病理组织学诊断检材的制备技术.docx

1、病理组织学诊断检材的制备技术病理组织学诊断检材的制备技术一、组织的固定 凡需要进行病理组织学检查的标本（器官或组织），于离体（活体或尸体）后，应尽快置放（浸泡）于装有足够量固定液的容器中固定。固定液量应为被固定标本体积的510倍。置放标本的容器大小视标本和固定液的体积而定，应适当大一些。临床科室切取的标本置放于容器中固定后，应尽快送交病理科继续固定。未能及时、充分固定的干涸或腐败标本不能再进行固定和用于制做切片。 常规固定液为4%中性甲醛（10%中性福尔马林），应预先多量配制贮存，以备随时使用。小标本的固定时间为46小时，大标本为1824小时或更久。 根据病理学特殊检查（特殊染色和组织化学染色

2、、免疫组织化学染色和原位核酸分子杂交染色、电镜观察等）的需要，应选用其他适宜的固定液进行固定参见后述的“固定液的常用种类和制备”。 器官、组织固定的基本方法 1食管、胃、肠、胆囊、膀胱等空腔器官：依规范方法剪开后，按其自然状态平铺于硬纸板上（重点暴露黏膜面或内表面的病变处），并用大头针将标本边缘处固定于纸板上，然后放入4%中性甲醛中固定（黏膜面或内表面朝向容器的液面，并覆盖薄层脱脂棉）。 2肝、脾：由器官背面，沿其长轴每间隔1.52.0cm纵向平行剖开，切成数片。将每片肝或脾轻轻地平放于装有4%中性甲醛的容器中，容器底面衬以脱脂棉。应避免标本弯曲和相互间的叠压。 3肺叶：放入固定液中的肺叶漂浮

3、于液面，需在肺表面覆盖薄层脱脂棉。必要时从支气管注入适量4%中性甲醛。 4肾：沿肾外缘中线朝肾门方向作一水平切面（深达于肾盏），再行固定。 5淋巴结：先用4%中性甲醛固定1小时后，再沿其长轴切成数片（厚2 3mm），继续固定。 6骨组织：先锯成小片（若是长骨应作横向锯片），在4%中性甲醛中固定24小时后，再进行脱钙。 7微小组织或液体沉淀物：先用拭纸或滤纸妥为包裹（需用大头针扎牢），然后放入专用小盒内进行中性4%甲醛固定，以防检材遗失。 8凡进入固定程序的标本必须连带其正确无误的病理检验号（病理号）。 多数固定液对人体有害，需要防护，必须在封闭的通风条件下进行操作。 组织块的切取和固定：由较大

4、标本切取用于制作切片的组织块（取材）时，应与标本的断面平行，组织块厚度一般为0.3 cm(不应0.5cm)，面积一般在11.511.5以内。切取组织块的形状，在充分包括肉眼病变的前提下尽量规则些（例如方形、矩形、三角形等）；由一个标本切取的多块组织的形状有所不同，便于蜡块与其相应切片的核对。 固定组织块的固定液量，一般应为组织块总体积的510倍以上。室内常温（25左右）下的固定时间为324小时；低温（4）下的固定时间应延长。固定组织块的容器要大一些。组织块固定期间需要间断地轻摇或搅动固定液以利于固定液的渗入。 常用固定液 14%中性甲醛（10%中性福尔马林）固定液 甲醛（40%） 100 ml

5、 无水磷酸氢二钠 6.5g 磷酸二氢钠 4.0g 蒸馏水 900ml 2乙醇甲醛（酒精福尔马林，AF）固定液 甲醛（40%） 100ml 95%乙醇 900ml 说明一般组织块经乙醇甲醛固定12小时后，即可移入95%乙醇内脱水。 3Carnoy固定液 无水乙醇 60ml 氯仿 30ml 冰醋酸 10ml 说明组织化学染色的常用固定液，组织经Carnoy液固定12小时后，即可移入无水乙醇中脱水。 4Zenker固定液 升汞 5.0g 重铬酸钾 2.5g 硫酸钠 1.0g 蒸馏水（加至） 100ml 说明配制本液时，先将升汞溶于蒸馏水中、加温至4050溶解后，再加入重铬酸钾，最后加入硫酸钠，贮存待

