园林植物快繁技术.docx

1、园林植物快繁技术园林植物快繁技术导言1.课程的性质和地位园林抗物快繁技术是林业及园林高新技术治理专业必考的重要专业课程，是一门实践性，综合性专门强的技术学科。与植物生理学、园林植物栽培学、苗圃学、市场学、治理学等学科有着紧密的关系；与此同时，它也有自身学科的性质，特点，内容及其内在结构，如园林植物快繁的差不多概念，差不多理论，差不多技术构成和应用领域等一系列内容。因此，在学习本课程时要注意力量放在基础知识的学习和应用上，紧密联系实际和有关学科的基础知识，把握正确的分析问题，解决问题的方法。本课程和其他课程的关系2使用教材 1.指定教材陈振光主编 园艺植物离体培养学 中国农业出版社 1991(2

2、) .参考书籍 白宝璋 叶尚红 王玉国主编 植物生理学 中国农业出版社 1996 陈正峰 木本植物组织极其应用 高等教育出版社 1986 曹孜义 刘国民主编 有用植物组织培养技术教程 甘肃科学技术出版社 20012.教材体系依照教材内在的结构和便于学员学习的需要，本教材分为六部分：绪论第一章离体培养的差不多操作方法第二章到第五章 依照外植体差异而划分的离体培养技术体系第六章到第九章 离体培养的差不多概论和原理第十章到第二十五章 各论部分 要紧介绍一些有代表性的园艺植物种类离体培养，连同书本附表作为资料供学员参考绪 论通过本部分学习，了解植物离体培养学的产生与进展，明白得其与其它学科和园艺园林植

3、物生产的关系，把握植物离体培养学的含义。一、园艺植物离体培养学的差不多含义1.植物离体培养指通过无菌操作，使植物体的各类结构材料外植体接种于人工配制的培养基上，在人工操纵的环境条件下，进行离体培养的一套技术与方法，通常称之为植物组织培养式植物的细胞与组织培养。2.离体培养技术体系胚胎培养及以胚胎为基础的培养技术器官及器官原基培养组织培养细胞培养原生质培养及以原生质体为基础的培养技术3.离体培养的应用多种的繁育与脱毒种质资源的贮存细胞次生代谢物质的生产细胞工程和基因工程的生物技术育种遗传学和生物学基础的研究二、园艺植物离体培养学的形成与进展一、植物离体培养的渊源及其早期的实践 1902年、Hab

4、er landt提出了细胞全能性的观点，并首次进行植物细胞培养实验。二、植物离体培养差不多技术体系的形成 1934年White首次建立了番茄的无性繁育系 1937年White发觉B族微生物素和吲保乙酸对离体培养的作用 19341939年White等人初步建立起植物离体培养的差不多方法 1943年White发表了第一部植物离体培养专著植物组织培养手册又重新提出了细胞全能性。 1957年skaog建立了器官分化的激素配比模式。 1953年Muir报道了细胞悬浮培养法。 三 园林植物离体培养学科的建立 1、完善离体培养技术、探究理论基础 19641966年诱杀未成熟花粉形成单位体植株。 1960年分

5、离番茄动根原生质体获得成功， 1978年第一获得了体细胞杂种potamato. 植物细胞全能性为基因转化提供方便。2、开拓应用研究 生产上应用最广泛，最成功的领域是离体快速繁育。三、植物离体培养学与园艺科学的关系一、离体培养与园艺植物良种繁育学二、离体培养与园艺植物育种学三、离体培养与园艺植物基础学科 第一章 离体培养的差不多操作方法 通过学习，明白得和把握离体培养的差不多操作方法包括：一样的材料选取、无菌技术、培养基配置和环境条件调控为园林植物快繁技术打下基础。第一节外植体的选择与处理外植体植物离体培养中的各种接种材料，包括植物体各个器官、组织、细胞和原生质体等。（一）外植体的选择1、选择优

