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1、微生物第五章34页word高中生物竞赛辅导讲义第五章 微生物的营养和培养基营养（或营养作用，nutrition）是指生物体从外部环境摄取其生命活动所必需的能量和物质，以满足其生长和繁殖需要的一种生理功能。所以，营养为一切生命活动提供了必需的物质基础，它是一切生命活动的起点。有了营养，才可以进一步进行代谢、生长和繁殖，并可能为人们提供种种有益的代谢产物。营养物（或营养，nutrient）则指具有营养功能的物质，在微生物学中，常常还包括光能这种非物质形式的能源在内。微生物的营养物可为它们正常生命活动提供结构物质、能量、代谢调节物质和良好的生理环境。熟悉微生物的营养知识，是研究和利用微生物的必要基础

2、，有了营养理论，就能更自觉和有目的地选用或设计符合微生物生理要求或有利于生产实践应用的培养基。第一节 微生物的六种营养要素微生物的培养基配方犹如人们的菜谱，新的种类是层出不穷的。仅据1930年MLevine等人在培养基汇编（ACompilationofCultureMedia）一书中收集的资料，就已达2500种。直至今天，其数目至少也有数万种。作为一个微生物学工作者，一定要在这浩如烟海的培养基配方中去寻找其中的要素亦即内在的本质，才能掌握微生物的营养规律。这正像人们努力探索宇宙的要素、物质的要素和色彩的要素等那样重要。现在知道，不论从元素水平还是从营养要素的水平来看，微生物的营养与摄食型的动物

3、（包括人类）和光合自养型的植物非常相似，它们之间存在着“营养上的统一性”（表5-1）。具体地说，微生物有六种营养要素，即碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐和水。一、碳源凡能提供微生物营养所需的碳元素（碳架）的营养源，称为碳源（carbonsource）。如把微生物作为一个整体来看，其可利用的碳源范围即碳源谱是极广的，这可从表5-2中看到。从碳源谱的大类来看，有有机碳源与无机碳源两大类，凡必须利用有机碳源的微生物，就是为数众多的异养微生物，凡能利用无机碳源的微生物，则是自养微生物（见本章第二节）。表5-2中已把碳源在元素水平上归为七种类型，其中第五类的“C”是假设的，至少目前还未发现单纯的碳元素

4、也可作为微生物的碳源。从另外六类来看，说明微生物能利用的碳源类型大大超过了动物界或植物界所能利用的碳化合物。因而有人认为，任何高明的有机化学家，只要他将其新合成的产品投放到自然界，在那里早就有相应的能破坏、利用它的微生物在等待着了。据报道，至今人类已发现的有机物已超过700万种，由此可见，微生物的碳源谱该是多么广！微生物的碳源谱虽然很广，但对异养微生物来说，其最适碳源则是“CHD”型。其中，糖类是最广泛利用的碳源，其次是醇类、有机酸类和脂类等。在糖类中，单糖胜于双糖和多糖，已糖胜于戊糖，葡萄糖、果糖胜于甘露糖、半乳糖；在多糖中，淀粉明显地优于纤维素或几丁质等纯多糖，纯多糖则优于琼脂等杂多糖和其

5、他聚合物（如木质素）。在有机碳源中，“CHON”和“CHONX”类虽也可利用，但在设计培养基时，尽量不要把这类主要用作氮源的化合物当作碳源，以免降格使用。上述碳源谱的广度是从整个微生物界的角度来讨论的。如果针对某一种具体微生物来看，则不同种的微生物其具体碳源利用范围是很悬殊的。例如，有人测试过Pseudomonascepacia（洋葱假单胞菌）的碳源竟有90种之多，而产甲烷菌的碳源则仅CO2和少数几种1C和2C化合物，一些甲烷氧化菌则仅局限于甲烷和甲醇两种。对异养微生物来说，它的碳源同时又充作能源，这时，可认为碳源是一种双功能的营养物。必须指出的是，异养细菌虽必须利用各种有机碳源，但不少种类尤

