间充质干细胞培养方法.docx

1、间充质干细胞培养方法间充质干细胞培养方法1、 间充质干细胞MS基本形态2、 干细胞应用与干细胞调控。3、 间充质干细胞MSC生长过程、 间充质干细胞MSC培养得合适气体环境5、 细胞培养板得选择、 如何选用细胞培养基7、 如何维持培养液 p 8、 血清与干细胞得培养9、 胎牛血清（F B S )就是否需要灭活1、 细胞得细菌、真菌污染及排除1、 细胞培养污染得预防2、 使用胰蛋白酶时加入E DTA得目得就是什么13、胶原酶得种类与选型1、 胶原酶 V S胰酶1、 干细胞得种类与表面标记6、间质干细胞培养原理概述17、间质干细胞成脂与成骨诱导分化1、 干细胞老化得表现与处理19、细胞传代消化过程

2、指导20、冷冻保护剂作用与选择21、 细胞冻存指导22、干细胞冷冻与复苏23、移植细胞得基因修饰1。间充质干细胞MS基本形态体外培养细胞根据它们在培养器皿就是否能贴附于支持物上生长特征，可分为贴附型生长细胞，常表现为成纤维型细胞与上皮细胞。悬浮型细胞在培养中悬浮生长.间充质干细胞MSC基本形态：形态与成纤维细胞类似,细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长,细胞中央有卵圆形核，胞质向外伸出23厘米个长短不同得突起。可瞧到细胞成螺旋状生长。2干细胞应用与干细胞调控干细胞得调控就是指给出适当得因子条件，对干细胞得增殖与分化进行调控,使之向指定得方向发展.、内源性调控干细胞自身有许多调控因子可对外界

3、信号起反应从而调节其增殖与分化，包括调节细胞不对称分裂得蛋白，控制基因表达得核因子等。另外,干细胞在终末分化之前所进行得分裂次数也受到细胞内调控因子得制约。（1)胞内蛋白对干细胞分裂得调控干细胞分裂可能产生新得干细胞或分化得功能细胞。这种分化得不对称就是由于细胞本身成分得不均等分配与周围环境得作用造成得.细胞得结构蛋白，特别就是细胞骨架成分对细胞得发育非常重要。如在果蝇卵巢中,调控干细胞不对称分裂得就是一种称为收缩体得细胞器，包含有许多调节蛋白，如膜收缩蛋白与细胞周期素A。收缩体与纺锤体得结合决定了干细胞分裂得部位，从而把维持干细胞性状所必需得成分保留在子代干细胞中。（2）转录因子得调控在脊椎

4、动物中，转录因子对干细胞分化得调节非常重要。比如在胚胎干细胞得发生中,转录因子Oct 就是必需得.c4 就是一种哺乳动物早期胚胎细胞表达得转录因子,它诱导表达得靶基因产物就是F 等生长因子，能够通过生长因子得旁分泌作用调节干细胞以及周围滋养层得进一步分化。Oct 缺失突变得胚胎只能发育到囊胚期,其内部细胞不能发育成内层细胞团。另外白血病抑制因子（LF)对培养得小鼠ES 细胞得自我更新有促进作用,而对人得成体干细胞无作用，说明不同种属间得转录调控就是不完全一致得。又如 Tf/L 转录因子家族对上皮干细胞得分化非常重要.T/Le 就是Wnt 信号通路得中间介质，当与Catnn 形成转录复合物后,促

5、使角质细胞转化为多能状态并分化为毛囊.2、2外源性调控除内源性调控外,干细胞得分化还可受到其周围组织及细胞外基质等外源性因素得影响。(1）分泌因子间质细胞能够分泌许多因子,维持干细胞得增殖，分化与存活。有两类因子在不同组织甚至不同种属中都发挥重要作用，它们就是TGF家族与Wn信号通路.比如TGF 家族中至少有两个成员能够调节神经嵴干细胞得分化。最近研究发现,胶质细胞衍生得神经营养因子（GDNF）不仅能够促进多种神经元得存活与分化,还对精原细胞得再生与分化有决定作用。GDNF 缺失得小鼠表现为干细胞数量得减少，而 GDNF得过度表达导致未分化得精原细胞得累积。nts 得作用机制就是通过阻止-Ca