6、良的种质要紧的园艺植物选取性优良的种质先专门的基因型 要有明确目的 具有一定的代表性2、选择建壮的植株生长建壮的无病虫害的植株 正常的器官和组织 多年生植物应从成年树上取材3、选择外植体的大小对植体太大易污染 太小多形成愈伤组织 外植体大小在0.51.0cm。4、选取对植体的时期一样按照植物生长的最适时期取材含酚类物特多的植物，应在酚类物含量低的季节取材从种苗圃推算苗期，增殖代数等因数，确定选取外植体的合适时期。5、选择细胞培养材料通常依照细胞培养的目的 选择细胞培养材料多数采纳茎类分生组织和胚胎培养的愈伤组织作为细胞培养的起始材料。为了生产次生代谢产物，那么选取某次生物质含量高的特定器官或组

7、织。 二、培养材料的处理 1、母株的预处理 促使母株的生长带谢活跃 方便取材 容易灭菌 降低污染率 2、外植体休眠期的处理 通常采纳低温或者赤霉药剂进行处理 ， 3、外植体的灭菌 进行严格的灭菌 林料来源 取材部位 取材季节 第 二节 培养茎的制备一、培养茎的种类及组成1.培养茎外植体生长的营养物质，通常有两个水平，一是差不多培养茎包括大量元素和微量元素，维生素和氨基酸，还有糖和水。二是完全培养茎，即在差不多培养的基础上，依照各种不同实验要求，附加一些物质，如各种植物生长调剂剂以及其它的复杂有机附加物，外植体生长的营养物质。 差不多培养茎 大量元素+微量元素+维生素+氨基酸+糖+水完全培养茎差

8、不多培养茎+植物生长调剂剂有机附加物2.固体培养茎和液体培养茎的比较固体培养茎设备简单 使用方便 充分利用培养容器中的养分易选成自我毒害液体培养茎需要一定的设备 有利于外植株的生长幸免上述固体培养茎的缺点3.常见培养茎配方 参见教材附录2二、配制培养茎的预备工作 一、器皿和用具的预备 要紧器具：烧杯、容量瓶、移液管、滴管、试管器具的预备： 清洁 烘干二、水和药品 水原那么上用纯水，一样用蒸馏水即可 化学药品用分析，纯或化学纯三、贮备液的配制 1.贮备液的类型 大量元素 扩大1050倍 微量元素 扩大100倍 铁盐 扩大100倍FeSO4.7H2O+Na2EDTA植物生长调剂剂 0.5mg/ml

9、 2.贮备液的配制分别称量 溶解 混合 储存三、配制培养茎的方法 少量蒸馏水溶解蔗糖倒入1000ml容量瓶 吸取各种贮备液放入容量瓶 定容 转移到大烧杯与琼脂加热溶解 PH调整 分袋 灭菌 储存备用第二节无菌技术一、无菌室 无菌室的组成：包括无菌操作室和无菌培养室 无菌室的要求：墙壁光滑 地面平坦 门窗密闭 无菌室的灭菌：2新洁尔灭擦洗 75乙醇喷雾 紫外灯照耀： 定期使用甲醛和高锰酸钾熏蒸二、试材和器具的灭菌1.培养茎的灭菌采纳高温高压灭菌锅工作压力为1.1kg/c120保质1520min注意排尽冷空气灭菌完毕 冷却 备用2.专门药品的灭菌高温下易分解和变质的药品过滤除菌：溶液通过孔径为0.

10、200.45um的过滤网抽滤除菌：用真空泵产生抽力，使溶液通过过滤网3.器皿具灭菌常用干热灭菌法工作条件为160/hr注意用牛皮纸等包扎好器皿具4.外植体的灭菌175乙醇 润浸和杀菌作用 30s2氯化汞 浓度为0.1 510min，无菌水冲洗35次3次氯酸钠 浓度210 1530min ，无菌水冲洗35次三无菌操作1.无菌操作前10min先使超净工作台处于工作状态。2.穿戴好工作衣帽后，用70酒精檫拭双手个工作台面。操作期间，也应在檫拭数次。3.拨塞前，要用火焰灼热瓶口，用硫酸纸等做瓶盖的，应在火焰邻近打开盖子。4.操作时，试管口应略略向下，幸免尘埃杀菌落入管内，又便于操作。第四节 环境条件的