6、其是生长在动物的血液、组织和肠道中的致病微生物，还需要少量二氧化碳才能正常生长，因此，在培养它们时，常要提供10CO2（VV）；在其他好氧微生物生长时，如果用KOH除去CO2，也往往对其生长有所抑制。在选用一种具体培养基原料时，思想上切莫认为它是一种“纯粹的”要素，例如表5-3中的糖蜜是制糖工业中的一种副产品（过去是作为废液处理的），在发酵工业上一般把它当作“碳源”使用，但实际上，它除了具有较丰富的碳源外，其他成分极为复杂，几乎包含了所有的营养要素，只是其中各要素的相对比例不一定适合各种微生物的要求罢了（表5-3）。二、氮源凡能提供微生物生长繁殖所需氮元素的营养源，称为氮源（nitrogens

7、ource）。与碳源相似，微生物作为一个总体来说，能利用的氮源种类即氮源谱也是十分广泛的（表5-4）。微生物的氮源谱有许多特点。与碳源相似，微生物的氮源谱也大大广于动物或植物的。一般说来，异养微生物对氮源利用的顺序是：“NCHO”或“NCHOX”类优于“NH”类，更优于“NO”类，而最不易被利用的则是“N”类。从微生物所能利用的氮源种类来看，事实上存在着一个明显的界限：一部分微生物是不需要氨基酸作为氮源的，它们能把非氨基酸类的简单氮源（例如尿素、铵盐、硝酸盐和氮气）自行合成所需要的一切氨基酸，可称为“氨基酸自养型生物”，反之，凡需要从外界吸收现成的氨基酸作氮源的微生物，则可称“氨基酸异养型生物

8、”。所有的动物和大量的异养微生物是氨基酸异养型生物，而所有的绿色植物和很多的微生物都是氨基酸自养型生物。对微生物的氮源作这种分类具有重要的实践意义。因为人类和直接、间接为人类服务的动物都需要外界提供现成的氨基酸和蛋白质，而这些营养成分往往又是它们食物或饲料中较缺少的。为了充实人及动物的氨基酸营养，除了继续向绿色植物索取外，今后要更多地利用氨基酸自养型的微生物，让它们将人或动物原先无法利用的廉价的尿素、铵盐、硝酸盐或大气中的氮转化成菌体蛋白（SCP及食用菌等）或含氮的代谢产物（谷氨酸和其他氨基酸等），以丰富人类的食物资源。三、能源所谓能源（energysource），就是能为微生物的生命活动提供

9、最初能量来源的营养物或辐射能。由于各种异养微生物的能源就是其碳源，因此，微生物的能源谱就显得十分简单：能作化能自养微生物能源的物质都是一些还原态的无机物质，例如NH4+、NO2-、S、H2S、H2和Fe2+等，能氧化利用这些物质的微生物都是细菌，例如硝酸细菌、亚硝酸细菌、硫化细菌、硫细菌、氢细菌和铁细菌等。由于这类独特的化能自养营养类型在微生物中的存在，说明生物界的能源并非像过去普遍认为的只是直接或间接利用太阳能这一种方式而已。在提到能源时，很容易看到一种营养物常有一种以上营养要素功能的例子，即除单功能营养物外，还存在双功能、三功能营养物的情况。例如，辐射能是单功能的，还原态无机养料常是双功能

10、（如NH4+既是硝酸细菌的能源，又是其氮源）甚至还是三功能（能源、氮源、碳源）的营养物；有机物常有双功能或三功能作用，例如“NCHO”类营养物常是异养微生物的能源、碳源兼氮源。四、生长因子生长因子（growthfactor）是一类对微生物正常代谢必不可少且不能用简单的碳源或氮源自行合成的有机物。它的需要量一般很少。广义的生长因子除了维生素外，还包括碱基、卟啉及其衍生物、甾醇、胺类、C4C6的分枝或直链脂肪酸，以及需要量较大的氨基酸；而狭义的生长因子一般仅指维生素。生长因子虽是一种重要的营养要素，但它与碳源、氮源和能源不同，并非任何一种微生物都须从外界吸收的。各种微生物与生长因子的关系可分以下几

11、类：（1）生长因子自养型微生物（auxoautotrophs） 多数真菌、放线菌和不少细菌，如Ecoli（大肠杆菌）等都是不需要外界提供生长因子的生长因子自养型微生物。（2）生长因子异养型微生物（auxoheterotrophs） 它们需要多种生长因子，如乳酸细菌、各种动物致病菌、原生动物和支原体等（表5-5）。例如，一般的乳酸菌都需要多种维生素；许多微生物及其营养缺陷型（突变株）都需要不同的嘌呤、嘧啶碱基；Haemophilusinfluenzae（流感嗜血杆菌）需要卟啉及其衍生物作为其生长因子；支原体常需要甾醇；Haemophilusparahaemolyti-cus（副溶血嗜血菌）需要胺