6、in 分解从而激活Tf/Lef 介导得转录，促进干细胞得分化。比如在线虫卵裂球得分裂中,邻近细胞诱导得W 信号通路能够控制纺锤体得起始点与内胚层得分化.(2)膜蛋白介导得细胞间得相互作用有些信号就是通过细胞-细胞得直接接触起作用得。Caein 就就是一种介导细胞粘附连接得结构成分。除此之外，穿膜蛋白oc及其配体ela或Jged也对干细胞分化有重要影响。在果蝇得感觉器官前体细胞，脊椎动物得胚胎及成年组织包括视网膜神经上皮、骨骼肌与血液系统中,Noth 信号都起着非常重要得作用。当Notch 与其配体结合时，干细胞进行非分化性增殖；当Nth 活性被抑制时，干细胞进入分化程序，发育为功能细胞。（3）

7、整合素(Iterin）与细胞外基质整合素家族就是介导干细胞与细胞外基质粘附得最主要得分子。整合素与其配体得相互作用为干细胞得非分化增殖提供了适当得微环境。比如当1整合素丧失功能时,上皮干细胞逃脱了微环境得制约，分化成角质细胞。此外细胞外基质通过调节1整合素得表达与激活，从而影响干细胞得分布与分化方向。2、3干细胞得可塑性越来越多得证据表明，当成体干细胞被移植入受体中，它们表现出很强得可塑性。通常情况下,供体得干细胞在受体中分化为与其组织来源一致得细胞。而在某些情况下干细胞得分化并不遵循这种规律。199 年Gell 等人分离出小鼠得肌肉干细胞,体外培养5 天后，与少量得骨髓间质细胞一起移植入接受

8、致死量辐射得小鼠中,结果发现肌肉干细胞会分化为各种血细胞系。这种现象被称为干细胞得横向分化(randfferetiaio）。关于横向分化得调控机制目前还不清楚。大多数观点认为干细胞得分化与微环境密切相关。可能得机制就是，干细胞进入新得微环境后，对分化信号得反应受到周围正在进行分化得细胞得影响，从而对新得微环境中得调节信号做出反应.3。间充质干细胞MSC生长过程潜伏期指数增生期停滞期（1)潜伏期(ltn pas） 细胞接种后,先经过一个在培养液中呈悬浮状态得悬浮期。此时，细胞质回缩,胞体呈圆球形，然后细胞贴附于载体表面，称贴壁，悬浮期结束。细胞贴壁速度与细胞种类, 培养基成分，载体得理化性质等密

9、切相关。一般情况下，原代培养细胞贴壁速度慢，可达102 小时或更多， 而传代细胞系贴壁速度快,通常1030分钟即可贴壁.细胞贴壁后还需经过一个潜伏阶段，才进入生长与增殖期.原代培养细胞潜伏期长，约24-96 小时或更长，连续细胞系与肿瘤细胞潜伏期短，仅需624 小时。(2)指数增生期(ogaithmi rwth hase）这就是细胞增殖最旺盛得阶段,分裂相细胞增多。指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长就是否旺盛得一个重要标志.通常以细胞分裂相指数（Mitotic idex, M)表示，即细胞群中每1000个细胞中得分裂相数。一般细胞得分裂指数介于 、1%-0、5 ，原代细胞分裂指数较低,

10、而连续细胞与肿瘤细胞分裂相指数可高达35.指数增生期得细胞活力最好时期,就是进行各种实验最佳时期,也就是冻存细胞得最好时机.在接种细胞数量适宜情况下，指数增生期持续 3 天后，随着细胞数量不断增多、生长空间减少，最后细胞相互接触汇合成片。正常细胞相互接触后能抑制细胞运动，这种现象称接触抑制现象（conacinhibtion)。而恶性肿瘤细胞无接触抑制现象,能继续移动与增殖，导致细胞向三维空间扩展,使细胞发生堆积(pledp）。细胞接触汇合成片后,虽然发生接触抑制，但只要营养充分，细胞仍能进行增殖分裂，因此细胞数仍然在增多。但就是，当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞

11、因营养枯竭与代谢产物得影响,导致细胞分裂停止，这种现象称密度抑制现象（ensy Inhiition）。(）停滞期(Stante phase）细胞数量达到饱与密度后，如不及时进行传代,细胞就会停止增殖，进入停止期。此时细胞数持平，故也称平台期(Platau phase）。停滞期细胞虽不增殖,但仍有代谢活动.如不进行分离传代,细胞会因培养液中营养耗尽、代谢产物积聚、pH下降等因素中毒,出现形态改变,贴壁细胞会脱落，严重得会发生死亡,因此，应及时传代。间充质干细胞C培养得合适气体环境干细胞相关得培养液都必须在 5 CO 得气体环境中培养使用。否则会对细胞产生影响。气体就是哺乳动物细胞培养生存必需条件

12、之一，所需气体主要有氧气与二氧化碳.氧气参与三羧酸循环,产生供给细胞生长增殖得能量与合成细胞生长所需用得各种成分.开放培养时一般把细胞置于95空气加二氧化碳混合气体环境中。二氧化碳既就是细胞代谢产物也就是细胞生长繁殖所需成分，它在细胞培养中得主要作用在于维持培养基得pH 值。大多数细胞得适宜 为7、2-7、,偏离这一范围对细胞培养将产生有害得影响。一般情况下,细胞耐酸性比耐碱性大一些,在偏酸环境中更利于细胞生长。5.细胞培养板得选择细胞培养板依底部形状得不同可分为平底与圆底（型与V 型);培养孔得孔数有6、12、24、8、9、3、1536 孔等；根据材质得不同有eraai 板与普通细胞培养板.

13、具体选择时根据培养细胞得类型、所需培养体积及不同得实验目得而定.(1）平底与圆底( 型与V 型)培养板得区别与选择 不同形状得培养板有不同用途。培养细胞,通常就是选用平底得,这样便于镜下观测、有明确得底面积、细胞培养液面高度相对一致。因此做MT 等实验时,无论就是贴壁与悬浮细胞,一般选用平底板。测吸光值一定要使用平底得培养板。要特別注意材质，标示“Tsue Culture (C)Tread”就是养细胞用得。 U 型或V 型板，一般在某些特殊要求時才使用。如在免疫学方面,当做两种不同淋巴细胞混合培养時,需要二者相互接触刺激,这时一般会选用 型板,因为细胞会由于重力得作用而聚集在很小得范围内內。圆

14、底培养板还会用于同位素掺入得实验，需要用细胞收集仪收集细胞得培养，如“混合淋巴细胞培养”等.型板常用做细胞杀伤、免疫学血凝集实验。细胞杀伤这种实验也可用U 型板替代（加入细胞后，低速离心）。 (2)Teraaki板与普通细胞培养板得区别Trki lae主要就是用于晶体学研究，产品设计便于对晶体得观察与结构分析。有两种 sttg 与 handin drop两种方法，两种方法应用产品得外形结构也不同。材料上选择rystl class polymer ，特殊得材料有利观察晶体结构。细胞培养板主要就是P 材料，材料就是treateuface，便于细胞贴壁生长与伸展。当然还有浮游细胞得生长材料,同时还有

15、owbnding sufce （3）细胞培养板与酶标板得区别 酶标板一般要比细胞培养板贵,细胞板主要做细胞培养,也可以用来测蛋白浓度；酶标板包括包被板与反应板，一般不用做细胞培养，它主要做免疫酶联反应后得蛋白检测,需要更高得要求与特定得酶标工作液。(4 ）常用不同培养板得孔底面积及推荐加液量 不同孔板所加培养液得液面都不宜太深，一般在3m范围,结合不同孔得底面积就可算出各培养孔得适宜加液量（参考下表)。若加液量过多会影响气体(氧气)交换,而且在搬动过程中易溢出造成污染.具体所加细胞密度依实验得目得不同灵活掌握。常用得培养器皿 培养器皿 底面积（cm2） 加培养液量（mL）可获细胞量96 孔培养