6、用。使用前加入5ml冰醋酸，混合。组织块需固定1224小时。切片染色前，需进行脱汞沉淀处理。 5Bouin固定液 饱和苦味酸水溶液（约1.22%） 75ml 甲醛（40%） 25ml 冰醋酸 5ml 说明本液临用时配制。组织块置于Bouin液固定1224小时即可（小块组织只需固定数小时）。经Bouin液固定的组织被苦味酸染成黄色，可用水洗涤12小时后进入乙醇脱水（兼脱色）。不必将组织中的黄色除净（残存于组织中的苦味酸无碍染色） 6过碘酸赖氨酸多聚甲醛固定液（PLP） A液：赖氨酸 1.827g 蒸馏水 50ml 0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4) 50ml B液：8%多聚甲醛水溶液 1

7、00ml 说明本液临用时配制：取A液3份、B液1份，混合后，加入过碘酸钠，使液体终浓度为2%。组织块在4下固定3654小时。本液对细胞结构和抗原性保存较好。 7B5（醋酸钠升汞甲醛）固定液 无水醋酸钠 1.25g 升汞 6.0g 蒸馏水 90ml 说明将以上物质混合、溶解，使用前加入甲醛10ml。本液多用于固定淋巴组织。染色前应进行脱汞沉淀处理。如不加甲醛称为B4固定液（蒸馏水为100 ml）。 8丙酮固定液 冷丙酮（4）固定液用于酶组织化学染色。细胞标本的免疫组化染色也常用冷丙酮固定10分钟。 二、常规石蜡包埋组织切片（常规切片）的制备 组织块依序进行：水洗，脱水，透明，浸蜡，包埋和切片。

8、组织切片制备及其HE染色过程中使用的乙醇、丙酮、二甲苯、石蜡等为 易燃、有毒物，必须专人管理，2m以内不得有明火，局部环境应有良好的通风和消防设施。 常规切片的手工操作（步骤次序和各步骤的持续时间） 1水洗：用流水冲洗已经固定的组织块30min。 2脱水（常温下） （1）乙醇甲醛（AF）液固定 60120min （2）80%乙醇 60120min （3）95%乙醇 60120min （4）95%乙醇 60120min （5）无水乙醇 60120min （6）无水乙醇 60120min （7）无水乙醇 60min 注意事项未经充分固定的组织不得进入脱水程序。用于脱水的试剂容积应为组织块总体积的5

9、10倍以上。自低浓度乙醇向高浓度乙醇逐级移进脱水。脱水试剂应及时过滤、更换（500ml乙醇可用于500个组织块脱水；加入硫酸铜的无水乙醇变蓝时，提示需要更换）。较大组织块的脱水时间长于较小者，应将两者分开进行脱水。组织置于无水乙醇内的时间不宜过长（以免硬化）。丙酮脱水性能强，会使组织块过缩、硬脆，不宜用以替代无水乙醇。 3透明 （1）二甲苯 20min （2）二甲苯 20min （3）二甲苯 20min 注意事项二甲苯的容积应为组织块总体积的510倍以上。组织块在二甲苯中透明的时间不宜过长（以防组织硬、脆），并依不同种类组织及其大小而异；组织呈现棕黄或暗红色透明即可。二甲苯应及时过滤、更换。组

