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1、英文用聚合酶链反应方法自动测序DNA文章翻译用聚合酶链反应方法自动测序DNA 聚合酶链反应（PCR），为一种通过制备DNA模板来进行测序被用于的反应。原位程序直接测序PCR的产物通过双脱氧终止法是使用荧光团标记的测序引物发展的。合并序列反应液后，装入单个含有荧光的电泳泳道的序列分析仪中。DNA的目标缺乏一个在通用标记测序引物中掺入一个通用初级序列到PCR产物中的初级序列。用这种方法，噬菌体的基因组区域中一个351个碱基对的序列在电泳通道中的准确性 99。长1700个碱基对的未知序列，通过此过程测序，“PCR基因扩增”的策略相结合。1110个碱基组成的两条链的重叠区域只有两个单碱基发生错配。可以

2、用自动化的DNA序列高度多态性HLA-DQA-1（阿尔法）在人类基因组区域执行这种简单的方法进行分析。分离提取个人在一个月时的血液样本中的DNA，使用该PCR测序方法来模拟以明确基因型。 DNA出现双脱氧终止法的测序（1）鼓励科学家设计出合理策略，以应对大型测序项目。（2）显然，对于未来，AU-缩混高通量方法的开发是一个合理的焦点。为了实现这一目标，自动DNA序列分析已经通过组合基于荧光的检测用脱氧终止实现。（3）其他方面克隆测序项目，制备模板和测序运行重新动作。然而，复杂的人工操作还需要劳动力和技能。此外，操作类型需要为这些手工方法的模板的类型，因此，缺乏重复性性质有利于自动化操作。 聚合酶

3、链反应（PCR），在体外DNA上午plification方案（4）。已经被提出作为一种技术来制备自动DNA测序前模板（5,6）。之前自动化PCR过程一直是半自动化很大程度上是凭借其周期性，包括（a）变性。 PCR过程一直半自动化很大程度上是由凭借其周期性，组成的DNA模板（95C）所示，核糖核酸引物（b）杂交引物变性的模板（50C）中，（c）模板的复制（70C）催化Thermu.s水生的DNA聚合酶（Taq聚合酶）。在PCR技术中我们已结合DNA模板制备与用于自动DNA序列分析的基于荧光的方法（3,7）的DNA测序项目的多级自动更充分。材料和方法仪器与试剂对于热循环我们使用DNA热循环仪（Pe

4、rkin-Elmer公司，康涅狄格州Norwalk06859），一般根据以下循环：502分钟，702分钟20秒，和94，1分钟。用于DNA扩增，我们只用DNA扩增试剂盒的“基因扩增”生化试剂，其中包括10缓冲液，脱氧核苷三磷酸，和从水生生物中提取的Taq聚合酶（Perkin-Elmer公司中分离鲸鱼座，诺瓦克，CT06859）。轻质矿物油是从Sigma公司（圣路易斯，密苏里州63178追逐;cat.no. N-23516）购买;0.5毫升无菌管从罗宾斯科学购买（山景，CA 94043）。 基于荧光的DNA序列分析是用370A DNA测序仪（生命科技公司，福斯特城，加利福尼亚州94404，装配有

5、6的聚丙烯酰胺凝胶，并与制造商的运行1.3版本软件。聚丙烯酰胺凝胶制备的玻璃板从ABI购买。修改的T-DNA 7聚聚合酶（“测序酶”第1版，目录号0700）和终全国核苷酸混合物（cat。NO70714，70716，70718，70720）从美国购买（克利夫兰，OH 44122）。测序酶（20单位）稀释在含有50mmol二硫苏糖醇的，3.8mmol水中，和0.38毫摩尔/l的EDTA。冻干序列引物（-21 M13和M13反向，标有四个荧光，FAM，ROX，JOE和TMRA）为从ABI购买（8）。每个荧光标记通过将引物溶于10mmo1 / L的Tris缓冲液（pH8.0）中，含有1.0mmol/m

6、l的EDTA，得到0.8pmol/l的终浓度，并是在20保存。 从全血浆提取DNA使用ABI340A核酸提取（根据ABI用户公告。14，十月，1987）。人类DNA的1.7 kb的片段克隆到pGEM捐赠勿博士克雷格文特尔（NA-卫生，贝塞斯达，MD20892 tional研究院）。我们合成脱氧寡核苷酸勿将phosphora-midite方法（9），用381A DNA合成仪（ABN0.2，摩尔规模（0.2皮摩尔周期，vereion1.23软件;ABI用户公告没有。 7，八月，1986）与（2-O-氰基乙基）-phosphoramidites（ABN。寡核苷酸的纯化化墨盒从ABI购买。紫外吸收光谱