12、类；一些瘤胃微生物需要C4C6分枝或直链脂肪酸；某些厌氧菌如Bacteroidesmelaninogenicus（产黑素拟杆菌）需要维生素K和氯高铁血红素，等等。生长因子异养型的微生物可用作维生素等生长因子生物测定时的试验菌。（3）生长因子过量合成微生物 有些微生物在其代谢活动中，会分泌出大量的维生素等生长因子，因此，它们可以作为维生素等的生产菌。最突出的例子是生产维生素B2的Eremothe-ciumashbya（阿舒假囊酵母，其B2产量可达2.5gL发酵液）和Ashbyagossypii（棉阿舒囊霉）；生产维生素B12的Propionibacteriumshermanii（谢氏丙酸杆菌）、

13、一些链霉菌（如Streptomycesolivaceus橄榄色链霉菌，3.3mgL，Sgriseus灰色链霉菌，0.3mgL）和产甲烷菌等。在配制微生物培养基时，如果配制的是天然培养基（详后），则可加入富含生长因子的原料酵母膏（yeastextract）、玉米浆（cornsteepliquor）、肝浸液（liverinfusion）、麦芽汁（maltextract）或其他新鲜的动植物组织浸液（表5-6，5-7）；如果配制的是组合培养基，则可加入复合维生素溶液（表5-8）。生长因子在微生物代谢中有着极其重要的作用，其中的维生素的生理功能可见表5-9。五、无机盐无机盐主要可为微生物提供除碳、氮源以

14、外的各种重要元素。凡是生长所需浓度在10-310-4molL范围内的元素，可称为大量元素，例如P、S、K、Mg、Ca、Na和Fe等；凡所需浓度在10-610-8molL范围内的元素，则称为微量元素，如Cu、Zn、Mn、Mo和Co等。Fe实际上是介于大量元素与微量元素间的，故放在两处均可。当然，这种区分带有人为的和相对的性质，对不同的微生物来说，往往会有很大差别，例如，革兰氏阴性细菌所需的Mg就要比革兰氏阳性细菌高10倍。无机盐的生理功能十分重要（见表5-10），现表解如下：在配制细菌培养基时，对于大量元素来说，可以加入有关化学试剂，其中首选的是K2HPO4及MgSO4，因为它们可提供四种需要量

15、最大的元素。对其他需要量少些的元素来说，因为在一般化学试剂、天然水、玻璃器皿或是其他天然成分中都以杂质等状态存在，故在配制一般培养基时就不必另行加入。但如果要配制研究营养代谢等的精细培养基，所用的玻璃器皿是硬质的，试剂是高纯度的，这时就须根据需要一一加入必要的微量元素（见表5-11）。六、水除了少数微生物如蓝细菌能利用水中的氢作为还原CO2时的还原剂外，其他微生物都不是利用水作为营养物质。即使如此，由于水在微生物的生命活动过程包括营养过程中的重要性，它仍应属于营养要素之一。在地球上迄今为止的所有生命系统，本质上都是以水为基础的系统。其原因就是水具有一系列为生命活动所必需的优良理化特性。首先，水

16、是一种最优良的溶剂。水分子具有偶极性质，从而使它成了许多物质的优良溶剂。它不仅是细胞外的营养物质运送进细胞内以及细胞内的代谢产物运送到细胞外的媒介，而且是细胞内几乎所有生物化学反应的媒介。醇、醛和酮类化合物能溶解于水，是由于水能与它们的极性基团间形成氢键的缘故。一些既有亲水基团又有疏水基团的分子，例如脂肪酸和极性脂类，则可以胶态分子团的形式分散在水中。其次，水可维持生物大分子结构的稳定，并参与某些重要的生物化学反应，有时，水则是某些反应的最终产物。此外，水还具有一系列重要的物理性质，从而保证了地球上一切生命活动的正常进行，例如：（1）高比热 由于水分子集团是通过分子间的氢键连接的，而破坏氢键需

