《水质克百威草甘膦的测定液相色谱质谱法》.docx

1、水质克百威草甘膦的测定液相色谱质谱法水质 克百威 草甘膦的测定 液相色谱-质谱法（征求意见稿）编制说明水质 克百威 草甘膦的测定 液相色谱-质谱法标准编制组2019年9月26日项目名称：水质 克百威 草甘膦的测定 液相色谱-质谱法项目统一编号：XDBXM 28-2018项目承担单位：西安市水环境监测中心 陕西省阔成检测服务有限公司编制组主要成员：水质 克百威 草甘膦的测定 液相色谱-质谱法（征求意见稿）编制说明1 项目背景1.1 任务来源2018年12月，西安市质量技术监督局下发关于下达2018年第四批西安市地方标准制定项目计划的通知（市质监发2018192号），市质监局下达了水质 克百威 草

2、甘膦的测定 液相色谱-质谱法标准制修定任务，项目统一编号为XDBXM 28-2018，项目承担单位：西安市水环境监测中心、陕西省阔成检测服务有限公司。1.2 工作过程1.2.1 成立标准编制组西安市水环境监测中心接到此项标准制修订任务后，立即成立由我中心质量控制室、技术组及相关起草单位专家组成的标准编制组，承担此项标准的研究制定工作。1.2.2 查询国内外相关标准和文献资料根据西安市地方标准管理办法陕西省地方标准制修订程序要求，编制组开展了前期调研工作，查阅收集国内外有关水中克百威、草甘膦测定的标准方法及文献资料，了解了国内外相关分析方法的研究开展情况、相关质量标准，包括相关标准及控制要求，并

3、在文献资料调研的基础上确定了本标准制定拟采用的原则、方法和技术依据，确定了本标准使用范围，即：地下水，标准适用于我国大部分监测实验室和相关实验室的仪器设备、技术能力的要求。1.2.3 确定标准制修订原则和技术路线编制组先后3次开展集中式会议讨论，分别就资料查询和修订需求分析、修订内容的可行性、探索性实验方案和结果、标准修订方案等内容进行讨论。初步确定了以高中低浓度的检出限、精密度、准确度、基质验证等内容为主的制定内容和方向，并制定了初步探索性实验方案。1.2.4 开展实验研究，建立标准方法2018年11月至2019年8月，标准编制组在查询资料、方法修订、需求调研、探索性实验、技术研讨和专家论证

4、意见的基础上，进一步修改和完善了实验方案，并开展了大量的实验室内方法研究工作，形成方法验证方案。1.2.5 方法验证2019年9月，组织了3家实验室进行方法验证。2019年9月底统计数据。1.2.6 形成标准方法文本和编制说明的征求意见稿2019年9月，编制组分析了方法验证数据，形成标准文本和编制说明稿并提交。1.2.7 召开标准征求意见稿技术审查会2019年9月，由西安市水务局组织召开了该标准的征求意见稿技术审查会，审查委员会通过该标准征求意见稿的技术审查，并建议按照以下修改完善后，提请公开征求意见：1.2.8 公开征求意见待完成。2 草甘膦2.1 标准制修订的必要性分析2.1.1 污染物的

5、理化性质及环境危害草甘膦化学式为C3H8NO5P，分子量169.08，别名为农达、镇草宁、时拔克，化学名称是N-(磷酰基甲基)甘氨酸，纯品（95%）为白色结晶固体。不溶于一般有机溶剂，微溶于甲醇、乙醚，其异丙铵盐/铵盐完全溶于水，不可燃，常温下稳定，挥发性低。草甘膦是内吸传导灭生性光谱除草剂，以內吸传导性强而显著，它不仅能通过茎叶传导到地下部分，而且在同一植株的不同部分蘖间也能进行传导，对多年生深根杂草的地下组织破坏力很强，能达到无法达到的深度。草甘膦是目前世界上应用最广，生产量最大的广谱非选择性除草剂，但其不合理的使用仍会导致其过高地残留于植物体中，且在土壤中具有中等的持留性，从而进入水体循

6、环，由此草甘膦在水环境中的污染也越发受到关注。由于草甘膦会对非靶标植物以及后茬作物产生很大的毒性危害，且具有广泛的生殖毒性、诱发突变性等一些环境激素效应，对生态环境和人体健康的潜在危害极大。本标准旨在建立一种水质草甘膦的测定方法，为水质分析提供一种检测方法。2.1.2 相关环保标准和环保工作的需要目前我国有3个标准规定了草甘膦的浓度限值，见表2-1。表2-1 与草甘膦相关的环境质量及排放标准一览表序号标准号标准名称限值（ g/L）测试方法1GB 5749-2006生活饮用水卫生标准0.7mg/L高压液相色谱法2GB/T 4848-2017地下水质量标准0.114070014001400液相色谱

