掌叶半夏凝集素基因的克隆与分析农学院SRT1082.docx

1、掌叶半夏凝集素基因的克隆与分析农学院SRT1082附件一:编号SRT计划项目申请书项目名称：掌叶半夏凝集素基因的克隆与分析课题负责人： 申报单位： 专业名称： 指导教师： 职称： 申报日期： 2010年10月8 日 贵州大学教务处填写要求1、填写申请书前，请认真查阅贵州大学SRT计划项目管理办法的要求及有关规定。2、申请书按照要求，逐项认真填写，填写内容必须实事求是，表达明确严谨。空缺项要填“无”。3、格式要求：申报书中各项内容以Word文档格式填写；表格空间不足的，可以扩展或另附纸张；均用A4纸双面打印，于左侧装订成册。4、凡选择性栏目，请在相应提示符A、B、C等之上画。5、联系单位：教务处

2、实践科6、联系电话：8292071、3621020一、基本情况申请者姓名学号专业班级09级电话E-mail项目名称掌叶半夏凝集素基因的克隆与分析项目来源A、 自立项目 B、教师科研课题的子项目 C、其它项目类型A、实验研究 B、调查研究 C、软件制作 D、其他经费来源A、学校资助 B、学院资助 C、导师课题资助 D、企业资助经费额度3000 元指导教师姓名指导教师职称合作者姓名、学院、班级申请时间2010年10月8 日 完成时间2011年 12月 31日项目研究内容简介掌叶半夏(Pinellia pedatisecta Schott)是我国传统的中药材，掌叶半夏凝集素（掌叶半夏蛋白）是其主要药

3、效成分之一。掌叶半夏凝集素是一种从掌叶半夏块茎中分离纯化出来的植物蛋白，它是一种能与甘露糖专一性结合的植物凝集素，具有凝血、抗肿瘤、杀虫等重要的生理作用。本项目以贵州产掌叶半夏为研究材料，从掌叶半夏块茎中提取总RNA,采用RACE-PCR方法克隆掌叶半夏凝集素基因(Pinellia pedatisecta agglutinin, PPA)，测序得到PPA基因全长cDNA序列，并对该基因进行生物信息学分析。本研究为进一步利用基因工程方法大规模快速生产掌叶半夏蛋白，为充分开发利用这一药用蛋白奠定基础。二、立论依据2-1项目的研究意义（社会调查情况、文献查阅情况、现状分析及独特认识）掌叶半夏(Pin

4、ellia pedatisecta Schott) 为天南星科（Araceae）半夏属（Arisaema）多年生草本植物，又名虎掌，别名天南星、狗爪半夏、麻芋果、大三步跳等。掌叶半夏块茎近球形，类似半夏，但较大，径约4厘米。叶柄纤细柔弱，淡绿色，长4565厘米；叶片掌状分裂，小叶911片。肉穗花序顶生，花序柄与叶柄等长或稍长；佛焰苞淡绿色，披针形，下部筒状，长圆形，先端锐尖，长814厘米：花单性，无花被，雌雄同株；雄花着生在花序上端，雄蕊密集成圆筒状，长约6毫米，有香蕉香气；雌花着生在花序下部，贴生于苞片上，长约1.5厘米；花序先端附属物线状，长约9厘米，稍弯曲。浆果卵圆形，绿色，长45毫米，

5、径23毫米，内含种子1粒，花期67月。掌叶半夏野生于山坡、田野阴湿处，分布于河北和长江流域及西南各地，在朝鲜、日本也有分布。广西中药志中曰：味辛，性平，有毒” “治毒蛇咬伤及无名肿毒”，南京民间药草亦曰：“治肿毒”， 在我国已有千年的药用史。本品虽类似半夏，在江苏、河北、河南、山西等地作半夏使用，但就其药用价值及稀有上来说远胜半夏。研究表明，掌叶半夏凝集素的凝集活力为三叶半夏凝集素的4倍，由此可见掌叶半夏可谓半夏之王，药中极品。在我国民间，掌叶半夏主要以块茎入药，是中药天南星的主要来源之一,它具有凝血、镇咳、镇痛、抗溃疡、抗心律失常、降血脂、抗肿瘤、抗虫、镇静催眠、解毒抗炎等药理作用。掌叶半夏