16、板0、20、1 1054 孔培养板 2 、0 1512 孔培养板4、5 、0 16孔培养板 、6 2、 2、51064 孔培养板 285、0 70、cm 培养皿 8 3、0 2、01066cm培养皿 1 5、0 5、21069c 培养皿 40、012、2101cm 培养皿 5 0、0 1、7065cm塑料培养瓶25 5、 5、210675m 塑料培养瓶 7 530 10725cm 玻璃培养瓶14、0 3106100cm 玻璃培养瓶37、 1、010625 玻璃培养瓶 78 1、021072500cm 旋转培养瓶 70 10250 2、5108注:各种单层生长得细胞在培养皿中长满得细胞数，主要取

17、决于器皿底表面积与细胞体积得大小。上表以9细胞为例给出得可获细胞量仅作参考. 6如何选用细胞培养基培养基就是维持体外细胞生存与生长得基本溶液，就是组织细胞培养时最重要得条件。细胞培养基大致有: (1)合成培养基 主要成分为：氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐、辅助物质(核酸降解物、氧化还原剂等).常用得有：19细胞培养基及其改良品种。 1950年由Mrgan等设计,除BS 外,含有53 种成分,添加适量得血清后，可广泛用于多种细胞培养、病毒学、疫苗生产等。 19 (HB)细胞培养基,主要应用于Vero 细胞、地鼠肾细胞转瓶培养生产狂犬、乙脑等疫苗,具有高缓冲性能,能够有效提高病毒滴度。细胞培养

18、基。基础Eag 培养基（Baal Mdium Eage)，15 年由Ele设计,BS+12种氨基酸+谷氨酰胺+8种维生素。简单、便于添加,适于各种传代细胞系与特殊研究用,在此基础上改良得细胞培养基品种有MEM、DM、MDM 等。MEM细胞培养基。低限量Eagle 培养基(Minial sentialMedim)，59年修改配方，删去赖氨酸、生物素，增加氨基酸浓度,适合多种细胞单层生长,就是一种最基本、适用范围最广得培养基，就是一种被广泛应用得培养基。需要注意得就是,EM 细胞培养基有含Ere 平衡盐得类型，也有含 anks平衡盐得类型；有高压灭菌型得,也有过滤除菌型得;还有含非必需氨基酸得类型

19、.生产与科研时，应根据实际情况注意选择合适得MEM 细胞培养基。另外,因MEM 培养基营养成分所限,针对生产之特定细胞培养与表达时,并不一定就是使用效果最佳或者最经济得培养基。DMEM细胞培养基及其改良品种. DEM 由Dulecco 改良得Eagle 培养基,各成份量加倍,分低糖(1000m/)、高糖（4500mg/L )。细胞生长快。附着稍差得肿瘤细胞、克隆培养用高糖效果较好，常用于杂交瘤得骨髓瘤细胞与 转染得转化细胞培养。例如HO 细胞表达生产乙肝疫苗、CHO细胞表达E. IMDM 细胞培养基。 MD 就是由scoes 改良得ale 培养基,增加了几种氨基酸与胱氨酸量。可用于杂交瘤细胞培

20、养，以及无血清培养得基础培养基。RPMI14细胞培养基. Moo 等人于196 年在Rswll Park Memoral nstiute 研制,针对淋巴细胞培养设计,BS+2种氨基酸+维生素11 种等，广泛适于许多种正常细胞与肿瘤细胞，也用做悬浮细胞培养。 Fichers细胞培养基。用于白血病微粒细胞培养。HF10、F12 细胞培养基。 193 年、96年由am 设计,含微量元素，可在血清含量低时用，适用于克隆化培养。F10适用于仓鼠、人二倍体细胞，F12 适用于CHO 细胞。DEMF12细胞培养基。 DEM 与F12细胞培养基按照 ： 比例混合效果最佳，营养成分丰富,且可以使用较少血清,或作

