天然药物青蒿素的合成及研究进展文档格式.docx

1、我国对青蒿素的研究始于60年代中期，在周总理亲 自批示下，先后组织60多个科研单位和500多员研究人员坚持不懈的深入研究， 研究项目包括：新抗疟药物研治、 驱蚊药物及措施等，其中包括从中草药中寻找 新型药物及对其进行药效筛选。1973年，中国中医研究院中药研究所、山东省 中医药研究所、云南省药物研究所分用乙醚、丙酮和石油醚从青蒿中提取到了抗 疟有效成份青蒿素I。并于1976年通过化学反应、光谱数据和x射线单晶衍射方法 证明其为一种含有过氧基的新型倍半萜内酯，分子式为 c H : Os，其分子结构 如下图所示2，其绝对构型由刘静明等通过旋光色散和氧原子的反常散射测定3。 2.青蒿素的来源目前青蒿

2、素的获得主要靠从青蒿中直接提取。青蒿虽在世界各地均有分布，但青蒿素的含量随产地的不同差别很大。除我国少数地区外，绝大多数地区生长 的青蒿中青蒿素的含量都很低（wi%o） 4。在我国，青蒿中青蒿素的含量从南 到北基本呈递减趋势。桂、黔、川青蒿资源丰富，青蒿素含量也较高，四川酉阳 地区黄花蒿的青蒿素含量平均为 0.885 3% 5。越南、印度等国家也有少量青 蒿资源。青蒿中青蒿素含量偏低，提取成本高，导致青蒿素价格居高不下，难以 满足市场需要。3.青蒿素的全合成青蒿素是具有过氧基团的新型倍半萜内酯，其分子式为 C15H22 O5 ，相对分子质量为 282.335 。化学合成青蒿素这一复杂的天然分子

3、是有机化学家所面 临的挑战。 Schmid6 等 1983 年报道了一条应用关键化合物烯醇醚在低温下的 光氧化反应引进过氧基的全合成路线，反应以 （-）-2- 异薄荷醇为原料，保留原料 中的六元环， 环上三条侧链烷基化，形成中间体，最后环合成含过氧桥的倍半萜 内酯。1986 年, 徐杏祥 7等人报道了青蒿素的全合成途径 8-10,其合成以 R（+）- 香草醛为原料 ,经十几步合成青蒿素 , 合成途径如图 2 所示。还有多种以不同原料 为出发点进行青蒿素一类物的化学合成研究。 1994年,Zhou和Xu11综述了国内外青蒿素全合成的研究进展。青蒿素全合成研究虽已取得一些明显的进展 ,但由于反应过

4、程繁琐，反应过程中构型反转，副产物众多，原料昂贵等问题，使得 全合成方法有成本高， 难合成，产率低等缺点， 到目前尚未显示出商业的可行性。图2青蒿素览学合成途轻3.青蒿素的组织的培养利用植物组织培养来生产青蒿素是目前青蒿素研究的另一热点 ，它为大规模生产青蒿素的提供了可能。目前在青篙芽、青篙毛状根和青篙发根农杆菌等培养 体系中进行的青篙素合成技术极有可能被应用于工业生产。a.青蒿芽Ferreira等12在青蒿芽的培养过程中，检测到青蒿素的存在，并在诱导生根的青蒿芽中获得了高含量的青蒿素， 约为干重的0.02% ;改进培养基中的 各种金属离子和复合维生素对芽中青蒿素的合成影响不明显， 但添加赤霉

5、素使得 芽中青蒿素的含量提高了 34倍。Woerdenbag等13在诱导的青蒿芽培养 物中也检测到了青蒿素，并发现赤酶素和水解蛋白对芽中青蒿素的合成具有强刺 激作用，为培植青蒿芽并提取青蒿素提供了依据。国内有耿飒、叶和春、张龙等 14-16 用不同发育阶段的的花蕾和花器官为外植体诱导丛生芽，并通过诱导 丛生芽研究青蒿素生物合成相关因素， 结果发现转基因青蒿中青蒿素含量相应提 高。b.青蒿毛状根郭晨等17,18 在硫化床生物反应器中培养青蒿毛状根取得了较好的效果， 进一步探索不同培养方式以及生物反应器形式将为今后反应器的的商业化应用 奠定基础。研究了不同温度（1535 C）对青蒿毛状根生长和青蒿

