WB实验步骤详细总结.docx

1、WB实验步骤详细总结WB实验步骤详细总结蛋白提取（所有操作在冰上进行）1.裂解1)配裂解液：PMSF=100：1，（裂解液和PMSF在-20保存，提前一天4解冻）取2ml裂解液，加20l PMSF混匀2)称取30mg组织，切碎放入标记好的AP管中，加入600l上述1中液体（加入液体与组织比例为20：1），冰上静置10min2.匀浆先用超纯水润洗一下匀浆机的钢头，（同时进行几组匀浆时，组间也要润洗钢头）在匀浆机（在生化室）上每次匀浆10s，两次（间隔5s），冰上静置30min3.离心（在基础4楼416室）1)自带1ml枪以及蓝枪头和黄枪头，三个1.5的离心管（，两个标记，加少量超纯水，号是为了离

2、心平衡，对称放置）2)将离心机预冷至4为止，以120010r/min离心15min3)用移液枪将上层清液取出放入号管中4.变性（上样缓冲液：样品=4：1）将样品转移至23个0.5mlAP管中加上样缓冲液，100变性10min仪器屏幕：S500：10S5100000：10时间（时：分钟）温度（）5.保存变性结束后，打开AP管盖放一下气，然后4保存，点样是取出即可用WB实验步骤先调电压至70mV，跑约20min。（Mark跑开，分出彩带即可）再调电压至120mV，跑约60min。（不能跑过下面的玻璃板）注：Mark的条带从红色条带往下依次为：7055403520，待测蛋白的分子量再哪一区域就在哪一

3、段剪。用绿色的切板切割待测区域，边缘留点空余，以防止切到条带。放入装有转移液的皿中浸泡1.转膜（转移液可用3-4次）1)剪四层滤纸（大小与膜相，近可大不可小）浸入转移液皿中。然后再讲其剪成与胶一致大小（胶始终保持湿润）2)剪PVDF膜（用上述滤纸，勿用手直接接触PVDF膜），然后用甲醇活化10s以上3)“夹三明治”再大塑料盆中加入少量转移液，将夹板、海绵、滤纸、膜均放入浸泡，夹板黑板在下、两层滤纸胶膜两层滤纸（胶的大分子量条带在上方，即在右上方）4)安装转膜装置：黑板对黑板，电极黑对黑，红对红。加入转膜液至满（否则仪器无法启动）5)打开开关，调节电流至100mA，转膜2h（恒流）盆中加满冰转膜

4、成功标志：胶上的条带均转移的膜上，胶呈无色2.封闭1)配制5%脱脂奶粉：小烧杯中混匀加入皿中2.5g脱脂奶粉 50mlTBST2)将膜取出放入上述加入了5%脱脂奶粉中的皿中常温慢摇60min（转移液回收其余清理掉，转移液可以重复利用2次）3.一抗1)用TBST配，每一格加5ml TBST，再分别加入抗体抗体的量：2l（Psmad2l）免抗1:10005l：5ml58（分子量）2l（Psmad2l）免抗1:50010l：5ml58Jnk免抗1:10005l：5ml双带内参（小鼠抗GAPH）单抗，中杉金桥1:50001l：5ml362)膜上用圆珠笔标记，分别放入小格中（正面朝上）3)4冰箱中，慢摇

5、过夜（正面朝上，摇床416室）4.洗脱用TBST在皿中洗脱，摇床10min每次，洗三次。5.二抗1)用3%的脱脂奶粉小烧杯中混匀加入皿中1.5g的脱脂奶粉50mlTBST2)每格吸入5ml 3%脱脂奶粉，抗体与奶粉比例均为1:5000，即加入1l注意：吸入微升时，一定要检查是否吸到液体，一抗用鼠抗则二抗用鼠抗，一抗用免抗二抗用免抗3)膜分别加入小格，慢摇1-2h（常温）6.洗脱用TBST在皿中洗脱，摇床10min每次，洗三次。7.显影： U盘所需物品 A液，B液（显影液。4保存） 200l枪+枪头（黄） 膜（置于皿中）1)开机后自动预冷，温度降到1-20才可2)显影液现配现用（A液：B液=1：1）3)膜正面朝上放于暗箱，（即大分子量再左上角）用移液枪吧显影液均匀涂在膜上4)先点击自动曝光，看下效果，显示不清晰再手动该曝光时间，内参一般显影15s（影像的条带粗细深浅一致则说明已调齐）内参好说明各步实验操作均无误，目的蛋白结果好坏就取决于抗体的专一性。5)每张图保存多张不同清晰度的以备用，拷贝至U盘试剂配方：