10、织经二甲苯适度处理后不显透明时，常提示该组织的固定或脱水不充分，应查找原因并妥善处理。 4浸蜡 （1）石蜡（4550） 60min （2）石蜡（5658） 60min （3）石蜡（5658） 60min 注意事项熔化石蜡必须有专人负责，必须在熔蜡箱内或水浴中（70 ）进行，不得用明火加温。熔蜡的容积应为组织块总体积的510倍以上。组织块经二甲苯适度透明后方可转入浸蜡过程，应尽可能减少将透明后组织块表面的二甲苯带入熔蜡中。浸蜡时间适宜，过短时浸蜡不充分（组织过软），过长时组织硬脆。熔蜡应及时过滤、更换。 5包埋 （1）先将熔化的石蜡倾入包埋模具中，再用加热的弯曲钝头镊子轻轻夹取已经过浸蜡的组织块

11、，使组织块的最大面或被特别指定处的组织面向下埋入熔蜡中；应将组织块平正地置放于包埋模具底面的中央处；包埋于同一蜡块内的多块细小组织应彼此靠近并位于同一平面上；腔壁、皮肤和黏膜组织必须垂直包埋（立埋）。 （2）将与组织块相关的病理号小条置入包埋模具内熔蜡的一侧。 （3）待包埋模具内的熔蜡表面凝固后，即将模具移入冷水中加速凝固。 （4）从包埋模具中取出凝固的包埋蜡块（简称蜡快），用刀片去除组织块周围的过多石蜡（组织块周围保留12mm石蜡为宜）。将包埋蜡块修整成为规则的正方形或长方形。 （5）将病理号小条牢固地烙贴在蜡块一侧（编号应清晰可见）。 （6）把修整好的蜡块烙贴在支持器上，以备切片。 （7）

12、使用包埋机的方法按有关厂商的说明书操作。 （8）注意事项 应将组织块严格分件包埋。包埋时一定要首先认真核对组织块的病理号（包括亚号）、块数和取材医师对包埋面的要求，准确地包入相应的病理号小条。发生包埋差错时，必须立即与取材医师和病理科当班负责人取得联系，及时处置。 必须严防各种异物污染，勿将无关组织（包括缝线、纸屑或其他异物（尤其是硬质异物）埋入蜡块内。 包埋过程要操作迅速，以免组织块尚未埋妥前熔蜡凝固。 包埋用的熔蜡应纯净，熔点适宜。浸蜡用软蜡（熔点为4550），浸蜡、和包埋用蜡均用硬蜡（熔点为5658）。 包埋用熔蜡使用前应将先静置沉淀、过滤。 熔蜡时不得使用明火，以防燃烧。包埋用熔蜡的温

13、度应30。乙醇、二甲苯和熔蜡的容积，要大于组织块总体积的510倍以上，并应经常过滤，保持清洁；应经常检查试剂的浓度，及时更新。对于多量组织块，可按其大小分批进行处理；小块组织可适当缩短处理时间。 三、快速石蜡包埋组织切片的制备 煮沸固定切片法 1固定：切取大小适宜（厚度2mm）的组织块，尽快置入装有58ml 10%中性4甲醛的试管中煮沸1min，然后已入冷水中。 2脱水 （1）将已经煮沸固定的组织块取出，用刀片将其厚度修切至1.5mm，随即置入盛有58 ml丙酮的试管中，煮沸2 min，然后将丙酮倾弃。 （2）再向该试管中重新加入58 ml丙酮并煮沸2min。如此重复34次。 3浸蜡：将已经丙

14、酮脱水的组织块由试管中取出，用吸水纸去除其表面液体，随即置入7580熔化的石蜡中，待组织块下沉、不再出现气泡时（约需30s），即可包埋。 4包埋、切片和染色。 （1）用热镊子将预制的蜡块表面熔化，埋入已经浸蜡的组织块。 （2）待埋入组织块的蜡块表面凝固后，即用载玻片轻压蜡块表面片刻，使 蜡块表面平整。 （3）将蜡块置入冰水中，使其变硬。 （4）迅速切片，裱片后用吸水纸去除载玻片上的水分。 （5）将载玻片用火焰烘干（勿距火焰太近）。 （6）迅速进行HE染色。 5注意事项 （1）为了尽量缩短制片时间，必须预先作好有关准备工作，备齐取材用具、试管、固定液、丙酮、酒精灯、火柴（或其他引火器）、包埋用蜡