7、-紫外检测器法液相色谱-质谱法3GB/T 0684-2017 草甘膦水剂30%、35%、41%、46%高效液相色谱法2.1.3 现行方法实施情况及存在问题目前，涉水行业现行的草甘膦标准为国家颁布的地下水质量标准（GB/T 14848-2017）、生活饮用水卫生标准（GB 5749-2006）等标准。测定水中草甘膦的方法有GB/T 5750.9-2006生活饮用水标准检验方法 农药指标 高压液相色谱法。2017年颁布的地下水质量标准（GB/T 14848-2017）为推荐检测仪器方法，无具体操作步骤。而生活饮用水卫生标准（GB 5749-2006）已经10多年未曾修订，检测方法采用阴离子或阳离子

8、交换色谱法分离草甘膦和氨甲基膦酸，用次氯酸盐将草甘膦氧化成氨基乙酸，再与邻苯二醛和2-巯基乙醇反应生成异吲哚产物，进行测定。该方法前期衍生步骤复杂，不确定因素较多，无法人为控制，稳定性较差，除液相色谱仪外，还需配置柱后衍生装置，其适用性不高。2.2 国内外相关分析方法研究2.2.1 主要国家、地区及组织相关分析方法研究编制组检索到水中草甘膦分析测定方法有8个，其中我国2个，美国2个，ISO2个，法国1个，德国1个，分析方法见表2-2。表2-2 监测分析方法一览表序号标准编号标准名称来源方法原理适用范围1GB/T 5750.9-2006（18.1）生活饮用水标准检验方法 农药指标中国国标采用阴离

9、子或阳离子交换色谱法分离草甘膦和氨甲基膦酸，用次氯酸盐将草甘膦氧化成氨基乙酸，再与邻苯二醛和2-巯基乙醇反应生成异吲哚产物，进行测定。生活饮用水2GB/T 20684-2017草甘膦水剂中国国标高效液相色谱法草甘膦水剂3EPA 40881601（1987）高效液相色谱法美国加HCL溶液后旋蒸浓缩，残渣加 KH2PO4溶液，并调节pH值为2.1，加0.3MNa2EDTA溶液，0.45 m膜过滤后，用OPA柱后衍生化。水4EPA 547（1990）高效液相色谱法美国水样过滤后直接用OPA柱后衍生化饮用水5ISO 21458（2008）高效液相色谱法国际乙醚萃取净化后与FMOC-Cl衍生化饮用水，地

10、下水，地表水6ISO 16308（2014）液相色谱-质谱法国际水样过滤后与FMOC-Cl衍生化饮用水，地下水，地表水7NF T90-188-2009高效液相色谱法(HPLC)和荧光探测法法国草甘膦在色谱柱上分离后，被衍生成强荧光物质，用水和废水8DIN 38407-22-2001高效液相色谱法德国德国检验水、废水和污泥的标准方法.共同可测定物质(F组).第22部分:使用高效液相色谱法、柱后衍生和荧光检测法对草甘膦和氨甲基磷酸(F22)的测定检验水、废水和污泥从表2-2 可以看出，上述方法基本可以归为一类，即通过前期衍生反应，将草甘膦转化成可以被荧光检测器测定的衍生类化合物。衍生反应较为复杂，

11、衍生转化百分比无可控，由于过程较为复杂，实际应用会影响工作效率。近十年，随着仪器的发展，液相色谱在液质联用仪中的应用逐步广泛，因为在小分子化合物的分析中液相色谱在较低的流速下实现了更好的柱效，与质谱部分具有更好的匹配性和兼容性，同时实现了更好的灵敏度、分离度及分析速度。本标准在前期文献调研与仪器相结合的基础上，提出一种直接进样测定草甘膦的方法，方法简便，工作效率大大提高，满足地下水源地的检测要求。2.3 标准制修订的基本原则和技术路线2.3.1 标准制（修）订的基本原则本标准制订依据国家环境保护标准制修订工作管理办法和环境监测 分析方法标准制修订技术导则（HJ 168-2010）的要求，以国内

