代码310.17偿还期限申请金额10万元起止年月2013 年 6月至2015 年 6月申请者姓名性别出生年月 1 年 月民族汉年参加研究月数专业技术职务研究实习员学历A、博士 B、硕士C、大学 D、大专E、其他B留学国别无留学时间月留学学位所在单位性质A、高等院校 B、科研单位C、医院 D、卫生防疫站C邮政编码310002联系电话地址项目组总人数高级中级初级辅助人员博士后博士生硕士生参加单位2主要成员不含性别专业技术职务工作单位参加年月数项目中的分工研究内容和预期果摘食管癌

2、为我国常见恶性肿瘤，每年新诊断25万新发病例，占全世界12，死亡率17.38/10万，占全部恶性肿瘤死亡的16.05，居第四位。放疗作为其主要治疗手段，但由于获得性放疗抵抗性的存在，常导致局部治疗失败。本课题组通过梯度剂量法照射及单克隆筛选法成功建立了人食管鳞癌放疗抵抗细胞株KYSE-150R。与母株KYSE-150相比，KYSE-150R细胞株获得了明显的放疗抵抗性。通过采用人类全基因组芯片检测技术（microarray），我们发现与母株KYSE-150相比，在KYSE-150R抵抗株中，升高前十位的基因多位于Wnt/-catenin信号通路，如wnt配体wnt1、wnt受体Fzd1-4及该

3、通路中心调控因子-catenin等。此外，通过反转录聚合酶链式反应 （RT-PCR）及免疫印迹实验，我们进一步证实了Wnt/-catenin通路在KYSE-150R细胞株中持续激活。采用wnt通路抑制剂IWP-2阻断wnt通路，可有效地逆转KYSE-150R细胞株的放疗抵抗性，提示Wnt/-catenin通路持续激活介导了食管癌放疗抵抗性的形成。本研究课题拟在上述工作的基础上，通过采用多个食管癌细胞株，如KSYE-30、KYSE-180及KYSE-510，以及在裸鼠体内建立移植瘤模型进一步在体内外水平系统地验证Wnt/-catenin信号通路介导了食管癌放疗抵抗性的形成，同时，通过研究wnt通

4、路对细胞周期分布的影响，以及对细胞内抗凋亡因子如Bcl-xl、Bcl-2、survivin及细胞内促凋亡因子如细胞色素C、P53及Bax等表达的影响揭示Wnt/-catenin信号通路介导食管癌放疗抵抗性形成的分子机制。上述研究成果有望为临床上逆转食管癌的放疗抵抗作用，改善食管癌患者的临床治疗效果奠定重要的基础。主题词1、主题词限填二个；2、主题词之间空一格；3、按医学主题词表MESH填写食管癌 放疗抵抗性二、立题依据（包括国内外研究现状分析、当前需要解决的主要问题等）食管癌是我国常见的恶性肿瘤，每年新诊断25万新发病例，占全世界12，死亡率17.38/10万，占全部恶性肿瘤死亡的16.05，

5、居第四位。食管癌临床确诊时约70%-80%的患者已丧失手术机会，放疗成为局部晚期食管癌的主要治疗手段。单一放疗的疗效有限，2年存活率仅10%左右。目前标准的同步放化疗的5年生存率在20%左右，50%以上的病例治疗后出现局部复发1,2。如何提高食管癌治疗效果是临床需要解决的棘手问题。研究发现治疗过程中肿瘤获得性放射抵抗是阻碍食管癌放疗效果进一步提高的重要因素。因此，深入研究肿瘤获得性放射抵抗的形成机制，寻找临床可干预的新靶点，设计相应的治疗策略加以逆转，是能否进一步提高食管癌治疗效果的关键。研究表明肿瘤的放射敏感性主要与放射诱导的基因表达和基因调控有关3。放射线对肿瘤杀伤作用的机理主要是引起细胞