11、操作一光照1.光照时刻：1216hr2.光照强度：10005000/x3.光照长短光源：日光灯二温度一样操纵在252恒温条件下培养三湿度瓶内一样可达到100，幸免环境湿度过小，防改瓶内失水四汽体幸免培养室内存在有氨气体第二章 胚胎培养和离体受精 通过学习，了解胚珠和子房培养，离体受精的胚胎培养技术，明白得和把握胚培养，胚乳培养的胚胎培养技术。第一节 离体胚培养一胚培养的意义1.促使发育不良或中途败育的胚发育成熟分离发育不良的种子或立即败育前的种胚进行培养，促使胚连续发育至成熟，使杂交育种或远保杂交获得成功，专门关于败育胚进行早期离体培养，在遗传和育种上均具有重要意义。2.打破休眠期促进胚萌发关

12、于有休眠期的种子，可通过胚培养。促使休眠种子提早萌发成苗，缩短育种周期或加速繁育良种。3.克服多胚品种珠心胚的干扰具有多胚发育受阻，其珠心胚能够侵入胚囊，使合子胚发育受阻阻碍杂交育种工作。利用胚胎培养技术，早期分离合子胚培养，排除珠心胚干扰，获得杂种胚。4.快速繁育良种胚末5.诱导胚性愈伤组织离体胚培养的发育途径：按正常胚胎发育途径形成植株合子 球形胚 心形胚 鱼雷形胚 子叶形胚 再生植株胚胎脱分化形成愈伤组织胚早期萌发成熟胚的培养：材料的消毒与接种，培养茎，种胚培养的外界条件原胚培养：差不多培养茎：MS改良White培养茎；培养茎的渗透应用蔗糖调整，用量在810生长调剂：及其它附加物的阻碍生

13、长调剂：种类、浓度、比例附加物：天然提取物第二节 胚乳培养一、胚乳培养的用途1.诱导分化植株，证明细胞全能性的理论。2.研究胚与胚乳的相生关系，胚乳组织的功能。3.再生的植株多为三倍体，有可能产生无籽果实。4.育种和性状遗传规律研究。二、胚乳培养材料的选择：细胞型期三、胚乳愈伤组织的诱导四、器官分化再生植株五、胚乳再生植株的染色体胚性第三章 器官和组织培养器官培养：是植株物某一器官的全部或部分或器官原基的培养组织培养：广义：各种类型外植株的培养。狭义：各种器官组织，以及其培养产生的愈伤组织的培养第一节 茎尖培养茎尖培养：此概念应注意茎尖的含义。一、建立无菌材料二、茎尖的发育方向及调剂1.腋芽萌

14、芽 2.脱分化后产生胚状体 3.脱分化后直截了当产生不定器官 4.脱分化形成愈伤组织三、生根成苗及移栽促进生根的措施：降低差不多培养培养基无机茎浓度 调剂生长素浓度 添加吸附剂 减少琼脂用量第三节固相化细胞培养固相化细胞：把细胞固定在一种惰性基质，如琼脂、藻酸盐、纤维或膜上面或里面、细胞不能运动，而营养液能够在细胞间流淌，供应其营养。一、固相化细胞培养的特点二、固相化细胞系统第三节 单细胞培养 单细胞培养：也称单细胞可隆技术，它不是指培养的只有单个细胞，而是指接种的细胞群体中，不存在悬浮培养中所可能存在的小细胞团。而是纯碎的单细胞。个单离细胞不仅仅只是在增殖时期，它可被诱导再分化，形成完整植株

15、。一、单离细胞的方法二、单离细胞培养技术方法三、培养细胞的密度及生活率的测定第五章 原生质培养与融合第一节原生质体分离一、用以游离原生质的材料来源二、酶混合液三、游离原生质体的一样技术程序四、花粉原生质体的分离第二节 原生质体培养一、培养茎二、培养方法三、原生质体的培养结果及其观看第二节原生质体融合：原生质体融合：也称体细胞杂交，确实是使分离下来的不同亲本的原生质体之间在人工操纵的条件下，象形细胞受精作用那样及相融合为一体。 无机盐诱导融合 聚乙二PEG与PH的Ca相结合的诱导融合方法电融合技术杂种细胞的选择和体细胞杂种的鉴定第 六 章 细胞全能性及其营养代谢第一节植物细胞全能性一、植物细胞全