6、的化学成分有掌叶半夏蛋白（掌叶半夏凝集素）、生物碱、半夏淀粉、甙类、甾醇类、氨基酸、挥发油、芳香族成分、有机酸类、黄酮类、鞣质以及多种微量元素等1-3。其中，掌叶半夏蛋白是掌叶半夏的主要药效成分之一，它具有与甘露糖及其集合物专一结合的性质，有凝血等多种重要的生物学活性4。近年来，科研人员对掌叶半夏的药理进行了深入研究，上海医科大学首先报道了应用掌叶半夏治疗宫颈癌，疗效确切5。孙光星等进一步研究发现其蛋白成分对小鼠S180肿瘤细胞有明显抑制作用6。其后的研究表明，掌叶半夏总蛋白对卵巢癌有选择杀伤作用7。最近的研究表明，掌叶半夏总蛋白对肝癌Bel-7402细胞生长具有明显抑制作用8。掌叶半夏凝集素

7、对兔、狗、小鼠的血红细胞具有较好的凝血作用。研究证实了掌叶半夏蛋白对同翅目类的害虫如豆蚜具有抗虫活性9。因此，掌叶半夏凝集素具有凝血、抗肿瘤、杀虫等重要的生理功能10，已成为近年来的研究热点。半夏蛋白的基因工程研究起步较晚，但也取得了一些成就，主要集中在三叶半夏蛋白基因的原核表达和转基因两个方面。复旦大学首次报道三叶半夏凝集素基因，并得到了其所编码的氨基酸序列。将半夏蛋白基因导入烟草中，得到了成功表达，重组的烟草叶片对同翅目类害虫如蚜虫有明显抗性。此外，也有将天南星科其它植物凝集素基因转入植物中的报道。研究掌叶半夏凝集素基因并将其用在转基因作物上，可以为人们培育更多的抗虫新品系。目前，从天然掌

8、叶半夏中获得掌叶半夏凝集素存在分离难度较大，纯化成本较高等困难，再加上野生掌叶半夏资源匮乏，品种退化等问题，所以，天然掌叶半夏凝集素不能满足药用需求。利用基因工程方法就能够快速、大规模地生产有活性的掌叶半夏凝集素，极大地满足国内外市场的需求，将彻底改变我国半夏类中药材供不应求的现状。本项目以贵州产掌叶半夏为材料，通过cDNA末端快速扩增技术（RACE-PCR）克隆贵州掌叶半夏凝集素基因(Pinellia pedatisecta agglutinin, PPA)，为基因工程大规模生产掌叶半夏蛋白，为开发出新型的抗癌药物以及培育转基因抗虫作物奠定基础。参考文献1 秦文娟，王瑞，温乐笙. 掌叶半夏化

9、学成分的研究.中草药，1995, 26 (1): 3-62 Chen JJ, Yang R, Wang MZ. Anticonvulsive action of Pinellia pedatisecta Schott extract prepared by ethanomodified supercritical CO2 extraction . Phytochemistry, 2007, 21(6): 449-4543 Han MH, Yang XW, Zhang M, Zhong GY. Phytochemical study of the rhizome of Pinellia tern

10、ata and quantification of phenylpropanoids in commercial Pinellia tuber by RP-LC. Chromatographia, 2006, 64(11-12): 647-6534 王克夷, 陶宗晋, 吴克佐, 等. 半夏凝集素的糖类结合专一性. 生物化学与生物物理学报, 1981, 13(4): 423-4265 上海第一医学院妇产科医院化学教研组掌叶半夏治疗子宫颈癌的研究. 上海医学，1978，(1)：136 孙光星，丁声颂，钱瑶君掌叶半夏总蛋白的提取、化学分析和对小鼠S-180瘤株的抑制作用. 上海医科大学学报，1992

11、, 19(1): l 7-197 朱铭伟，周抗美，丁声颂，等掌叶半夏总蛋白对卵巢癌细胞株及人脐造血细胞的作用上海医科大学学报，1999，26(6)：455-4588 黄必胜，李娟，陈科力半夏类药材不同提取物对人肝癌细胞Bel-7402的诱导凋亡作用中国医院药学杂志，2007，27(11): 1510-15129 粱永恒，刘小川，傅强两种半夏蛋白及凝集素抑制褐飞虱与番茄花叶病毒初报.湖南农业科学，2007, (2): 93-9510 李晓静，李志宏，王玉芹，等掌叶半夏研究概况中医药信息，2004，2l (1): 16-18三、研究方案3-1项目研究的目标、内容和拟解决的关键问题（一）项目研究目标

12、1克隆掌叶半夏凝集素基因PPA，得到该基因全长cDNA序列及编码的氨基酸序列。2对PPA基因进行生物信息学分析。3提供研究报告，发表相关论文。（二）项目研究内容 1. 提取掌叶半夏总RNA采集新鲜的掌叶半夏叶片，置于样品保存液（TaKaRa）中，-80冰箱保存。用SV总RNA提取试剂盒（Promega）提取总RNA，具体操作方法按照试剂盒说明书进行。将提取的RNA进行电泳检测其完整性，用紫外分光光度检测其纯度。 2. 用RACR-PCR扩增PPA基因全长cDNA根据GenBank中已报道的序列设计引物，用RACE-PCR方法扩增得到掌叶半夏凝集素基因PPA。用3-Full RACE Kit（T