17、要耗费额外的能量，因此，提高水温所需的热量比预期的要大。正因为水既能吸收热量又不使其本身的温度发生明显波动，所以能很好地调节生物体、生物环境以及整个地球的温度。（2）高气化热 水从液态变为气态所需的热量也比预期的要大。这就有利于微生物群体在发酵等生命活动中带走过多的热量，维持其较合适的生长温度。（3）高沸点 水分子在生物体合适的温度范围内（1540）是不会沸腾的，这是由于其分子间有氢键存在之故，不然的话，水在-80下即发生沸腾。（4）固态水（冰）的密度小于液态水 这对水体微生物的生命活动十分有利。由于以上的各种原因，因此水在生物体内的含量很高，在低等生物尤其微生物体内含量更高。第二节 微生物的

18、营养类型从前面讨论过的营养要素中，我们已初步接触到几种营养类型。由于各人认识的角度不同，营养类型的分类也显得十分纷繁，这为初学者的学习带来了困难。为此，我们先对各种营养类型的分类及其含义作一个概括（表5-12）。常见微生物营养类型的划分标准常常是复合的，较多的是以表5-12中的1和3来划分，也有用1、2和3一起来划分的（见表5-13）。在上述营养类型的分类中，其名称都是按能源和氢供体的顺序来表达的，例如，“光能无机营养型”就是指其能源是光，还原CO2时的氢供体是无机物；“化能有机营养型”的能源是有机物，氢供体是有机物。但是，有的学者也主张以能源和基本碳源来分，则上述两种营养类型就应分别称为“光

19、能自养型”和“化能异养型”。十分凑巧，因氢供体与基本碳源的性质一般是一致的，所以不管按什么原则分类，最后的结论和名称却是一致的。这就是为什么在教科书上经常把“光能无机营养型”与“光能自养型”混用，把“光能有机营养型”与“光能异养型”混用，“化能无机营养型”与“化能自养型”混用，以及“化能有机营养型”与“化能异养型”混用而看不出有什么差错的原因。从表5-13中可知，自养微生物这一常用名词是以它们的碳源为第一标准来划分的一种营养类型，这是一些能以无机物作为一切营养来源的微生物，即其碳源是二氧化碳，氢供体是还原性无机物，能源是日光能或还原性的无机物，并且不需要外界加入生长因子的微生物。但这仅是一种人

20、为的在概念上的划分。实际上，完全要满足这个定义的自养微生物是很少的，很多都是些过渡类型。因此，或许把自养微生物的定义改成“不依赖任何有机营养物即可正常生活的微生物”更为妥当。与此相对的是，异养微生物的定义可认为是：至少需要提供一种大量有机物才能满足其正常营养要求的微生物，即其碳源必须是有机物，氢供体是有机物，能源则可以利用氧化有机物或吸收日光能获得。这就可把具有固定少量二氧化碳能力的异养菌与自养菌相区分了。第三节 营养物质进入细胞的方式对绝大多数属于渗透营养型的微生物来说，营养物质通过细胞膜进入细胞的问题，是一个较复杂又很重要的生理学问题。据目前所知，细胞壁在营养物质运送上不起多大作用，仅简单

21、地排阻分子量过大（600Da）的溶质的进入，而具有磷脂双分子层和嵌合蛋白分子的细胞膜则是控制营养物进入和代谢产物排出的主要屏障。一般认为，细胞膜以四种方式控制物质的运送，即单纯扩散、促进扩散、主动运送和基团移位，其中尤以主动运送为最重要。它们间的主要差别可表解如下：一、单纯扩散单纯扩散（simplediffusion）又称被动运送（passivetransport）。细胞膜这层疏水性屏障可以通过物理扩散方式让许多小分子、非电离分子尤其是亲脂性的分子被动地通过，这就是单纯扩散。这类物质的种类不多，主要是氧、二氧化碳、乙醇和某些氨基酸分子，还没有发现过糖分子可通过单纯扩散而进入细胞的例子。单纯扩散

