敲减心磷脂酰基转移酶1对肝细胞脂肪变和氧化应激的影响及其机制完整版.docx

1、敲减心磷脂酰基转移酶1对肝细胞脂肪变和氧化应激的影响及其机制完整版2020-2021敲减心磷脂酰基转移酶1对肝细胞脂肪变和氧化应激的影响及其机制(完整版)非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease , NAFLD)是指除 外酒精性和其他明确肝损伤因素所致的，以肝细胞内脂肪过度沉积为主要 特征的代谢综合征，包括非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver z NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis , NASH) 和NASH相关性肝纤维化，可进展为肝硬化、肝癌。氧化应激在NAFL

2、D 的发生、发展中发挥重要作用。氧化应激产物如活性氧会损伤核酸、蛋白 质和脂类，进而对细胞产生更大损伤。氧化应激也可诱导炎症因子的产生, 从而加重肝脏炎症，进一步促进肝纤维化的发生。因此，氧化应激是 NAFLD进展的中心环节。改善氧化应激是控制NAFLD进展的重要转折 点。近来硏究提示自噬可减轻氧化应激并延缓NAFLD的进展。据报道， NAFLD与肝脏自噬功能下调有关，而恢复自噬可逆转肝脂肪酸积累诱导 的胰岛素抵抗。心磷脂是定位于线粒体的磷脂，在维持线粒体结构和功能 方面起重要作用，对线粒体悄的发生，线粒体的融合、分裂，以及线粒体 呼吸链复合物的形成至关重要。心磷脂还参与自噬的整个过程，诱导功

3、能 失调的线粒体发生线粒体自噬。硏究表明，心磷脂酰基转移酶 1(Acyl-CoA : lysocardiolipin acyltransferase 1 , ALCAT1)可通过心磷 脂的病理性重塑来调控线粒体功能障碍和氧化应激。ALCAT1表达上调在 衰老相关疾病（如肥胖、2型糖尿病和心脑血管疾病等）的线粒体功能障碍 中起关键作用，靶向失活ALCAT1则可防止各种衰老相关疾病的发生。ALCAT1可通过加剧氧化应激反应并减弱丝氨酸/苏氨酸激酶 （serine/threonine kinase z AKT）-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin ,

4、mTOR）信号转导加剧肥厚性心肌病的病理进程。 然而，关于ALCAT1在NAFLD中作用的研究较少。因此，本硏究旨在通 过构建脂肪肝细胞模型,探讨ALCAT1对NAFLD发生、发展的影响及其 可能作用机制。材料与方法、硏究材料人正常肝细胞（L-02细胞；中国科学院），RPMI（Roswell Park Memorial Institute）-1640培养基（美国Gibco公司），荧光显微镜噢林巴斯仲国） 有限公司,细胞计数试剂盒8（cell counting kit-8 , CCK-8 ;日本同仁化 学研究所），SMARTMMLV反转录试剂盒（日本TaKaRa公司），SYBR绿 色实时荧光定量

5、PCR SuperMix试剂盒（美国ABI公司），IL-6 ELISA试剂 盒、TNF-a ELISA试剂盒（美国Prointech公司），活性氧ELISA试剂盒（上 海碧云天生物技术有限公司）、丙二醛ELISA试剂盒（上海碧云天生物技术 有限公司），4-疑基壬烯醛（4-hydroxynonenal , 4-HNE）ELISA试剂盒（上 海邦景实业有限公司），ALCAT1抗体（美国奥维亚系统生物公司），P-肌动 蛋白（p-actin）抗体、AKT抗体、磷酸化AKT抗体、mTOR抗体和酵母ATG6 同源物（Beclird）抗体（美国Cell Signaling Technology公司），微管相

6、关 蛋白 1 轻链 3（microtubule-associated protein 1 light chain 3 , LC3）- I、LC3-II（美国Novus公司）,羊抗兔二抗（美国Jackson公司）。二月旨肪肝细胞模型的建立和ALCAT1的表达鉴定将L-02细胞在添加10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL 连霉 素的RPMI-1640培养基中培养，培养条件为37。（2 ,体积分数为0.05的 CO2恒温、恒湿培养箱。铺96孑皈，每孔1 .Ox 104个细胞，以游离脂 肪酸（free fatty acids , FFA ;即亚油酸和棕植酸混合浓度为0.5 mmol/