13、aKaRa）进行PCR扩增，产物经切胶回收后与pMD18-T载体连接，转化E. coli DH5，进行菌落PCR鉴定得到阳性克隆，提取质粒，送宝生物公司测序，得到AMP的3端。用同样的方法，由5-Full RACE Kit（TaKaRa）扩增该基因5端，然后将该基因的3端和5端序列进行拼接后得到掌叶半夏凝集素基因的全长cDNA序列。3. 掌叶半夏凝集素基因的生物信息学分析利用NCBI、Swiss-Prot及生物软件对掌叶半夏凝集素基因编码的蛋白质进行同源性分析及功能结构域分析，利用同源建模来预测掌叶半夏蛋白的空间结构。（三）拟解决的关键问题 1. 提取的掌叶半夏总RNA的完整性和纯度要达到实验

14、要求。 2. 成功克隆到掌叶半夏凝集素基因的全长cDNA。3-2项目研究计划及预期进展（文献查阅、社会调查、方案设计、实验研究、数据处理、研制开发、撰写论文或研究报告、结题和答辩、项目鉴定、成果推广或论文发表、其他等，按所需执行环节填写）2010年10月12月 完成实验前的各项准备工作，采集掌叶半夏2011年1月4月 设计引物，掌叶半夏总RNA提取并检测其纯度和完整性2011年5月8月 用RACE-PCR方法扩增掌叶半夏凝集全长基因，并对该基因进行生物信息学分析2011年9月12月 对研究成果进行总结，撰写研究报告并发表相关论文3-3预期研究成果（成果研究形式：论文、设计、产品研制、软件开发、

15、专利、研究报告、调研报告、课件等，至少选其中一项填写）1. 获得贵州产掌叶半夏凝集素基因全长cDNA序列2. 获得贵州产掌叶半夏凝集素的氨基酸序列3. 完成研究报告，在国内期刊上发表论文1篇科研成果以论文的形式提供。四、项目的特色和创新点项目的特色：贵州独特的气候条件孕育了许多独特的中草药植物，本项目以贵州产掌叶半夏为材料，用分子生物学方法克隆掌叶半夏蛋白基因，为今后利用基因工程方法快速、大规模生产这种药用蛋白奠定基础，为单味中药开发提供思路和途径。项目创新点：本项目首次从贵州产掌叶半夏中克隆掌叶半夏凝集素全长基因，用现代分子生物学方法来研究传统中药，为进一步开发这种药用蛋白打下基础。五、研究

16、基础5-1已具备的条件、尚缺少的条件和拟解决的途径（包括现有的研究成果、利用教学实验室、科研实验室和实习基地等的计划与落实情况）本课题组依托指导教师所在的贵州山地农业病虫害重点实验室中的分子生物学实验室，在这个实验室进行本项目的各项实验研究工作。该实验室已配备了先进的实验仪器和设备，主要有：PCR仪、高速冷冻离心机、超低温冰箱、电泳及凝胶成像系统、高效液相色谱仪、蛋白层析系统、冷冻干燥机、酶标仪、超声波破碎仪、旋转蒸发器、人工气候箱、人工气候室等，为本项目的研究提供了有利的实验条件。申请者所在团队的人力资源配置合理，本项目的研究方法均已经被各成员熟练掌握；研究团队是一个思维活跃、具有良好合作与

17、奉献精神的研究集体。指导教师得到贵州省科技基金的资助(黔科合J20072040)研究半夏的生物活性物质，在三叶半夏和掌叶半夏分子生物学方面有着丰富的研究经验。因此，本项目能够顺利完成，实现各项研究指标。六、经费预算支 出 科 目金 额（元）计 算 根 据 及 理 由仪器设备费实验材料费1500原材料购置费，试剂耗材费，测序费等科研业务费1200能源动力费，查询费，差旅费，论文资料费等其它300其它不可预见费总计3000注:开支范围详见贵州大学SRT计划项目管理办法文件的第十三条。七、审查意见指导教师意见 指导教师签名： 年 月 日学院意见 负责人签名、公章： 年 月 日学校意见 负责人签名、公章： 年 月 日八、申请者承诺我保证上述填报内容的真实性。如果获得资助，我与本项目组成员将严格遵守学校的有关规定，在不影响课程学习的同时，保证项目研究工作的时间，并按计划认真开展研究工作，在项目研究过程中或结束时，接受学校对本项目的中期检查和结题验收，并按时提交工作总结和结题报告。 申请者（签名）： 年 月 日推 荐 书注：此表由具有副高以上职称的教师（非指导教师）填写