6、DNA损伤和与凋亡有关的基因和蛋白的改变，从而启动肿瘤细胞的凋亡过程。不同肿瘤个体由于基因的放射敏感性/放射抗拒性不同决定了不同组织类型间、同一组织学类型不同分化级别间甚至同一分化级别间的肿瘤细胞存在放射敏感性的差异，直接影响着患者的放疗效果，表明肿瘤放疗抵抗性的产生机制具有明显的复杂性及异质性。Wnt/-catenin通路作为肿瘤细胞内三大经典信号通路之一，因与肿瘤细胞的生长增殖、转移分化及存活凋亡等存在密切的关系，进而影响到肿瘤的发生、发展及预后等，一直以来成为众多研究者关注的热点4。通常情况下，该通路在肿瘤细胞内处于非激活状态，表现为其中心调控因子-catenin被包括APC、Axin及

7、GSK3的多蛋白降解复合物捕获，使其发生磷酸化及后续的降解。而当癌细胞在放射线、药物或其他外界因子刺激下，Wnt/-catenin通路可被诱导激活5-8。此时，-catenin从其降解复合物中脱离出来，磷酸化水平明显降低，稳定积累于细胞质中，进而发生核转移，启动其下游靶基因如WISP1, Cyclin D1，VEGF等转录活化，如图1所示。有研究表明食管鳞癌患者的癌标本与其正常的食管组织相比，可观察到细胞质内-catenin的表达水平明显升高，且可观察到明显的-catenin核转移现象10，然而，该研究并未对Wnt/-catenin通路的其他成员，如wnt配体、wnt受体及wnt通路下游基因等

8、的状态进行研究。此外，迄今为止，尚未有研究指出Wnt/-catenin通路通过哪些分子机制决定了肿瘤细胞的治疗敏感性。图1. Wnt/-catenin信号通路示意图9课题组前期通过梯度剂量法照射及单克隆筛选法已成功建立了人食管鳞癌放疗抵抗细胞株KYSE-150R.，其D0、Dq与其母株KYSE-150相比有显著提高，提示KYSE-150R细胞株获得了明显的放疗抵抗性，且其放疗抵抗性经实验证明具有稳定的遗传能力11。该抵抗株为研究食管癌放疗抵抗机理提供了重要的实验模型，得到了国内外众多研究机构的关注，如德国慕尼黑大学病理系FRANK教授曾写信希望我们能够提供其KYSE-150R细胞株进行相关研究

9、。而我们前期的研究发现采用EGFR特异性抗体西妥昔单抗可在一定程度上逆转KYSE-150R细胞株的放疗抵抗性11。此外，通过利用我们赠送的KSYE-150R细胞株，其他研究人员发现下调Bmi-1表达同样可以缓解KYSE-150R细胞株的放疗抵抗性12。尽管上述研究成果均在一定程度上揭示了食管鳞癌放疗抵抗的分子机制，但是均存在研究只限于一对细胞株（KYSE-150 vs KYSE-150R）的缺陷，缺少多个食管鳞癌细胞株的同时验证，而且，上述研究只是在细胞水平进行，缺少建立动物模型等体内水平的系统验证。本课题组通过采用人类全基因组芯片检测技术全面深入地比较了KYSE-150R细胞株与其母株KYS

10、E-150分子背景的差异，发现在KYSE-150R抵抗株中，升高前十位的基因并非EGFR信号通路或Bmi-1，而是Wnt/-catenin信号通路，如wnt配体wnt1、wnt受体Fzd1-4及该通路中心调控因子-catenin等，提示Wnt/-catenin信号通路与食管鳞癌放疗抵抗性的形成可能存在密切的关系。通过进一步的研究我们证实了Wnt/-catenin信号通路在KYSE-150R细胞株中持续激活。采用wnt通路抑制剂IWP-2阻断wnt通路，可显著地逆转KYSE-150R抵抗株的放疗抵抗性。上述研究成果提示Wnt/-catenin信号通路的持续激活介导了食管癌放疗抵抗性的形成。本研究