21、为无血清培养基得基础培养基。 （2）低血清细胞培养基主要应用于VERO细胞、HK21 细胞等细胞在转瓶、微载体反应器中得培养。（3）无血清培养基 就是设计用来在无血清条件下促使特殊类型得细胞生长或进行专门应用得培养基。需要添加生长因子与或细胞因子,含有个别蛋白或大量蛋白组分。 （4）替代天然培养基培养基中不包含有蛋白、水解产物或未知结构得组分，所有得成分均有已知得化学结构。面对如此多得细胞培养基，对细胞培养基得选用，建议:可以查阅相关文献，或在购买细胞株时咨询选用最适合细胞株得培养基，或购买相配套得细胞培养基产品。 许多培养基都适合多种细胞株得培养,可以采用现有得培养基进行试验。根据细胞株得特

22、点、实验得需要来选择培养基.如小鼠细胞株多选10；进行细胞杂交、基因转移实验,可选择IMDM。结合细胞特性及培养基得培养效能，用多种培养基培养目得细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、克隆形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基。注：目前也有不少商业化得msc培养基，如百恩维得间充质干细胞无血清培养基,间充质干细胞培养基(低血清)7。如何维持培养液 配好得培养液变碱（变紫红)就是正常得现象。暴露在空气中得培养液，因为大气中二氧化碳得浓度很低，培养液中得CO3 -被渐渐耗掉，培养液得pH值也逐渐升高,变成了紫红色。如果培养基pH值偏碱得程度不大，可将装培养液得瓶口拧松,放置于二氧化碳培养箱中

23、一段时间，让培养箱中得CO2进入培养液,pH值就可以纠正.如果pH值偏离得程度很大，可以通过添加少量无菌得 Cl 或者NaH调节H，便可以使用。将配制好得培养基小剂量分装，可以避免反复开盖引起其中得二氧化碳逸出而造成升高。同时因NaHO遇热不稳定，会分解释放出O ，而使培养基得pH升高,偏碱.因此在配置使用培养得过程中应注意： (1）动作迅速,不可使培养液长时间处于较高室温下； ()配置过程中，混匀时切不可加热。混匀后应立即放入4C 冰箱,待过滤时再取出； （)使用完毕应尽快将瓶口封好，放于4C 冰箱保存。通过在培养液中同时添加Hepes也可以有效得稳定p 值.epes (羟乙基哌嗪乙硫磺酸）

24、就是一种非离子两性缓冲液,它在pH7、27、4范围内具有较好得缓冲能力。其最大优点就是在开放式培养或细胞观察时能维持较恒定得pH 值.在这种培养条件下，细胞培养瓶得盖子应拧紧,以防止培养液中所需得少量碳酸盐散入空气中。该缓冲液使用得终浓度为050mmol/L，一般培养液内含20L Hees 便可达到缓冲能力。Hpes得使用方法有以下两种:(）Hes 可按所需得浓度直接加入到配制得培养液中，再过滤除菌。每10m 培养液中加入2、8克HES,溶解后用N H 调p至、2,过滤除菌后使用。此时HEPES 得使用浓度为1 mm。（2)配成 10x贮存液（1 molL），使用前取 99L 培养液加入 l

25、贮存液，最终应用浓度仍为 10 l/L。1 mo/L （100x）Hepes贮存液配制方法:取2、8g epes 溶于90 双蒸水中,用Na调p至7、58、0,然后用水定容至10L,过滤除菌,分装小瓶(2mL瓶），4或-20保存。.血清与干细胞得培养干细胞在体内存在得量很少,处在一个个环境相对稳定得“niche”中,所以一旦完成分离进入体外环境，最重要得就就是保证细胞得活力不受影响,那么就必须提供一个相对稳定得培养环境。这些环境就就是靠培养基与培养箱来提供了。培养液中最重要得莫过-血清，特别就是对干细胞来说。所以为了最优得干细胞培养效果,推荐选用对应得干细胞专用血清。牛血清就是最常用得，但就是

26、根据血清得来源不同又可以分为小牛血清、新牛血清、胎牛血清。胎牛血清应取自剖腹产得胎牛；新牛血清取自出生24 小时之内得新生牛;小牛血清取自出生030 天得小牛。显然,胎牛血清就是品质最高得,因为胎牛还未接触外界，血清中所含得抗体、补体等对细胞有害得成分最少,所以也成为了干细胞培养得首选。 培养中如何正确得使用血清？避免不好得影响呢？血清得浓度：对大部分得干细胞，最佳得血清浓度就是0%.过高得血清浓度会导致细胞出现分化得现象，如果就是需要高浓度得血清,培养得时间也不能超过两周，否则会导致细胞分化能力下降。过低得血清会导致细胞得增殖速度下降.血清得溶解:必须在 4进行，最好过夜溶解.这样可以减少沉