12、外相关标准为基础进行编制。1、建立的标准分析方法能够满足各项方法特性指标的要求。方法的检出限和测定范围满足相关环保标准和环境监测工作的要求；2、建立的标准分析方法的准确度、精密度方法准确可靠，满足各项方法特性指标的要求；3、建立的标准分析方法符合我国目前检测仪器和试剂、材料的供应条件；4、建立的标准分析方法符合监测行业人员的技术水平，能被国内主要的环境分析实验室所使用并达到所规定的要求；5、建立的标准分析方法具有普遍适用性，易于推广使用。2.3.2 标准制修订的技术路线图2-1 本标准制修订的技术路线图2.3.3 标准的适用范围、主要技术内容2.3.3.1 标准的适用范围本标准适用于地下水、生

13、活饮用水、地表水中草甘膦的测定。2.3.3.2 主要技术内容本标准水样经微孔滤膜过滤后直接进样，液相色谱-质谱/质谱法测定水中草甘膦的含量，保留时间、特征离子定性，外标法定量。定性定量准确，线性相关性强，干扰小。本标准主要优势在于：1、前处理方法简单，无需进行预浓缩，或进行柱前、柱后衍生化，直接用0.22m水系微孔滤膜过滤；2、方法检出限低；3、能够准确测定水质中草甘膦残留量，定量准确可靠，且重现性良好；4、检测周期缩短，大大提高了水质检测效率。2.4 方法研究报告2.4.1 方法研究的目标本标准规定了地表水、地下水、生活饮用水中草甘膦测定的液相色谱-三重四级杆质谱联用仪法。通过实验确定前处理

14、方法，优化测定条件，明确方法检出限、测定范围、精密度、准确度等特性指标，规范操作步骤；通过外部实验室验证方法的可行性。2.4.2 方法原理水样采集后，用0.22m水系微孔滤膜过滤样品，利用液相色谱-质谱法检测。以保留时间以及特征离子定性，外标法定量。2.4.3 试剂和材料2.4.3.1 水：符合GB/T 6682-2008中规定的一级水。2.4.3.2 乙腈：色谱纯。2.4.3.3 乙酸铵：色谱纯。2.4.3.4 草甘膦标准液1000mg/L。2.4.3.5 微孔滤膜：0.22，水系。2.4.3.6 草甘膦标准储备液：用水稀释草甘膦标准储备液，配置浓度为10mg/L的草甘膦标准使用液。-82保

15、存。使用时应恢复至室温，并摇匀。2.4.3.7 乙酸铵溶液：配置浓度为2mmol的乙酸铵溶液，超声脱气。2.4.3.8 氮气（N2）、氩气（Ar）：纯度99.999%。2.4.4 仪器和设备2.4.4.1 液相色谱-三重四级杆串联质谱仪在色谱仪器的选择方面，由于生活饮用水标准检验方法中草甘膦采用柱后衍生，液相色谱法荧光检测器分析，处理过程非常复杂，本标准在前期文献调研及试验的基础上，采用液相色谱-三重四级杆质谱法测定水中草甘膦含量。2.4.4.2 色谱柱的选择色谱柱的选择是色谱操作条件确定的重要方面，主要涉及柱的填料、柱长、内径等。由于草甘膦的强极性特性，因此，在本方法标准中首先考虑商品化的赛

16、默飞世尔Syncronis Hilic 色谱柱，柱长100mm，内径2.1mm，填料1.7m，最大压力1250bar，pH范围28。经试验确认，该色谱柱能确保极性和亲水性分析物的一致和可预测的分离，可以满足分析要求，其在实验室间的方法验证时比较容易获得。2.4.5 样品2.4.5.1 样品采集参照HJ/T 91-2002、HJ/T 164-2004和GB/T 5750.2-2006的相关规定进行水样采集。用棕色玻璃瓶采集，采样前采样瓶用待采水样荡洗23次。采样时应记录样品的名称、来源、采样量、保存状况、采样点位、采样日期、采样人员等信息。采样人员应及时填写采样记录或采样报告。2.4.5.2 样

17、品贮存根据2018年5月1日实施的地下水质量标准（GB/T 14848-2017）附录A 表A.1（续）地下水样品保存和送检要求中规定草甘膦保存方法为4冷藏，保存时间为7天内提测定。2.4.6 分析步骤2.4.6.1 预处理方法的选择实际环境中的水样存在各种各样的杂质，会对草甘膦的测定产生影响，需要采取净化措施去除杂质干扰。而对于没有太多杂质的地下水、生活饮用水、地表水水体，可采用0.22 m微孔滤膜过滤样品后进样。本标准针对水系、有机系微孔滤膜进行选择验证实验，结果如表2-1。表2-1 有机系与水系微孔滤膜前处理对草甘膦测定的影响 微孔滤膜加标浓度测定值回收率水系200g/L200.5g/L