16、能性：植物细胞具有该植物有机体的全部遗传信息，并具有形成植物有机体所有细胞类型，自然发育成完整植株的能力。二、植物细胞全能性的展观和利用 外植体在腋芽萌发等情形下直截了当发育成苗，还克以在异养条件下脱分化，形成愈伤组织，愈伤组织能够再分化，也能够游离原生质体。用以遗传操作，或游离细胞用以次生物质生产操作的原生质体和细胞均可象愈伤组织一样，实现再分化，再分化能够是胚状体途径。也但是不定器官途径，前者能够用以制备人工种子。胚状体和不定器官均能够种质储存，也均可形成试管苗，用以快速无性繁育。试管苗方式培养成为进行植物生命周期一样的成年植株，开花结果，完成离体培养周期。第 二 节 培养物的营养一、碳源

17、碳源物质以糖类物质最重要。一样的说，蔗糖是最好的糖源，其次是葡萄糖，果糖。糖的浓度一样为24二、氯源硝态氮 铵态氮 氨基酸 有机复合物三、无机营养大量元素和微量元素四、维生素VB1 VB6五、生长调剂剂生长素类：1AA 1BA NAA 2，4D细胞分裂素类： 6BA KT ZT ZIP第三节 培养物的次级代谢一、次级代谢概况及生物转化举例二、次级代谢的调剂1.初级代谢对此基代谢的调剂2.次级代谢的酶促调剂3.环境因素对次级代谢的调剂第七章 外植体的脱分化与生长第一节 外植体脱分化一、诱导期间的细胞生物质变化1.气体变换率的增加， 2.RNA随体的合成 3.过氧化物酶的增加 4.蛋白质的活跃合成

18、 5.酚类物质的增加 6.乙烯增加第 二节 愈伤组织的生长第三节 悬浮培养细胞的生长一、成批培养的细胞生长动态1.生长周期2.生长周期中指数生长的数字表述3.生长周期中的不平稳生长二、连续培养下的细胞生长1长动力学描述2学恒定与浓度恒定三、悬浮培养细胞周期第八章 培养物再分化 再分化：是指离体培养物由脱分状态再度分化。再分化可在细胞水平，组织水平和器官水平递进地进行，最后再生完整植株。培养物的再分化，通过胚胎发生和直截了当分化器官再形成植株这两个途径实现。第一节 细胞分化和组织分化一、细胞分化1.导管分子的分化及其阻碍因素1生长调剂剂 生长素 细胞分裂素 其它生长调剂剂2糖类物质3其它理化因子

19、 光的效应 温度的效应 PH2.细胞分化过程及其机理二、组织分化1.拟分组织：是指培养物中显现的类拟分生组织的细胞群，它是脱分化后的培养物发生的一系列细胞分裂而产生的一团小型、薄壁、液泡小、细胞核和细胞质染色较深的细胞组成，它具分化上的可塑性。2.维管组织结节：是一个区域的愈伤组织转化为韧皮分子和木质分子的混合体结构，如此的形成层状的细胞向外延伸与拟分生组织连接，形成根原基或牙原基。能够认为维管结节是试管植株的维管束的前力。3.拟分生组织和维管组织是连接细胞分化和器官分化的桥梁第二节 器官分化和植株形成一、茎、根器官的分化1.器官分化的调控（1）操纵器官分化的激素模式生长素/兴奋素，生长素/兴

20、奋素的相对高水平，有利于根的形成，反之，有利于地上部的形成。在使用中注意二者的种类，浓度及其比例。（2）培养基组分和附加物的作用 提高无机P含量促进器官分化，糖的平稳可逆转生长素/兴奋素的比例；不加还原氮利于根的形成。一些生理活性物质下可促进培养物的器官发生。（3）物理环境：一样固态培养基有利于器官变化。光对器官分化有重要阻碍。100015000lx是许多培养物的合适光照。16hr光照符合器官发生要求，连紫外线和蓝光刺激芽的发生，而红光显著地促进长根，一样日光灯提供光源，一样25左右的培养温度。2.器官分化过程中的生物学和细胞学变化二、植株的形成体 发育为植株 具根茎两极器官 植株外植体脱分化