7、，我们使用一个8451A二极管阵列分光光度计（惠普，帕洛阿奥拓，CA94304）。程序 制备PCR引物，溶于氨水在57孵化20小时，有一半的引物（1.5毫升中NHG）通过寡核苷酸净化筒富集如别处所述（10）。（图1：101-109，L11,112，和114），制备蒸发至干的富集产物，收集溶解在1mL去离子水中的引物溶液（约5）。我们用分光光度法确定浓度，A假设在260的吸光度处指示为1.0，含有33wg的DNA。最终浓度为在0.5和1.0 umol/之间。过量收集制备同样的引物（图1：101，102，110，和113），得到最终浓度在20和50 umol之间。我们修改了上述人类基因组DNA的扩

8、增程序。应用两步骤我们扩增的HLA-DQA-1基因（11），以单链的形式同时包含了一个通用引物序列（图3）如下：浆2 ul的纯DNA溶解在10ul去离子中并添加100ul该基因组DNA溶液的PCR缓冲液（1反应缓冲液），包括0.02纳摩尔每个核糖核酸的，5.0皮摩尔的PCR引物112和20皮摩尔的PCR引物11。在95，加热3分钟，之后将样品经受30次热循环（55，2分钟;72，1分钟;94，1分），转移1.0mmol水相，含有3.0umol/ml114PCR引物，50pmol引物113，20个循环（50，2分钟;72，1.5分钟+3 秒;96，45秒），将所得水相物保存在-20。DNA测序。

9、对于DNA测序反应我们增加了3ul到PCR溶液，1.5ul有0.4pmol的标记溶液（FAM）-21 M13引物和最终序列缓冲液（10 mmol / L的tris-HCl缓冲液，pH值8.5，10mmol/l的MgCl2和50mmolNaCl ）。在90孵化5分钟后,在冰上冷却2分钟，轻轻离心，并加入2ul脱氧核糖-5-三磷酸混合物和1.5ul反应混合液，该混合液在37孵育5分钟，然后65加热10分钟。在适当的温度下将反应混合物手动转移到模块中。其他三个测序反应亦同时进行的（与TMRA，乔，ROX),脱氧核糖核酸和核糖核酸需要2倍的成分。4个测序反应冷却至4，用乙醇和6ul甲酰胺/ EDTA悬

10、浮，50mmol/ L的（5/1体积比），并进行凝胶电泳。结果与讨论DNA测序的双脱氧终止法是普遍接受，作为一种单链模板比双链更有效果的方法。因此，我们发明了一个基于荧光的测序方法。使用由不对称单链DNA产生的扩增（12）。利用不平等摩尔量的两种扩增引物，它是可能产生过量的单链DNA的选择链的直接测序。我们推出了插入PCR产物的单向通用引物序列（图2）通过使用的引物的浓度（111）包含-21 M13通用序列（14）。这个顺序包括定量的方法使我们能够使用市售的通用荧光引物序列检测DNA序列，由于最初缺乏通用序列。四等分PCR溶液（各3ul用于测序的引物，标有荧光素衍生物FAM和JOE，和6ul分

11、别用于衍生罗丹明引物推导（表3-6 TMRA和ROX）直接加入测序反应，不用纯化。在同一个自动序列分析仪检测下， 细菌的351个碱基对的PCR引物之间的准确率99（图4）。 我们应用这个排序的过程，而不同修饰离子（例如使用的不同的PCR引物等）以未知1.7-kb的序列插入GEM质粒（图5）。两条链扩增不对称。这些扩增用两个正向（101）和反向（102）的通用的M13引物（图1）在任何一个50:1或1:50比率。执行后，扩增，测序我们PCR产物使用：适当标记荧光的通用测序引物。用所得的各个序列信息链来合成两种新的PCR引物，从两端插入每个大约有300bp。这些新的引物，103和106，合成为包含

12、一个显示两个的通用引物序列，并用于M13引物的第二轮扩增与通用（102和101，分别地）。这些然后用适当标记的单向测序PCR产物。第二轮PCR测序，得到的序列信息增加300个碱基，是我们的“PCR基因行走”方法的第二个“台阶”。重叠的序列信息三方共计L100基地是经过四个步骤沿各股获得：图6）。在此只有两个单碱基对的位置L100区域不能被两条链的分析数据确定。 这种基因步行方法不需要一步一步的程序或合成的替代PCR引物。显著引物对引物变异性在传统的基因步行方法是可现的，大概产生于二次引发位点。这个PCR基因步行方法中引诱定做PCR引物的二次引发位点，没有显干扰的DNA测序描述。然而，基因行走与

13、原位策略一样受到限制：相对小的插入物（2 KB）中扩增取源于可以产生模板的数量和纯度。反转PCR（13,14）允许大于1.7 kb的未知DNA片段序列，这种未知的反转录方法仅需要一种引物序列，当线性DNA被分离，溶解和母与DNA连接酶，目标产物用凝胶电泳分离。 产品允许的“感觉”和“反义”将用于扩增。倒反转录PCR允许大的DNA片段测序，例如，1000个碱基的片段，这将降低整个克隆数量，克隆排序，并且克隆片段的分析。这些方法的实现可依赖自动化方法聚合酶链反应，制备凝胶电泳，分析自动DNA序列，通过一个液体处理机器人来执行，除其他东西外，还有限制性内切酶消化和连接反应。此自动化的策略将大大减少，

