流式细胞仪检测细胞周期操作步骤.docx

1、流式细胞仪检测细胞周期操作步骤流式细胞仪检测细胞周期操作步骤取对数生长期得A54细胞,按1106cels/ mL以1mL接种于10mm培养皿内24后，进行所需得处理（比如加药，照射)特定时间后终止培养,进行下一步得实验收集原培养液，洗后得PBS与消化后得细胞,将三者混匀放入15m离心管中00rpm离心min(短时低速离心）弃上清,用1、5l预冷BS，10r离心5min后去除与细胞悬液内得细胞碎片加入1、5预冷S,在涡旋状态下加入3、ml无水乙醇,混匀后，于4固定30min，或2长期保存。100/min，离心min将乙醇吸除，加PBS清洗混匀10r/mn，5in再离心一遍,将残留在细胞上得乙醇除

2、去吸除离心管内S,加入200ul PBS与ul得RNA酶(0、mg/m）(37下孵育3in)加入0、5ml得5ug/m得I溶液室温下避光染色3n 将离心管内得细胞过滤（0u尼龙网膜)至含有得E管中(I具有很强得粘附性，容易使细胞聚团)，标记管提前一天网上预约开机(先开仪器后开软件)流式细胞仪得结构一般分为5部分:流动室及液流驱动系统; 激光光源及光束成形系统; 光学系统; 信号检测、存贮、显示、分析系统; 细胞分选系统检测前先涡旋使细胞混匀悬浮呈单个细胞,然后插入流式细胞仪上流动室内充满鞘液，细胞排成单列由喷嘴中心喷出,形成细胞液柱液柱与激光束相交，细胞上得荧光染料被激发产生荧光(488nm激

3、发光源）荧光信号变成电信号输出到计算机,软件分析(荧光染料与细胞DN分子特异性结合,可以检测出细胞周期各时相细胞比例）在用第三方软件分析之前,将流式结果按如下所示导出结果分析-Mfit软件分析Flowjo软件分析FCM-量分析 1 个细胞增殖群时，可将DNA 含量分布组方图分为三部分,即 G/1、G2。G01与GM 细胞峰得 DA分布均为正态分布,S 期可以认为就是一个加宽得正态分布检测结果刻录光盘保存关机（先关软件后关仪器，关机前需清洗)正常细胞DNA含量:n4n凋亡细胞：核内DNA断裂,乙醇固定后膜通透性增加，小片段NA穿膜丢失,胞内DNA含量减少P染色后,荧光强度减小而形成一个DN含量小

4、于2n得分布区（亚G1峰)。1、纵坐标ell Nuber：即计数得有效细胞数; 2、横坐标NAContnt:即DN含量; 、1、G2、S三期在图中已经标示；、右侧数字含义:Dip 153、84% at 55、56,即G1期DA含量平均值为55、6;5、84即G期细胞数占总数得3、84；Di G-5、64% t17、7,即G2期DN含量平均值为107、72,5、64%即G2期细胞数占总数得5、4%;AnnexinV-EGF/PI双染法检测细胞凋亡基本原理：磷脂酰丝氨酸(PS)能与连接素（xin）发生特异结合；I就是核酸荧光染料，不能透过正常细胞膜，只能进入已经破损得细胞膜,在嵌入双链DNA后释放

5、红色荧光,荧光强度与PI结合量呈良好得线性关系。正常细胞：膜完整，PS不外翻-PI-/Anexin凋亡早期:膜完整,PS翻转PI-/Annxin+凋亡晚期:PS外翻,膜通透性增加-PI/Annein+坏死细胞:膜严重破损,PS不外翻-PI+/Annex+ 几乎不存在膜结构PI+/Annexin-实验步骤:取对数生长期得细胞,按106 celsmL以mL接种于培养皿内24h后,进行所需得处理（比如加入药物)特定时间后终止培养,进行下一步得实验细胞用0、5胰酶37消化5in（胰酶消化时间不易过长，以防引起假阳性)加入BS制成细胞悬液（移液枪吹打8次）倒置显微镜下观察细胞状态（单个分离悬浮)将细胞悬

6、液移入15ml离心管中0rp离心5in,PBS吸除用PBS 清洗细胞次(000rpm,离心5mn收集细胞）用400ul 1indBffer 悬浮细胞(浓度大约为1106cells/ml）在细胞悬液中加入ul Annexn VP,轻轻混匀后于28避光条件下孵育15min加入1ul I 后轻轻混匀，于2避光条件下孵育5n在 内用流式细胞仪检测 流式细胞仪激发光波长采用Ex、= 8nm双波长激发，、= 5检测E荧光（F1 chnnl）与575 nm得发射波长检测PI细胞应可分成三个亚群：活细胞仅有很低得荧光强度,凋亡细胞有较强得绿色荧光，坏死细胞(包括极晚期凋亡细胞）有绿色与红色荧光双重染色.在流式细胞术双参数散点图上左下象限显示活细胞，为(Anein V-/PI）;右上象限就是非活细胞,即坏死细胞,为Anexin /P+;而右下象限为凋亡细胞,显现Annex V +PI-。