15、块、载玻片和染色试剂等，放在固定部位待用。 （2）全部制片过程一般在2025min内完成。 （3）制片后剩余组织块应作常规石蜡包埋切片染色，进一步诊断。 （4）含脂肪较多的组织，须经多次丙酮处理。 （5）用于组织固定、脱水、透明的试剂和浸蜡用的石蜡应及时过滤、更换。 （6）丙酮、乙醇、二甲苯等为易燃物，进行上述各项流程时，2m距离内不得存在明火。加温脱水和浸蜡过程必须应用隔水温箱，不得使用干烤箱操作。 超声波快速处理仪石蜡切片法（参照有关厂商的说明书操作）。 四、冷冻组织切片的制备 应用恒冷箱切片机制备切片：是目前最适用方法。恒冷箱切片机种类较多，应严格按有关厂商的说明书操作。用于切片的标本必

16、须未曾固定。 应用开放式冷冻切片机制备切片 1二氧化碳制冷切片 （1）将组织块放在冷冻台上，滴加OCT或羟甲基纤维素液于组织块周围（将组织块包埋），使固定在切片机上的切片刀接近组织块表面。 （2）间断开放液态二氧化碳桶的开关，喷冻组织块和切片刀，使组织块冻结和切片刀制冷。 （3）迅速移动切片刀进行切片：先将组织块修平，然后调节厚度至812m处进行切片。 （4）用毛笔将切片展开，贴附于载玻片上，稍干后，置于冷冻切片固定液中固定1min，随即进行HE染色。也可用毛笔将切片托入水中，再用玻璃弯针将切片移至染色皿中进行染色。 （5）组织块也可先在4%中性甲醛中煮沸固定1min，水洗后再行冷冻切片。 2

17、半导体致冷切片 （1）切片刀与持刀器之间要间隔一层云母片或硬纸片。将冷刀致冷器粘在刀面上。 （2）将组织冷冻台安装在半导体切片机上。 （3）将冷冻台和切片刀致冷器上的导线连接在控制台直流电源上（注意：正负电极不可接反）。 （4）连接致冷器的冷却水管并开始放水，然后开启电源；冷却水管中的水流量不宜过大，在使用过程不得断水。 （5）调整冷冻温度调节器，至切片刀和冷冻台呈现霜冻。 （6）将新鲜组织块或已固定的组织放在冷冻台中央，滴加水或OCT，或用水调成糊状的甲基纤维素于组织块周围（将组织块包埋）。 （7）待组织块冷冻适当后，进行切片。 （8）对于未经固定的新鲜组织，用毛笔将制作满意的切片展平，立即

18、裱贴于盖玻片或载玻片上，待冷冻的切片刚要融化时，立即将其置于冷冻切片固定液中固定1min。对于已经固定的组织块，可用毛笔将制作满意的切片托入水中，再用玻璃弯针将切片移至染色皿中进行染色。 （9）切片完毕后，先关闭电源，再关闭冷却水，待冰霜融化后擦干机器，加罩。 3甲醇致冷切片（按有关厂商的仪器说明书操作）。 4氯乙烷致冷切片 （1）将新鲜的或已经固定的组织块置于支持器中央，加少许水或OCT。 （2）连续喷射氯乙烷于组织块上，待组织块冻结后，改为间歇喷射，使冻结适度，立即切片。使用氯乙烷时应注意防火、防爆。 （3）进行组织切片的裱贴、固定和染色（与上述方法相同）。 注意事项 1制作冷冻切片所需的