7、L、 混合比例为2 : 1的混合物）处理细胞24 h ,建立脂肪肝细胞模型。以1% 牛血清白蛋白（bovine serum albumin , BSA）处理的L-02的细胞作为对 照。然后用浓度为1 mg/L的尼罗红孵育10 min。在543 nm激发波长 和598 nm发射波长下记录图像。在荧光显微镜下观察脂肪肝细胞模型L-02细胞脂质沉积情况。采用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测 ALCAT1在脂肪肝细胞模型中的表达情况。三、ALCAT1 siRNA 转染使用Lipofectamine2000将荧光素酰胺标记的ALCAT1小干扰 RNA（small interfering RNA, s

8、iRNA）瞬时转染 L-02 细胞，选择 3 种序列 的 ALCAT1 siRNA 片段，其中 ALCAT1 siRNAI 序列为 5 * -GCCUCAAAGCGAGUCUCAATT-3 ，（正向）和 5 * -UUGAGACUCGCUUUGAGGCTT-3（反向），ALCAT1 siRNA2 序歹I为 5 -CCACUUCAACUCCUCAUAUTT-3 ，（正向）和 5 1 -AUAUGAGGAGUUGAAGUGGTT-3（反向）,ALCAT1 siRNA3 序歹I为 5 -GCUGCAAGAGA-GAAUAUUUTT-3 （正向）和 5 -AAAUAUUCUCU-CUUGCAGCTT-

9、3Y反向）。以空白对照（无 siRNA 转染 的L-02细胞）和空载siRNA（以空载siRNA转染L-02细胞）作为阴性对照。 空载 siRNA 序列为 5-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3（正向）和 5 -ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3Y 反向）。将 1 pg 空载质粒和 ALCAT1 siRNA质粒悬浮于200 pL无血清Opti MEM培养基中分别形成siRNA/ 脂质体混合物。然后将混合物加入6孔板中，每孔1.0x104个细胞，转 染6 48 h ,用荧光显微镜观察转染效率。采用实时荧光定量PCR和蛋白 质印迹法测定3种ALCAT1 siRNA片段干预后

10、ALCAT1基因和蛋白质的 相对表达水平，选择干预效果最佳的ALCAT1 siRNA用于后续实验。四、实时荧光定量PCR检测去除细胞培养液后，PBS冲洗细胞3次，用TRIzol试剂从实验细胞中提 取总RNA ,用SMARTMMLV反转录试剂盒反转录合成cDNA。根据 说明书，用SYBR绿色实时荧光定量PCR SuperMix试剂盒检测目的基因 的表达。以P-actin基因作为管家基因。ALCAT1引物序列为5, -CACCCTACCTGT-GGCATTATTG-3 （正 向 ） 和 5 -CCATTCTTGTCCG-ATGGTTCAT-31 （反向）；S-actin 引物序列为 5 -CATG

11、TACGTTGCTATCC-AGGC-3 ，（ 正向） 和 5 *-CTCCTTAATGTCACGCA-CGAT-3Y 反向）。五、 透射电子显微镜下观察脂滴沉积、线粒体形态、自噬体结构胰酶消化细胞，PBS洗涤z 1 500 r/min（离心半径为14 cm）离心5 min , 弃上清液，加入1 mL 2.5%戊二醛溶液固定过夜，PBS清洗。1%饿酸溶 液4。（2固定2 h , PBS清洗,分别用50%、70%、80%、90%乙醇梯度 脱水各15 minz置于70%乙醇中过夜，用无水乙醇脱水，丙酮置换，包 埋、切片。采用醋酸双氧铀和醋酸铅染色,置于透射电子显微镜下观察脂 滴沉积、线粒体形态、自

12、噬体结构。六、 CCK-8检测细胞活力L-02细胞铺96孑掖,每孔1.0x104个细胞，置于37 C.体积分数为 0.05的CO2细胞培养箱中培养过夜。设立空白对照组、脂肪肝细胞模型 组、ALCAT1干预组。空白对照组以常规RPMI-1640培养基培养L-02细 胞48 h ;脂肪肝细胞模型组以空载siRNA质粒转染L-02细胞24 h ,然 后用含FFA培养基处理细胞24 h ; ALCAT1干预组先用ALCAT1 siRNA 转染细胞24 h ,然后以含FFA的培养基继续处理24 h。每孔加入10 pL CCK-8溶液，37。（2继续培养1 h。在酶联免疫检测仪450 nm波长处测 量各孔