21、 不定器官 单极器官 光茎后根 植株 先根后茎 植株第三节 离体胚胎发生一、各种培养类型的离体胚发生1.对植体直截了当发生二倍体胚2.愈伤组织产生胚状体3.悬浮细胞产生胚4.单倍体胚胎发生二、阻碍离体胚胎发生的因素1.外部因素1生长调剂剂的作用 2氮源 3其它因子2.内部因素1细胞的隔离 2遗传基因型的阻碍 3外植体来源和年龄 4 其它因素三、离体胚胎发生的机制第九章 培养物的遗传与变异第一节 培养细胞变异一、培养细胞高频率变异的起因1.原先具不同检型的细胞杯诱导分裂2.培养条件引起新的异样二、培养细胞变异的遗传机理1.染色体断裂，染色体数增加2.染色体断裂，染色体数减少3.染色体断裂，并引起

22、染色体数改变4.染色体断裂，但并不引起染色体数目的变化5.体细胞核内再复制6.单个核基因的突变7.转座子的作用第二节花粉植株的遗传变异一、花粉植株的遗传稳固性问题二、花粉植株的变异三、单倍体植株的减数分裂分析第三节体细胞融合体的遗传变异一、异核体的和染色体形成1.核分裂同步、核融合，且亲本的染色体未出观不亲和观象2.核分裂同步相同或互阻碍后同步核融合，但在不同培养期发生染色体变化染色体重组或丢失。3.核不融合，且两个核间重又产生新膜、两个子细胞的以后各自分裂。4.核不融合，形成多核细胞。细胞周期纷乱二、胞质基因组的分裂与重组第十章 离体培养离体繁育：也称微型繁育或快速无性繁育，是农业生物技术重

23、要组成之一，在农业生产上应用最广泛的一个领域。第一节离体繁育的特点及其应用一离体繁育的特点1繁育速度快2.占用空间小3.便于种质贮存和交换4.离体繁育诱变5.培养无病毒苗（二）离体繁育在园艺上的应用第二节 外植株的类型与发育途径（一）外植体的类型传统的良种繁育器官组织（二）外植体发育的途径1.腋芽的萌发外植体培养中最普遍的是诱发腋芽萌发生长。腋芽的繁育系数不仅受腋芽萌发数目限制，同时与续代培养的时刻长短有关。续代时刻短、繁育系数那么高。2、不定芽的产生不定芽来自原基或分生组织等，直截了当分化成芽苗。3.离体胚胎发生胚状体具有胚芽和胚根的两极原基。胚胎发育可形成完整植株，因此是最快的植株再生途径

24、，也是外植体增殖系数最大的发育途径。第三节 离体繁育的技术与方法一、无菌材料的建立一材料的选取1.必须选取优良的母株 2.种源可靠 3.性状稳固 4.生长健壮 5.成年的母株，切忌用实生苗繁育良种二材料的灭菌1.消毒前，去掉外植体表面带菌鳞片及过多的枝叶，然后用肥皂水冲洗2.采纳水培材料3二次消毒法即材料用消毒剂处理后，用清水冲洗再用低浓度次氯酸钠冲洗一次赶忙接种4.添加抗菌剂或吸杀菌剂进行消毒5.还应注意防治褐变三培养茎一样建立无菌株原的培养基多采纳White或MS培养基，并附加低浓度的生长素或细胞分裂素，诱导无菌材料建立繁育系，初步续代培养，扩大繁育材料二、培养材料的增殖是良种无性快繁的重

25、要环节。增殖的结果要求提供大量的遗传性稳固，整齐一效的种苗。因此，须考虑以下几个因素一增殖的方式增殖的方式有四种途径，即腋芽的萌发，产生不定根和胚胎发生以及原球茎增殖途径二增殖的培养基及附加物1.增殖的差不多培养茎 2.植物生长调剂剂三增殖培养的其它因素1.增殖体的大小与续代培养的间隔2培养的光照与温度：温度为25左右 光照为12hr四、增殖培养本卷须知1.芽苗的变异 2.玻璃苗的操纵 提高琼脂的浓度降低细胞分裂素浓度培养基添加低浓度多效唑三、苗芽生根培养一差不多培养基诱导生根的差不多培养基，需降低无机盐浓度，有利于根的分化，一样用1/2或1/4MS 培养的大量元素二生长调剂剂 通常不用细胞分