22、不是细胞获取营养物质的主要方式，因为细胞既不能通过它来选择必需的营养成分，也不能将稀溶液中的溶质分子进行逆浓度梯度运送，以满足细胞的需要。二、促进扩散促进扩散（facilitateddiffusion）与单纯扩散的一个主要差别，是在溶质的运送过程中，必须借助于膜上底物特异性载体蛋白（carrierprotein）的参与。由于参与的方式不同，载体蛋白还有许多其他名称，例如透性酶（permease）、移位酶（translocase）或移位蛋白（translocatorprotein）等。这种载体蛋白运送溶质的机制可能是由于其构象的改变：在膜的外侧时，它能与溶质分子结合，而在膜的内侧则可释放此溶质，

23、且不必提供任何能量。这类载体蛋白具有酶的性质，而且必须是诱导产生的。促进扩散只能把环境中浓度较高的分子加速扩散到细胞内，直至膜两侧的溶质浓度相等时为止，而决不能引起溶质的逆浓度梯度运送。因此，它只对生长在高营养物浓度下的微生物发挥作用。三、主动运送主动运送（activetransport）是微生物吸收营养物质的主要机制。其特点是它的特异性载体蛋白在运送溶质的过程中，需要提供能量（质子势、ATP等）而发生构象变化；同时，它可逆浓度梯度进行运送，从而使生活在低营养环境下的微生物能获得浓缩形式的营养物。由主动运送的营养物主要有无机离子、有机离子和一些糖类（例如乳糖、蜜二糖或葡萄糖）等。四、基团移位基

24、因移位（grouptranslocation）也是一种既需特异性载体蛋白又须耗能的运送方式，但溶质在运送前后会发生分子结构的变化，因而不同于上述的主动运送。基因移位主要用于运送葡萄糖、果糖、甘露糖、核苷酸、丁酸和腺嘌呤等物质。以葡萄糖为例，其特点是每输入一个葡萄糖分子，就要消耗一个ATP的能量。运送的机制是依靠磷酸转移酶系统，即磷酸烯醇式丙酮酸-己糖磷酸转移酶系统。其运送的步骤为：（1）热稳载体蛋白（HPr，heat-stablecarrierprotein）的激活细胞内高能化合物磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）的磷酸基团把HPr激活。HPr是一种低分子量的可溶性蛋白质，结合在细胞膜上，具有高能磷酸

25、载体的作用。酶1是一种可溶性的细胞质蛋白。（2）糖被磷酸化后运入膜内膜外环境中的糖先与外膜表面的酶2结合，再被转运到内膜表面。这时，糖被P-HPr上的磷酸激活，通过酶2的作用把糖-磷酸释放到细胞内。酶2是一种结合于细胞膜上的蛋白，它对底物具有特异性选择作用，因此细胞膜上可诱导出一系列与底物分子相应的酶2。基因移位在Escherichiacoli（大肠杆菌）和Staphylococcusaureus（金黄色葡萄球菌）中研究得较多。有关这四种运送方式的细节和形象化的解释可见图5-1和表5-14。第四节 培养基培养基（medium或culturemedium）是一种人工配制的、适合微生物生长繁殖或产

26、生代谢产物用的混合养料。因此任何培养基都应具备微生物所需要的六大营养要素，且其间的比例是合适的。任何培养基一旦配成，必须立即进行灭菌，否则很快引起杂菌丛生，并破坏其固有成分和性质。一、选用和设计培养基的原则和方法在微生物学研究和生产实践中，配制合适的培养基是一项最基本的工作。但是，许多工作不但要求我们去选用一种现成的培养基，而且还经常要求亲自去设计一种更合适的培养基，这就要求人们除了熟悉微生物的营养知识和规律外，还要有一套科学的设计培养基所应遵循的基本原则和方法。不巧的是，在一般的书籍中，这方面的内容不易找到。为此，这里根据自己的体会，提出了四个原则和四种方法，以作为总结这类工作的一个尝试。（

27、一）四个原则1目的明确在设计新培养基前，首先要明确配制该培养基的目的，例如，要培养何菌？获何产物？用于实验室作科学研究还是用于大规模的发酵生产？作生产中的“种子”，还是用于发酵？等等。如果某培养基将用于实验室研究，则一般不必过多地计较其成本。但必须明确对该培养基是作一般培养用，还是作精细的生理、代谢或遗传等研究用。如属前者，可尽量按天然培养基的要求来设计，如系后者，则主要应考虑设计一种组合培养基（即“合成培养基”，详后）。拟培养的微生物对象也十分重要。不同大类的微生物，对培养基中碳源与氮源间的比例、pH的高低、渗透压的大小、生长因子的有无以及特殊成分的添加等都要作相应的考虑。如果某培养基将用于