13、的吸光度值。计算空白对照组、月旨肪肝细胞模型组和ALCAT1干预 组的细胞活力。七、 蛋白质印迹法采用蛋白质印迹法测定各组自噬体标志物LC3-H和Beclinl，以及mTOR 信号通路关键蛋白mTOR和磷酸化AKT的表达水平，具体方法如下。用 含1 mmol/L苯甲基磺酰氟的冷冻裂解缓冲液提取L-02细胞样品中的蛋 白质。然后用二嗟附甲酸（bicinchoninicacid , BCA）法检测试剂盒测定蛋 白质浓度。将每个样品中的等量蛋白质运用12% SDS-PAGE分离蛋白质, 然后转移至PVDF膜上。用5%牛奶在室温下封闭膜2 h ,加入第一抗体 在4 C孵育过夜，再加入HRP结合的山羊抗

14、鼠第二抗体在室温下孵育1 h，然后用电化学发光系统检测印迹。第一抗体为p-actin、ALCAT1. AKT、 磷酸化 AKT、mTOR、Beclinl、LC3- I 和 LC3-H（稀释比例均为 1 : 1 000）。 第二抗体为HRP结合的羊抗鼠血清（稀释比例为1 : 10 000）。八、 ELISA检测氧化应激产物和炎症因子的表达收集空白对照组、脂肪肝细胞模型组和ALCAT1干预组的细胞培养上清液, 使用丙二醛、4-HNE和活性氧ELISA试剂盒检测氧化应激产物丙二醛、 4-HNE和活性氧的表达，用IL-6和TNF-a ELISA试剂盒检测炎症因子 IL-6 和 TNF-cffi表达。九

15、、 统计学方法应用SPSS 22.0和GraphPad Prism 5.0软件进行统计学分析。呈正态分 布的计量资料以s表示，两组间比较采用独立样本t检验,多组间的比 较采用单因素方差分析。P0.05为差异有统计学意义。结果、ALCAT1在脂肪肝细胞模型中的表达情况尼罗红染色结果显示，FFA诱导建立的脂肪肝细胞模型组中L-02细胞呈 现明显的脂滴沉积（图1）。实时荧光定量PCR检测结果显示,脂肪肝细胞 模型组中ALCAT1的mRNA表达水平高于阴性对照组（9.260.83比1.020.12),差异有统计学意义(t = 9.82 , Pv0.05)。见图2 ,蛋白质印迹法检测结果显示，脂肪肝细胞

16、模型组中ALCAT1的蛋白质表达水平高于阴性对照组(0.350.02 比 0.170.01),差异有统计学意义(t 二 6.83 , P0.05)o图1免疫荧光显微镜下观察脂肪肝细胞模型细胞中脂滴沉积情况低倍放 大A阴性对照细胞核DAPI染色B阴性对照尼罗红染色C 阴性对照合成图片D月旨肪肝细胞模型细胞核DAPI染色E月旨肪 肝细胞模型尼罗红染色F月旨肪肝细胞模型合成图片二 ALCAT1 siRNA转染效果验证见表1和图3实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测结果显示ALCAT1siRNA*!、ALCAT1 siRNA2 和 ALCAT1 siRNA3 可不同程度地降低 L-02细胞中ALCAT

17、1在蛋白质和mRNA水平的表达，以ALCAT1 siRNA3的干预效果最佳。因此，选择ALCAT1 siRNA3用于后续实验。三、敲减ALCAT1对脂滴沉积、线粒体自噬和细胞活力的影响透射电子显微镜结果显示，脂肪肝细胞模型组和ALCAT1干预组的脂滴沉 积量均高于空白对照组(17.673.52和7.670.33比4.330.33),差异 均有统计学意义(t二3.76、7.07 , P均0.05) ; ALCAT1干预组的脂滴沉 积量低于脂肪肝细胞模型组(7.670.33比17.673.52)，差异有统计学意 义(t 二 2.82 z P0.05)o透射电子显微镜下(图4)观察细胞的超微结构，结

18、果表明,脂肪肝细胞模 型组线粒体形态发生改变，线粒体肿胀程度高于空白对照组，而ALCAT1 干预组肿胀线粒体数量少于脂肪肝细胞模型组；脂肪肝细胞模型组的自噬 体数量多于空白对照组，而ALCAT1干预组的自噬体数量多于脂肪肝细胞 模型组。图4透射电子显微镜下空白对照组、脂肪肝细胞模型组和ALCAT1干预组 细胞的超微结构醋酸双氧铀和醋酸铅双重染色A空白对照组低倍 放大B空白对照组中倍放大C空白对照组高倍放大D脂 肪肝细胞模型组低倍放大E月旨肪肝细胞模型组中倍放大F脂 肪肝细胞模型组高倍放大G ALCAT1干预组低倍放大H ALCAT1干预组 中倍放大I ALCAT1干预组 高倍放大 蛋白质印迹法