11、拟在上述工作的基础上通过采用多个食管鳞癌细胞株及在裸鼠体内建立移植瘤模型在体内外水平系统地验证Wnt/-catenin信号通路与食管鳞癌放疗抵抗性形成的相关性，同时，通过检测Wnt/-catenin信号通路对细胞周期分布的影响以及对细胞内抗凋亡因子如Bcl-xl、Bcl-2、survivin及细胞内促凋亡因子如细胞色素C、P53及Bax等表达的影响，深入地揭示Wnt/-catenin信号通路介导食管鳞癌放疗抵抗性形成的分子机制。上述研究成果将为阐明食管癌放疗抵抗的分子机制，提高食管癌的临床治疗效果提供重要的参考依据及指导意义。参考文献1. Cooper JS, Guo MD, Herskovi

12、c A, Macdonald JS, Martenson JA Jr, Al-Sarraf M, Byhardt R, Russell AH, Beitler JJ, Spencer S, Asbell SO, Graham MV, Leichman LL. Chemoradiotherapy of locally advanced esophageal cancer: long-term follow-up of a prospective randomized trial （ RTOG 85-01 ）. JAMA. 1999; 281（17）: 1623-1627.2. 张萍, 谢聪颖,

13、吴式琇. 紫杉醇联合铂类与放疗同步治疗局部晚期食管癌的临床研究. 中华肿瘤杂志. 2007; 29（10）: 773-777.3. De Bacco F, Luraghi P, Medico E, Reato G, Girolami F, Perera T, Gabriele P, Comoglio PM, Boccaccio C. Induction of MET by ionizing radiation and its role in radioresistance and invasive growth of cancer. J Natl Cancer Inst. 2011; 103（

14、8）: 645-661. 4. Clevers H. Wnt/beta-catenin signaling in development and disease. Cell. 2006;127:469-80.5. Kim Y, Kim KH, Lee J, Lee YA, Kim M, Lee SJ, et al. Wnt activation is implicated in glioblastoma radioresistance. Lab Invest. 2012;92:466-73.6. Chen MS, Woodward WA, Behbod F, Peddibhotla S, Al

15、faro MP, Buchholz TA, et al. Wnt/beta-catenin mediates radiation resistance of Sca1（+） progenitors in an immortalized mammary gland cell line. J Cell Sci. 2007;120:468-77.7. Chang HW, Roh JL, Jeong EJ, Lee SW, Kim SW, Choi SH, et al. Wnt signaling controls radiosensitivity via cyclooxygenase-2-media

16、ted Ku expression in head and neck cancer. Int J Cancer. 2008;122:100-7.8. Cui J, Jiang W, Wang S, Wang L, Xie K. Role ofWnt/-cateninsignalingin drug resistance of pancreatic cancer. Curr Pharm Des. 2012; 18（17）: 2464-71.9. Sethi JK, Vidal-Puij A. Wnt signalling and the control of cellular metabolis

17、m. Biochem J. 2010; 427（1）: 1-17.10. Ninomiya I, Endo Y, Fushida S, Sasagawa T, Miyashita T, Fujimura T, et al. Alteration of beta-catenin expression in esophageal squamous-cell carcinoma. Int J Cancer. 2000;85:757-61.11. Jing Z, Gong L, Xie CY, Zhang L, Su HF, Deng X, Wu SX. Reverse resistance to r

18、adiation in KYSE-150R esophageal carcinoma cell after epidermal growth factor receptor signal pathway inhibition by cetuximab. Radiother Oncol. 2009; 93（3）: 468-473.12. Wang G, Liu L, Sharma S, Liu H, Yang W, Sun X, Dong Q. Bmi-1 confers adaptive radioresistance toKYSE-150Resophageal carcinoma cells

19、. Biochem Biophys Res Commun. 2012; 425（2）: 309-14三、研究内容（研究目标、研究内容和拟解决的问题）研究目标1. 通过采用多个食管鳞癌细胞株如KSYSE-30、KSYE-180及KYSE-510验证Wnt/-catenin信号通路介导了食管癌放疗抵抗性的形成2. 通过在裸鼠体内建立移植瘤模型验证Wnt/-catenin信号通路在体内介导了食管癌放疗抵抗性的形成3. 揭示Wnt/-catenin信号通路介导食管癌放疗抵抗性形成的分子机制研究内容1 采用多个食管鳞癌细胞株如KSYSE-30、KSYE-180及KYSE-510验证Wnt/-cateni