18、100.0%有机系200g/L153.3g/L76.6%直接进样前处理使用水系微孔滤膜。2.4.6.2 质谱条件的优化采用注射泵连续进样，根据草甘膦检测结果进行优化调谐。由于草甘膦极性较大，因此选择电喷雾离子源（ESI）。比较正离子和负离子模式下扫描结果，草甘膦在正离子模式下无响应，负离子模式下有响应。如图2-2。图2-2 草甘膦一级质谱扫描图从图中可以看到基峰中含有168m/z碎片离子，通过大量文献验证，该片段为草甘膦特征碎片离子，因此选定168m/z为母离子，结合草甘膦的一级电离特征碎片特性，设置合适的扫描质量范围，调整喷雾电压，使得草甘膦的一级电离特征碎片扫描峰图响应最大且峰图稳定。如图

19、2-3。图2-3 喷雾电压为2800V的草甘膦一级质谱扫描图进行二级质谱扫描，寻找子离子碎片。选择响应较高且干扰性较小的3个目标离子（150.02m/z，63.25m/z，79.19m/z）进行定性和定量，并优化其响应的碰撞能量，建立质谱方法。如表2-4。表2-4 草甘膦的特征离子母离子碎片离子碰撞能量信号强度16863.25261.000e+0516879.19401.000e+05168150.02131.000e+05最终确定的质谱参考条件为：1）毛电压:2800 V；2）汽化温度：350 ；3）鞘气：30.0 Arb；4）辅助气：10.0 Arb；5）细管温度：320 ；6）扫描方式：

20、SRM（全扫描）负模式；7）Q1分辨率：0.7；8）Q3分辨率：0.7；2.4.6.3 色谱条件的优化本实验采用赛默飞世尔Syncronis Hilic 色谱柱，柱长100mm，内径2.1mm，填料1.7mm，最大压力1250bar，pH范围28。2.4.6.3.1 流动相选择根据大量文献及草甘膦分子结构、强极性等特点分析，有机系流动相选取极性较大的乙腈溶液，水系流动相选择乙酸铵水溶液作为缓冲液。本标准考查了以下流动相配比，如表2-5。表2-5 草甘膦的色谱流动相配比序号流动相A乙酸铵水溶液液流动相B乙腈结果12mmol乙酸铵水溶液乙腈保留时间为1.1min左右25mmol乙酸铵水溶液乙腈保留

21、时间为1.1min左右，离子源有结晶现象310mmol乙酸铵水溶液乙腈保留时间为3.5min左右，离子源结晶现象较严重42mmol乙酸铵水溶液（氨水调pH=10）乙腈保留时间为1.1min左右55mmol乙酸铵水溶液（氨水调pH=10）乙腈保留时间为1.1min左右，离子源有结晶现象610mmol乙酸铵水溶液（氨水调pH=10）乙腈保留时间为3.5min左右，离子源结晶现象较严重赛默飞世尔Syncronis Hilic 色谱柱pH范围为28，故选择2mmol乙酸铵水溶液：乙腈的流动相体系。2.4.6.3.2 进样体积的选择根据仪器特性，本标准考察了5L、10L、15L、20L四种不同进样体积对

22、峰型、响应面积等的影响。结果表明5L、10L进样体积出峰不稳定，20L进样体积有拖尾峰出现。故选择15L进样体积。2.4.6.3.3 流速选择本标准考查了0.25 mL/min、0.30 mL/min、0.35 mL/min、0.40 mL/min几种流速，结果表明采用0.35 mL/min流速峰型最好。终上所述，最终确定的液相色谱参考条件为：1）流动相：水相（乙酸铵水溶液）：乙腈进行梯度洗脱；0.0-1.0min：10%水相（乙酸铵水溶液）：90%乙腈；1.5-4.0min：35%水相（乙酸铵水溶液）：65%乙腈；4.1-5.0min：10%水相（乙酸铵水溶液）：90%乙腈；2）流速：0.3