19、结果(图5和图6)显示，脂肪肝细胞模型组的LC3-H表达水 平高于空白对照组(0.43 0.01比0.280.02) z差异有统计学意义(t二7.32 , Pv0.05);脂肪肝细胞模型组的Beclinl表达水平与空白对照组比 较(0.930.05 比 0.980.05),差异无统计学意义(P0.05) ; ALCAT1 干 预组的LC3-H. Beclinl表达水平均高于脂肪肝细胞模型组(0.950.04 比0.420.01、2.070.06 比0.930.05)差异均有统计学意义(t二 13.30、 14.05 , P均0.05) ; ALCAT1干预组的LC3-H. Beclinl表达水

20、平均高 于空白对照组(0.950.04 比 0.280.02、2.070.06 比 0.980.05),差 异均有统计学意义(t = 15.63、13.02 , P均0.05)。CCK-8检测结果显示，脂肪肝细胞模型组、ALCAT1干预组的细胞活力均 低于空白对照组(68.682.65)%和(79.391.78)%比(100.002.72)%, 差异均有统计学意义(t二8.26、6.34 , Pv0.05)。ALCAT1干预组的细胞活 力高于脂肪肝细胞模型组(79.391.78)%比(68.682.65)%差异有统计 学意义(t 二 3.36, Pv0.05)。四、敲减ALCAT1对mTOR信

21、号通路关键蛋白表达的影响蛋白质印迹法检测结果(图7)显示，脂肪肝细胞模型组、ALCAT1干预组的 mTOR表达水平均低于空白对照组(1.440.02和0.740.01 t匕1.93 0.10),差异均有统计学意义(t 二4.83、12.04 , P 均0.05) , ALCAT1 干 预组mTOR的表达水平低于脂肪肝细胞模型组(0.740.01比1.44 0.02),差异有统计学意义(t = 32.14 , P0.05);脂肪肝细胞模型组、 ALCAT1干预组磷酸化AKT的表达水平均低于空白对照组(0.140.01和 0.070.01比0.280.01) , ALCAT1干预组磷酸化AKT的表

22、达水平低于 脂肪肝细胞模型组(0.070.01比0.140.01),差异均有统计学意义(t二 8.59、14.10、5.96 , P 均0.05)。五、敲减ALCAT1对氧化应激产物和炎症因子表达的影响见表2 , ELISA检测结果显示,脂肪肝细胞模型组和ALCAT1干预组的活 性氧、丙二醛、4-HNE、IL-6和TNF-O0勺表达水平均高于空白对照组，差 异均有统计学意义(t= 19.86、7.86、7.45、6.74、7.22、3.49、29.34、 5.53、8.02、3.03 肿均 0.05)。表2空白对照组、脂肪肝细胞模型组和ALCAT1干预组细胞中氧化应激产 物和炎症因子的表达水平

23、分析(土 s);r 11.丙.E(4.|XL(nfr/LIM*L)Hh（i讥）3I.TStO.JH1.47 sO.ISl.ttiO.232J.32 8S.SSWBIF311.44 t0.ItMii.-M-5.lsQ.4r3.40i5.16-I2J.70U.WAIATI f fH5 MiOLWil.W1斛占代l. 130. W24.WiM.i4 LOXf-ffi0.010.0i0.010.01“0l注；AII niBfWMlt|i；4ihi仆 IB;心4为白mis介索五汀为牌3环氏円了5与空白甘黑血比乩卩弋00仃和jBWlF憎咽槪仗织比牠f “ os -尢忆俺讨论二次打击学说是NAFLD发生、发

24、展的主要依据。肝细胞的脂滴沉积构成 策1次打击,包括线粒体功能异常、氧化应激和炎症反应在内的第2次打 击，导致NAFL进展为NASH。目前多采用以单不饱和脂肪酸和多不饱和 脂肪酸诱导甲胎蛋白阳性肝癌细胞系（HepG2）或L-02细胞构建NAFLD体 外细胞模型，来进一步硏究NAFLD的病理机制。本课题组的前期硏究 发现，0.5 mmol/L的亚油酸和棕槁酸混合物（混合比例为2 : 1）可建立较 优的NAFLD模型,本硏究选择此混合物建立脂肪肝细胞模型。NAFLD发病机制复杂，硏究表明，自噬与NAFLD的发生有关。自噬是 自噬溶酶体通过降解亚细胞器和大分子物质来实现物质再利用的过程,在 维持细胞