28、大规模的发酵生产上，则用作“种子”的培养基，一般其营养成分宜丰富些，尤其氮源的含量应较高（即CN比低）；相反，如拟用作大量生产代谢产物的发酵培养基，则从总体来说，它的氮源含量宜比“种子”培养基稍低（即CN比高）。除了对不同类型的微生物应考虑其特定条件外，在设计发酵培养基时，还应特别考虑到生产的代谢产物是主流代谢产物，或是次生代谢产物。如属主流代谢产物（一般指通过主要代谢途径产生的那些结构较简单、产量较高、价值较低的降解产物），则生产不含氮的有机酸或醇类时，培养基中所含的碳源比例自然要比生产含氮的氨基酸类产物时高，反之，生产氨基酸类含氮量高的代谢产物时，氮源的比例就应高些。如属生产次生代谢产物（

29、一般是指通过复杂合成途径产生的那些结构复杂、产量低、价值高的合成产物），例如抗生素、维生素或赤霉素等，则还要考虑是否在其中加入特殊元素（如维生素B12中的Co）或特定前体物质（如生产苄青霉素时加入的苯乙酸）。2营养协调通过菌体成分的分析，可知道在各种微生物的细胞中，其不同成分或元素间是有较稳定比例的（表5-15）；另外，在异养微生物中，碳源还兼作能源，而能源的需要量是很大的。这两点就是确定培养基中各种营养要素的数量和比例的重要依据。此外，如果设计的培养基是用于生产大量代谢产物的，那么，它所需耗费的营养物的量也要在设计培养基时予以充分考虑。业已清楚，在大多数化能异养菌的培养基中，各营养要素间在量

30、上的比例大体符合以下十倍序列的递减规律：要素：H2OC+能源N源P、SK、Mg生长因子含量：（10-1）（10-2）（10-3）（10-4）（10-5）（10-6）从中可以看出：水分含量最高，这是因为微生物多数是水生性的，它们的aw值（详后）高；碳源的含量其次，这是因为碳元素在任何细胞有机物中都是含量最高的，同时，碳源还兼有能源的作用，而能源的消耗量是很大的；N、P、S、K、Mg的含量依次递减，这是与它们分别在细胞组分中的含量是相符的；生长因子的量最少，这是与它的生理功能相一致的。在上述序列中，碳源与氮源间的相对比例即碳氮比（CN比），它有着十分重要的意义。严格地讲，CN比是指在微生物培养基中

31、所含的碳源中碳原子的摩尔数与氮源中氮原子的摩尔数之比，而不能简单地理解为某碳源的重量与某氮源的重量之比。这是因为，不同种类的碳源或氮源，其中的含碳量或含氮量差别很大，从以下五种常用氮源的含氮量占总重量的比例即可明白其中的道理：NH3（含氮量82）CO（NH2）2（46）NH4NO3（35）（NH4）2CO3（29.2）（NH4）2SO4（21）这说明在同样重量时，在以上各氮源中含氮量以氨为最高，尿素次之，硝酸铵和碳酸铵更次之，而硫酸铵则最低。据记载，一般培养基的CN比为1000.52；谷氨酸发酵培养基为1001121，放线菌蛋白酶培养基为1001020。3物理化学条件适宜（1）pH 各大类微生物一般都有它们合适的生长pH范围。细菌的最适pH在7.08.0间，放线菌在7.58.5间，酵母菌在3.86.0间，而霉菌则在4.05.8间。对于具体的微生物种来说，它们都有特定的最适pH范围，有时可大大突破上述一般界限（见第七章第三节）。由于在微生物生长繁殖过程中会产生引起培养基pH改变的代谢产物，尤其是不少的微生物有很强的产酸能力，如不适当地加以调节，就会抑制甚至杀死其自身，因而在设计它们的培养基时，就要考虑到培养基的pH调节能力。这种通过培养基内在成分发挥的调节作用，就是pH的内源调节。内源调节主要有以下两种方法：第一种是采用磷酸缓冲液的方式。调节K2HPO4