20、n信号通路与食管癌放疗抵抗性形成的相关性：通过采用wnt通路活化剂SB-216763激活上述食管鳞癌细胞株的Wnt/-catenin信号通路，通过反转录聚合酶链式反应 （RT-PCR）及免疫印迹实验（western blot）检测上述细胞经过SB-216763处理后-catenin、p-catenin在mRNA水平和蛋白水平的表达情况，通过激光共聚焦显微镜观察食管癌细胞株经SB-216763激活剂处理后-catenin细胞内分布的变化，并通过流式细胞仪检测及克隆形成实验分析细胞株在wnt通路激活前后放疗抵抗性的变化。2 建立移植瘤模型验证Wnt/-catenin信号通路与食管癌放疗抵抗性形成的

21、相关性：通过在裸鼠体内建立KYSE-150及KYSE-150R移植瘤模型，比较不同治疗模式下，如wnt通路激活前后或wnt通路阻断前后移植瘤放疗敏感性的变化。如通过绘制肿瘤生长曲线比较在不同治疗模式下移植瘤生长的快慢，以及在实验结束时脱臼处死荷瘤鼠后，剥离移植瘤称重，比较不同组别之间移植瘤的肿瘤并进行统计学分析。同时，将剥离的移植瘤固定于4%的多聚甲醛中，并通过免疫组化实验分析不同组移植瘤细胞的生长情况。3 分析Wnt/-catenin信号通路介导食管癌放疗抵抗性形成的分子机制：通过流式细胞仪检测KSYSE-30、KSYE-180及KYSE-510食管鳞癌细胞株经IWP-2处理前后，各细胞周期

22、比例的变化，如G0/G1期，S期，G2/M期。此外，通过免疫印迹实验（western blot）检测上述细胞株wnt通路激活前后各抗凋亡因子，如Bcl-xl、Bcl-2、survivin等表达的变化以及各促凋亡因子，如细胞色素C、P53及Bax等表达的变化，以从分子水平揭示Wnt/-catenin信号通路介导食管癌放疗抵抗性形成的分子机制。拟解决的问题本研究在前期工作的基础上拟通过采用多个食管鳞癌细胞株如KSYE-30 KSYE-180及KYSE-510进一步验证Wnt/-catenin信号通路与食管癌放疗抵抗性形成的相关性，并且通过在裸鼠体内建立移植瘤模型从体内水平系统地验证Wnt/-cat

23、enin信号通路与食管癌放疗抵抗性形成的体内外相关性。此外，通过对食管癌细胞株wnt通路激活前后各细胞周期比例的变化以及检测细胞内关键的抗凋亡因子，如Bcl-xl、Bcl-2、survivin等及促凋亡因子，如细胞色素C、P53及Bax等在食管癌细胞株wnt通路激活前后表达的差异来深入地揭示wnt通路介导食管癌放疗抵抗性形成的分子机制。四、研究方法和技术路线（采用的研究方法和技术路线及可行性分析）研究方法1、通过反转录聚合酶链式反应 （RT-PCR）和免疫印迹实验 （western blotting）检测食管癌细胞株经wnt通路活化剂SB-216763处理0h、2h、6h、12h、24h后，-

24、catenin在细胞内的mRNA和蛋白表达量，并通过激光共聚焦显微镜观察-catenin在上述时间点细胞内分布的变化，采用DAPI标记细胞核。2、通过流式细胞仪 Annexin V/PI双染色法检测食管癌细胞株在wnt通路激活前后放疗敏感性的变化。细胞直接照光或在照光前一天用wnt通路激活剂SB-216763处理，照光后三天，胰酶消化收集所有贴壁和悬浮的细胞，用4 oC预冷的PBS溶液洗涤细胞两次，加入荧光染液，室温孵育30min后上机检测。3. 通过克隆形成实验检测食管癌细胞株wnt通路激活前后放疗敏感性的变化。将培养在普通培养基中或培养在添加有wnt通路活化剂SB-216763培养基中的食