25、能量平衡中发挥重要作用。自噬参与体内许多病理生理过程z包 括细胞生长发育、组织损伤、重塑、衰老和癌症等,是NAFLD病程中的 种适应性反应,可通过防止过度脂肪堆积，清除受损的细胞器和有害物 质，消除过量的活性氧和功能紊乱的线粒体，改善线粒体功能,减少氧化 应激，从而控制炎症反应和肝纤维化进程。然而，自噬是一把双刃剑， 在应激条件下，机体可通过激活自噬,清除受损细胞器和有害产物来促进细胞存活,但在过度和持续压力诱导下的自噬可以诱导细胞凋亡。自噬与 氧化应激相互作用,可通过去除肝细胞受损线粒体减少活性氧的形成，但 当自噬被抑制时，受损的线粒体继续产生活性氧和有毒物质，形成恶性循 坏，进一步加重氧化

26、应激和细胞损伤。目前自噬与NAFLD之间的关系 仍存在争议。本硏究结果发现，脂肪肝细胞模型细胞中自噬小体数量増 加，自噬小体中有许多细胞器和脂滴,自噬生物标志物LC3-H表达增加, 活性氧、丙二醛和4-H NE表达増加。提示，NAFLD中存在线粒体肿胀， 氧化应激产物表达增加；FFA可以激活体外脂肪肝细胞自噬，但自噬不能 完全清除受损的细胞器（如线粒体等），不能发挥充分的保护作用，进而导 致NAFLD的进展。近年来,心磷脂代谢紊乱已成为硏究者关注的焦点。心磷脂易位于线粒 体外膜被证明是一种识别信号，其引导受损的线粒体发生自噬，这是控制 线粒体质量和细胞存活的关键步骤。病理性心磷脂重塑与许多衰老

27、相关 性疾病如糖尿病、肥胖、心血管疾病、癌症和神经退行性疾病等相关。ALCAT1通过增加心磷脂中二十二碳六烯酸和花生四烯酸等多不饱和脂肪 酸侧链的比例,促进心磷脂重塑。ALCAT1催化的心磷脂重塑可导致多 种代谢缺陷，包括氧化应激、线粒体DNA突变和线粒体功能障碍等。研究表明，ALCAT1在代谢性疾病和年龄相关疾病中的表达上调ALCAT1 的高表达可通过上调氧化应激和脂质过氧化加剧线粒体的氧化损伤。本硏 究结果显示，脂肪肝细胞中ALCAT1的表达增加，肿胀、畸形的线粒体增 加；敲减ALCAT1的表达，LC3-II和Beclinl等自噬生物标志物的表达水 平升高，自噬小体增加，畸形肿胀的线粒体减

28、少，氧化应激产物活性氧、 4-HNE表达下调。提示靶向的ALCAT1失活减轻了脂肪肝细胞氧化应激 和炎症反应。自噬的调节涉及多种信号通路，其中磷酸肌醇3-激酶/AKT/mTOR信号通 路是最经典的信号通路。mTOR是自噬的关键抑制剂。mTOR可调节细 胞生长和增殖，整合生长因子和营养信号,从而控制细胞功能，包括脂质 合成、线粒体活性和自噬。mTOR信号缺陷可导致肥胖和糖尿病等代谢 紊乱疾病。本硏究结果显示，脂肪肝细胞模型组、ALCAT1干预组的 mTOR表达水平均低于空白对照组，脂肪肝细胞模型组磷酸化AKT的表 达水平低于空白对照组,ALCAT1干预组磷酸化AKT的表达水平低于脂肪 肝细胞模型组,差异均有统计学意义。提示,敲减ALCAT1可致脂肪肝细 胞模型组中磷酸化AKT和mTOR表达进一步下降。敲减ALCAT1可能通 过増加自噬，减轻肝细胞脂肪变及其氧化应激和炎症反应。总之，本研究结果表明FFA混合物诱导脂肪肝细胞自噬增加，但其增加与 细胞损伤不成比例。ALCAT1能抑制细胞自噬，引起线粒体肿胀，导致氧 化应激和炎症反应。敲减ALCAT1通过抑制mTOR转录激活自噬，减轻 肝细胞脂肪变、氧化应激和炎症反应。ALCAT1可能是体外NAFLD肝细 胞脂肪变和氧化应激的潜在治疗靶点”但ALCAT1在在体NAFLD动物模 型和NAFLD患者中的作用有待进一步硏究。