14、甚至消除需要克隆许多的序列模板。我们在这里开发的上面所述PCR序列过程的原位过程（6,6将是对大多数测序项目有吸引力的工程，通过其潜在的自动化性。在PCR放大（样品制备）和测序手动的步骤基本反应减少到处理小体积，1-10ul，可以委托给商用机器人（16）。自动化快速的DNA测序策略在促进人类在医学区域内研究基因组有重要应用（17,18）。这些测序应用程序在鉴别单核苷酸相对于正常的DNA，在这两个纯合子和杂合子序列（18）提供了必要的快速和可靠的检测。图7示表示这种类型的自动化的一个例子，在高度多态性I3LA-配合的测序能力林-1人类基因组内的基因座。我们开始分析对于HLA-DQA-1区域120

15、个碱基的序列，从血液中提取2ul的基因组DNA，已经贮存一个月。两步PCR扩增方法被应用（15）， HLA-DQA-1区域在图7所示，对重叠的对标志由两个问号平峰consis-帐篷核苷酸位置报道为多态12）。鉴于这种测序，这独立的随后被分配A1.2 / A1.3基因型（12）。我们的观察这些多态性核苷酸位点产生近等效峰值强度说明了我们的能够为标志自动1:1混合物等位基因与使用荧光序列分析。这种类型的自动分析系统可以应用遗传性疾病的研究，以及DNA指纹判断。我们选择了这两步PCR方法对人类DNA主要是为了减少在扩展那个过程中第二次PCR的形成，在原位DNA测序中不需要的PCR产品可能会产生不必要

16、的信号，测序之前单链PCR产物的凝胶纯化是非常有必要的。这两步PCR的方式也应产生1000-10 000倍的放大过程，对小于1ul的不纯样品提供了提供基因组序列测序的可能，导致全基因组的廿ssue。最后这些方法可以直接从全血或组织中提取DNA，进行自动重复DNA序列的分析。1. Sanger F, Nicklen S, Couleon AR. DNA sequencing初场chain-terminating inhibitors. Pros Natl Acad Sci USA1977;74:5463-7.2. Hood LE, Hunkapiller MW, Smith LM. Automa

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25、amplified cDNA.Proc Natl Acad 3ci U3A 1989;86:1919-23. 出师表两汉：诸葛亮先帝创业未半而中道崩殂，今天下三分，益州疲弊，此诚危急存亡之秋也。然侍卫之臣不懈于内，忠志之士忘身于外者，盖追先帝之殊遇，欲报之于陛下也。诚宜开张圣听，以光先帝遗德，恢弘志士之气，不宜妄自菲薄，引喻失义，以塞忠谏之路也。宫中府中，俱为一体；陟罚臧否，不宜异同。若有作奸犯科及为忠善者，宜付有司论其刑赏，以昭陛下平明之理；不宜偏私，使内外异法也。侍中、侍郎郭攸之、费祎、董允等，此皆良实，志虑忠纯，是以先帝简拔以遗陛下：愚以为宫中之事，事无大小，悉以咨之，然后施行，必能裨补

26、阙漏，有所广益。将军向宠，性行淑均，晓畅军事，试用于昔日，先帝称之曰“能”，是以众议举宠为督：愚以为营中之事，悉以咨之，必能使行阵和睦，优劣得所。 亲贤臣，远小人，此先汉所以兴隆也；亲小人，远贤臣，此后汉所以倾颓也。先帝在时，每与臣论此事，未尝不叹息痛恨于桓、灵也。侍中、尚书、长史、参军，此悉贞良死节之臣，愿陛下亲之、信之，则汉室之隆，可计日而待也。臣本布衣，躬耕于南阳，苟全性命于乱世，不求闻达于诸侯。先帝不以臣卑鄙，猥自枉屈，三顾臣于草庐之中，咨臣以当世之事，由是感激，遂许先帝以驱驰。后值倾覆，受任于败军之际，奉命于危难之间，尔来二十有一年矣。先帝知臣谨慎，故临崩寄臣以大事也。受命以来，夙夜忧叹，恐托付不效，以伤先帝之明；故五月渡泸，深入不毛。今南方已定，兵甲已足，当奖率三军，北定中原，庶竭驽钝，攘除奸凶，兴复汉室，还于旧都。此臣所以报先帝而忠陛下之职分也。至于斟酌损益，进尽忠言，则攸之、祎、允之任也。愿陛下托臣以讨贼兴复之效，不效，则治臣之罪，以告先帝之灵。若无兴德之言，则责攸之、祎、允等之慢，以彰其咎；陛下亦宜自谋，以咨诹善道，察纳雅言，深追先帝遗诏。臣不胜受恩感激。今当远离，临表涕零，不知所言。