19、试剂和设备等应处于随时可供使用状态。 2切取的组织块大小适宜（厚度1:30。 3脱钙过程中应不时摇动，多次更换脱钙液。 4脱钙时间不可过长。 5微波处理可加速脱钙过程。 6脱钙后的组织必须用流水充分冲洗。 7用于包埋的石蜡硬度适中（不要过软或过硬）。 六、苏木素伊红（HE）染色 HE染色是应用最广泛的组织病理学常规染色技术。 染色程序 1石蜡切片HE染色（常规HE染色） （1）二甲苯 510min （2）二甲苯 510min （3）无水乙醇 13min （4）无水乙醇 13min （5）95%乙醇 13min （6）95%乙醇 13min （7）80%乙醇 1min （8）蒸馏水 1min （

20、9）苏木素液染色 510min （10）流水洗去苏木素液 1min （11）1%盐酸-乙醇 13s （12）稍水洗 12s （13）返蓝（用温水或1%氨水等） 510s （14）流水冲洗 12min （15）蒸馏水洗 12min （16）0.5%伊红液染色 13min （17）蒸馏水稍洗 12s （18）80%乙醇 12s （19）95%乙醇 23min （20）95%乙醇 23min （21）无水乙醇 35min （22）无水乙醇 35min （23）石炭酸-二甲苯 35min （24）二甲苯 35min （25）二甲苯 35min （26）二甲苯 35min （27）中性树胶封固 注：（1

21、2）和（13）项可省去，但（14）的冲水时间需延长至1015min（细胞核显示更清晰）。 （23）项可用无水乙醇代替；北方地区可省略。 2冰冻切片HE染色 （1）冰冻切片固定 1030s （2）稍水洗 12s （3）苏木素液染色（60） 3060s （4）流水洗去苏木素液 510s （5）1%盐酸-乙醇 13s （6）稍水洗 12min （7）返蓝（用温水或1%氨水等） 510s （8）流水冲洗 1530s （9）0.5%伊红液染色 12min （10）蒸馏水稍洗 12min （11）80%乙醇 12min （12）95%乙醇 12min （13）无水乙醇 12min （14）无水乙醇 12m

22、in （15）石炭酸-二甲苯 23min （16）二甲苯 23min （17）二甲苯 23min （18）中性树胶封固 注：（7）和（8）项可省去，但（9）的冲水时间需延长至1015min（细胞核显示更清晰）。 （15）项可用无水乙醇代替；北方地区可省略。 染色结果：细胞核呈蓝色，细胞浆、肌纤维、胶原纤维和红细胞呈不同程度的红色。钙盐和细菌可呈蓝色或紫蓝色。 染色注意事项 1切片染色前，应彻底脱蜡。 2用含有升汞液体固定的组织，其切片染色前应先脱去汞盐： （1）石蜡切片脱蜡至水洗 （2）Lugol液 20min （3）流水冲洗 5min （4）95%乙醇 10min （5）水洗 1min （6

23、）5%次亚硫酸钠水溶液 5min （7）流水冲洗 5min （8）显微镜观察除汞满意后，转入HE染色 3脱除福尔马林色素（必要时）： （1）石蜡切片脱蜡至水洗 （2）1%NaOH(1ml)与80%乙醇（99ml）混合液 10min （3）流水冲洗 5min （4）转入HE染色 4严格执行HE染色流程，用显微镜控制细胞核的苏木素染色质量。HE染片应着色鲜艳，红、蓝分明，对比清晰。 5载玻片自二甲苯中取出后，应立即用洁净、光亮的盖玻片和稠度适宜的中性树胶湿封载玻片。封盖处内无气泡，外无溢胶。封片时必须进行操作人员和局部环境的二甲苯污染防护。不应将组织切片烤干或风干后再行封片。 6必须在载玻片的一端牢贴标签。标签上应印有病理科所在的医院名称。标签上应清楚显示有关的病理号及其亚号；标签上的病理号应准确无误，无涂改。 7制片完成后，技术人员应对切片与其相应的病理学检查记录单或取材工作记录单认真进行核对；确认无误后，将制备好的切片连同相关的活检申请单/活检记录单以及取材工作单等一并移交给有关的病理医师；交接双方经核对无误后，办理移交签字手续。 8石蜡切片-HE染色的优良率（甲