25、管癌细胞株接种至六孔板中，孵育24h后，上述细胞接受不同剂量 （0Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy）的放疗处理后，在培养箱中继续培养2周。待细胞形成肉眼可见的克隆后，用甲苯胺蓝溶液染色，将细胞数大于或等于50的细胞群体记为一个克隆子，并通过以下公式计算细胞存活率：细胞存活率=实验组克隆数/（对照组克隆数*细胞比例），其中对照组为未放疗的细胞组，实验组为放疗的细胞组，细胞比例为实验组细胞接种数与对照组细胞接种数的比值。4. 建立移植瘤模型验证wnt通路与食管癌放疗抵抗性形成的相关性。将体外处于对数生长期的KYSE-150或KYSE-150R细胞株经胰酶消化后，用4 oC预冷的PBS溶

26、液洗涤两次，通过皮下注射的方式接种至裸鼠体内。待移植瘤长至直径约为0.5cm时，将荷瘤鼠随机分为实验组和对照组，每组6只小鼠。对于KYSE-150移植瘤模型，共分为四组，每组小鼠分别注射PBS溶液、溶解于PBS溶液的SB-216763、放疗组、放疗组+ SB-216763，对于KYSE-150R移植瘤模型，同样分为四组，每组小鼠分别注射PBS溶液、溶解于PBS溶液的XAV939 （水溶性的wnt通路抑制剂）、放疗组、放疗组+ XAV939。实验期间，每隔两天测量一次肿瘤最长径及最短径，并根据以下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积（mm3）=肿瘤最长径*肿瘤最短径2/2，并以治疗天数为横坐标，对应的肿瘤

27、体积为纵坐标绘制肿瘤生长曲线。实验结束时，将上述荷瘤鼠脱臼处死，剥离移植瘤并称重，并对不同组的移植瘤行免疫组化分析，比较不同组肿瘤细胞的凋亡情况。5. 通过流式细胞仪检测wnt通路激活前后食管癌细胞株细胞周期分布的变化。将待检测的细胞经胰酶消化收集后，用4 oC预冷的PBS溶液洗涤细胞两次，加入-20oC预冷的70%无水乙醇并放置在-20oC冰箱固定6小时以上。上机前，将固定好的细胞用PBS溶液洗涤两次后，加入PI染液，室温放置30min后上机检测。技术路线可行性分析1. 课题组前期应用梯度剂量法照射及单克隆筛选法建立了人食管鳞癌放射抵抗细胞株KYSE-150R，其D0、Dq与其母株KYSE-

28、150相比有显著提高，提示KYSE-150R细胞获得了明显的放射抵抗性，且其放射抵抗性具有一定的稳定遗传能力，为研究食管癌放射抵抗机理提供了重要的实验模型。此外，由于母株与诱导产生的放射抵抗株间有着相同的遗传背景，对于研究获得性放射抵抗产生机制具有独特的优势。2. 因子的SCI论文，如“Radiotherapy and Oncology”，“International journal of radiation oncology biology physics”, “Mitochondrion”等，吴式琇教授在本课题中负责研究思路的拟定及研究结果的分析，保证了研究项目的顺利、高效开展。3. 五、

29、预期结果（科学价值、社会效益、经济效益分析）本研究拟在体内外水平系统地验证Wnt/-catenin信号通路与食管癌放疗抵抗性形成的相关性，并深入地揭示Wnt/-catenin信号通路介导食管癌放疗抵抗性形成的分子机制，该研究成果将在国内外专业期刊以学术论文（13篇）的形式发表，并参加国内外专业学术论文交流，扩大研究结果的影响面，创造更多的社会效应和经济效益。此外，通过本课题的研究，培养硕士研究生1-2名。最为重要的是，上述研究成果将为临床上寻找逆转食管癌放疗抵抗性的分子靶点，改善食管癌患者的临床治疗效果奠定重要的基础。六、基础条件已做的工作基础1、 通过人类全基因组芯片检测技术 （microarray）及反转录聚合酶链式反应 （RT-PCR），我们发现与母株KYSE-150相比，在KSYE-150R抵抗株中，Wnt/-catenin信号通路的主要成员，如wnt配体wnt1、wnt受体Fzd1-4及该通路的中心调控因子-catenin的基因及mRNA水平均明显升高，如图2所示。图2. KYSE-150R细胞株与其母株KYSE-150相比，Wnt/