23、5 mL/min；3）样品盘温度10；4）柱温：35 ；5）进样体积：15 L；图2-4 草甘膦质谱图保留时间1.1min图2-5 草甘膦总离子流图图2-6 草甘膦子离子流图2.4.6.4 标准曲线的绘制 根据液相色谱-三重四极杆质谱仪的灵敏度及线性要求，以方法检出限25倍浓度值为本方法标准曲线最低点浓度；在本实验中我们发现草甘膦浓度高于500g/L时所测精密度不稳定，因此以500g/L浓度值为本方法标准曲线最高点浓度。标准曲线范围为20g/L500g/L，配制7个浓度点，绘制标准曲线，回归方程、相关系数见下表2-6。表2-6 回归方程与相关系数化合物回归方程相关系数/r草甘膦Y=8.274e

24、2X-30773e20.9992图2-7 草甘膦标准曲线2.4.7 实验室内方法的特性指标的确定2.4.7.1 方法检出限及测定下限按照环境监测 分析方法标准制修订技术导则（HJ 168-2010）中附录A1.1所示方法确定草甘膦测定的检出限。即，以实验室纯水为空白样品，加入一定量草甘膦混合标准溶液，配制成浓度为预计方法检出限25倍浓度值的空白加标样品。按照样品分析的全部步骤，平行测定n（n7）份空白加标样品，计算方法检出限。以4倍检出限作为方法测定下限。测定步骤：1）将样品加到纯水中配制成约为40g/L的水样，该浓度值约为估计检出限的25倍所对应的浓度值。按前处理方法过滤水样后，上机测定。2

25、）按照样品分析的全过程连续分析9次样品，用所得的结果计算方法检出限。3）计算平行测定的标准偏差。4）计算公式：式中：MDL方法检出限（g/L）S平行测定（批内）的标准偏差；n重复分析的样品数；t(n-1,0.99)置信度为99%、自由度为n-1时的t值；MDL检出限（g/L）本方法检出限、测定下限的测试结果见下表2-7。表2-7草甘膦方法检出限、测定下限测定结果浓度(g/L)测定值(g/L)均值（g/L）标准偏差t(n-1,0.99)S检出限(g/L)测定下限(g/L)4043.51140.02.38288.000693640.31937.71340.95537.54841.02342.957

26、39.14936.7872.4.7.2 精密度按环境监测 分析方法标准制修订技术导则（HJ 168-2010）中规定，本标准进行空白加标对三个浓度水平（低浓度、中浓度、高浓度）的加标水样进行了方法的精密度测定，结果见表2-8。表2-8 草甘膦精密度的测定结果平行号试样浓度（g/L）40100400测定结果（g/L）150.223100.089385.579243.51190.956339.174340.319111.797328.97437.713129.367430.288540.955128.173354.882637.548127.652388.439741.023119.542341.

27、95842.957102.211354.645939.149104.735341.104平均值（g/L）41.489112.725362.781标准偏差S3.86814.11432.535相对标准偏差RSD（%）9.32%12.52%8.97%1、测定均值计算公式为： 2、标准偏差SD计算公式为： 3、相对标准偏差RSD计算公式： 2.4.7.3 准确度按环境监测 分析方法标准制修订技术导则（HJ 168-2010）中规定，本标准进行空白加标，对三个浓度水平（低浓度、中浓度、高浓度）的加标水样进行了准确度测定，从表中可以看出，不同浓度的加标水样，测定的回收率在71.95%97.82%范围内。测

28、试结果见表2-9。表2-9 草甘膦准确度的测定结果 浓度单位：g/L平行号加标后浓度回收率（%）加标后浓度回收率（%）加标后浓度回收率（%）20/50/300/测定结果（g/L）117.07385.37%48.91297.82%240.36380.12%217.81689.08%48.83697.67%262.54487.51%316.77783.89%44.76989.54%215.85671.95%416.11680.58%45.92591.85%236.62678.88%517.08585.43%42.64685.29%234.01178.00%619.29796.49%46.61493

29、.23%266.58188.86%717.00985.05%44.22488.45%238.36879.46%平均值（g/L）1.009 /2.339 /17.409 /标准偏差S17.310 /45.989 /242.050 /相对标准偏差RSD（%）5.83%/5.09%/7.19%/平均加标回收率（%）/86.55%/91.98%/80.68%2.4.7.4 方法准确度按环境监测 分析方法标准制修订技术导则（HJ 168-2010）中规定，本实验采集了地表水、地下水和生活饮用水三种实际环境水样进行加标的准确度测试，所用水样原水均未检出目标待测物。测定结果见表2-10。表2-10 草甘膦方法准确度的测定结果 浓度单位：g/L平行号地下水加标后浓度（40）回收率（%）地表水加标后浓度（1