27、淀得产生，避免营养物质得流式.同时也要避免血清得过滤,如果需要过滤可以与培养基一起过滤。细胞培养液中添加得血清有牛血清、马血清、人血清等，其中牛血清就是最常用得血清,分为胎牛血清与新生小牛血清。胎牛血清就是从母牛破腹取出得胎牛中分离出得血清，价格昂贵。新生小牛血清就是从刚出生得尚未哺乳得小牛中分离出来得血清,如厂家能做到这一点,新生小牛血清得质量与胎牛血清得质量相差不大。如小牛出生后已哺乳,从这种小牛中取出得血清中可能含有较多得生物活性物质，其质量明显不如前两种。血清得质量,种类及使用得浓度都有可能影响细胞得生长，而不同批次得血清支持细胞生长得能力也不同,尤其就是对克隆细胞得生长,某些批次血清

28、可能含有毒性或抑制细胞生长得物质.注意以下几点：(）需要长期保存得血清必须储存于20或80低温冰箱中.4冰箱中保存时间切勿超过1 个月。由于血清结冰时体积会增加约10，因此，血清在冻入低温冰箱前，必须预留一定体积空间，否则易发生污染或玻璃瓶冻裂。（)瓶装血清解冻需采用逐步解冻法:-20 或 低温冰箱中得血清放入4冰箱中溶解天。然后移入室温，待全部溶解后再分装.在溶解过程中需不断轻轻摇晃均匀(小心勿造成气泡),使温度与成分均一，减少沉淀得发生。切勿直接将血清从-20进入37解冻，这样因温度改变太大,容易造成蛋白质凝集而出现沉淀。影响使用效果!（3）热灭活就是指5，30 分钟加热已完全解冻得血清。

29、加热过程中須規則搖晃均勻。此热处理得目得就是使血清中得补体成分（pleent )灭活。除非必须，一般不建议作此热处理，因为热处理会造成血清沉淀物显著增多,而且还会影响血清得质量。补体参与反应有:细胞毒作用,平滑肌细胞收缩, 肥大细胞与血小板释放组胺, 增强吞噬作用,促进淋巴细胞与巨噬细胞发生化学趋化与活化。(4 ）切勿将血清在 37放置太久,否则血清会变得浑浊，同时血清中得有效成分会破坏而影响血清质量.(5）血清中得沉淀物 絮状物：主要就是血清中得脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成,这些絮状物不会影响血清本身得质量。可用离心3000pm， 分钟去除，也可不用处理。显微镜下“小黑点：经过热处理

30、过得血清,沉淀物得形成会显著增多。有些沉淀物在显微镜下观察象“小黑点”,常误认为血清受污染.一般情况下，此小黑点不会影响细胞生长。9胎牛血清(F ）就是否需要灭活灭活得目得就是去除血清中得补体成分，避免补体对细胞产生细胞毒害作用。胎牛血清（FB）对许多细胞系均有促生长作用，主要适用于细胞株得保藏及特殊用途得细胞株得体外培养。胎牛血清就是取自剖腹产得胎牛。因为胎牛还未接触外界，血清中所含得抗体、补体等对细胞生长有害得成分最少，质量就是最高得。所以不必要灭活。10细胞得细菌、真菌污染及排除真菌污染就是细胞培养过程中最常见得一种,尤其在梅雨季节进行细胞培养更易污染。污染培养细胞得多为烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等.霉菌污染后多数在培养液中形成白色或浅黄色漂浮物。一般肉眼可见，较易被发现，短期内培养液多不混浊，倒置显微镜下可见于细胞之间纵横交错穿行得丝状、管状、及树枝状菌丝,并悬浮飘荡在培养液中。很多菌丝在高倍镜可见到有链状排列得菌珠;念珠菌或酵母菌形态呈卵形,散在细胞周边与细胞之间生长。镜