26、裂素，添加低浓度的生长素。 三其他附加物 1.添加活性炭有利于生根，2.间苯三酚等有利于生根，3.生根培养的温度一样要比芽增殖所需温度略低一些。四、小苗移驯化试管苗的移植是从异养到自养的转变，需要有一个逐步适应的过程。移植之前，试管苗必须提高光强进行炼苗，同时进一步将瓶口包扎物打开进行炼苗。移植时，第一把附着干根部的琼脂冲洗洁净，同时注意幸免根茎部破伤。移苗的土壤要求保水，透气，以利小苗生长。移植的小苗注意温度和光照的驯化，即温度逐步降低，光照强度逐步加强。第四节 人工种子的研制一、研制人工种子的意义（一）概念狭义：将植物离体培养中产生的胚状体，包裹在含有养分和具有爱护功能的种皮中，在适宜条件

27、下能够发芽出苗的颗粒体。广义：人工种子包括胚状体、芽体及小鳞茎，用凝胶包裹成球体或块状或其他形状的种物。（二）意义三、人工种子制作方法及其程序（一）研制流程体细胞胚胎发生体细胞胚胎同步化体细胞胚分选体细胞胚包裹人工胚乳包裹外膜种子贮存种子播种萌发。（二）体细胞胚的发生系统1.人工种子对胚状体的要求2.胚状体的发生与同步化的选择1操纵培养茎成分及激素；密度梯度离心法进行大小胚分离选择；过滤分选或仪器分选法等等。（三）人工种皮一样是指人工种子中胚状体及其类似物以为的部分的统称。以海藻酸钠、明胶、树胶、Gelrite为最正确，包制人工种子的方法有：干燥法、离子交换法和冷却法。（四）人工种子贮存第十一

28、章 离体培养无病毒苗第一节 培养无病毒苗的意义一、园艺植物病毒病的严峻性二、脱出病毒的研究概况1.化学杀菌剂.种子繁育.热处理三、离体培养脱毒的意义离体培养脱毒是园艺植物生产中的重要环节，是常规良种繁育的一个重要程序。第二节脱除病毒的方法一、茎尖分生组织脱毒原理1.茎尖培养脱毒原理病毒在植株上的分布是不均一的，在幼嫩的组织比成熟的组织含量低。茎尖分生组织几乎不带毒。其缘故为：1.分生组织的细胞生长速度快，病毒在植物体内繁育的速度相对较慢；2.病毒的传播是靠筛管组织进行转移。或通过细胞间连续传递给其他细胞，因此病毒的传递扩散也受到一定阻碍。2.茎尖脱毒的方法关键是茎尖的大小，即要考虑脱毒成效，又

29、要注意茎尖离体培养的成活率。一样切取0.20.5mm，带12个叶原基的茎尖作材料。为了提高效率，可与热处理结合使用。第三节脱毒菌的鉴定一、无病毒株原的鉴定1.指示植物鉴定法2.抗血清鉴定法3.电子显微镜检查法二、脱毒苗农艺性状鉴定1.通过不同途径脱毒处理，可能导致良种种性的改变。2.无病毒鉴定后，必须进行田间农艺性状鉴定，才能应用。3.脱毒苗的农艺性状鉴定必须在隔离的环境条件下进行。4.脱毒苗鉴定图的任务：1.选择与亲本相同的优良经济性状的植株2.剔除非亲本性状的劣质植株3.发觉不同于亲本的优良性状的突变系。5.对可脱毒苗后代新生系的选择材料，还有必要作进一步的抗性鉴定等等。第四节无病毒原种的储存和应用一、无病毒原种的储存1.隔离种植储存1.自然环境进行隔离种植储存2.采纳隔风网室300目沙网种植储存。2.离体储存二、无病毒原种的应用1.无病毒原种的繁育：建立严格的原种繁育制度，防治病毒在感染。2.无病毒原种的推广 能够参照新品种反之推广制度，专门注意采取严密的防止病毒重复翻然的有关措施，才能取设预期的成效。第十二章 离体储存种质资源第一节离体储存种质的意义一、种子种