6、素生物合成 的影响，发现25 C有利于毛状根生长，30 C促进了青蒿素生物合成。通过温度 改变的二步培养技术（培养前20 d温度控制在25 C,后10 d温度提高到30 C）, 青蒿素的产量得到明显提高，高于在恒温培养时（25 C或30 C）的结果。刘春 朝等19对影响青蒿毛状根生长及青蒿素合成的培养条件的如温度和光照等也 进行了研究，发现在适宜光照、温度等条件下获得青蒿素的产量比原来有所提高。c.青蒿发根农杆菌培养研究发现发根与正常的未转化根是有差异的； 发现离体培养的青蒿不定芽上 发根对青蒿素生物合成有促进作用；天然生长的青蒿株根中不含青蒿素。因此， 在大量培养发根生产青蒿素时，发根生长停

7、止后就可以立即收获并提取青蒿素。 蔡国琴等 20用发根农杆菌转化药用植物青蒿并建立了发根体外培养系统，通 过Southern杂交、NPT U酶的检测证实了 T-DNA转移并整合到植物的基因组上。 刘本叶、叶和春等21从 747 条发根农杆菌 ATCC15834 转化的青蒿株系 025 发根中，筛选出 7个生长较快的发根系， 这 7 个系在生长速度和青蒿素含量上均 有显著差异，其中发根系HR-9青蒿素收率最高，达到每月33.25 mg /L。青蒿 发根的生长量和青蒿素含量极显著高于未转化跟和愈伤组织。 青蒿发根在分批培 养中没有明显的迟滞期，接种后第 7 d 进入指数生长期，第 11 d 生长最

8、快，第20 d 进入稳定期。青蒿发根中青蒿素含量呈明显的“与生长相关”特性，在指数生 长期，青蒿素含量缓慢下降，生长速度减缓后，青蒿素含量上升，发根生长停止 后，继续延长培养时间，青蒿素含量也不再提高。在分批培养中，青蒿发根适宜 的培养时间为 21 d 。d.青蒿素的生物反应器培养青蒿植物组织培养技术的应用， 必须有较好的培养体系， 有相应的培养设备 才能实现工业生产。 气升式反应器虽可改善培养基中氧传递， 但长期浸泡易产生 玻璃化现象，迄今尚无合理对策，只有解决了这个问题，才能实现工业化生产。Fulzele等22 利用1 L生物反应器进行青蒿芽的悬浮培养，经过 30 d的分批 培养可获得再生

9、的植株，生物量提高了 45倍。Park等利用2 L的长方形气提 式生物反应器培养青蒿芽， 经过 4 周的培养， 培养物增殖 8 倍，获得的青蒿芽可 长出不定根。刘春朝等 23,24研究了适用于青蒿发根及芽培养的生物反应器 及控技术，利用超声雾化生物反应器、 自制流化床生物反应器、 自制气升式内环 流生物反应器进行青蒿毛状根多层培养生产青蒿素， 在一定条件和工艺下， 产量 有所提高。 雾化反应器中液体培养基生成雾滴还存在问题， 且青蒿器官生长的表 面液膜更新也较慢， 所以目前离真正的工业化大生产还有一段距离， 但科学工作 者应该朝着这一方向去努力，以期能在提高青蒿素生物合成产量上有所作为。4.青

10、蒿素的生物合成路线a.青蒿素前体生物合成 青蒿素生物合成途径中的中间体的研究，是青蒿素生物合成代谢的重要途径。目前，已探测到与青蒿素生物合成有关的中间体有十几种左右， 其中最为重 要的为青蒿酸、青蒿素B、脱氢青蒿素、杜松烯等。实际上青蒿素合成途径是植 物固醇合成的分支途径。汪猷等 25在青蒿的匀浆中放入放射标记的青蒿酸， 结果在青蒿素和青蒿素 B 中检测到放射性标记， 认为在青蒿中由 MVA 合成青蒿 素和青蒿素 B 的过程中，青蒿酸是一种重要的中间产物，并通过植物激素调节 可以合成青蒿素的黄花蒿培养细胞中， 缺乏青蒿素合成前体是青蒿素合成量低的 重要原因。因而大力开展青蒿素合成前体的研究是提

11、高青蒿素合成产量的关键。 近年来，出现了以二氢青蒿素为原料的两种合成路线： 二氢青蒿素与三氟乙酸酐 反应制得三氟乙酰基二氢青蒿素， 不经分离直接与酚类反应； 二氢青蒿素与乙酸 酐反应制得乙酰基二氢青蒿素后再与酚类反应。 2003 年， Abdin 等 26证明 了青蒿酸是青蒿素合成的中间体， 发现 11，13二氢青蒿酸 26 能转化为青蒿素。 Martin 等27用紫穗二烯合酶催化法呢基焦磷酸（ FPP ）环化制得了青蒿酸生 物合成的前体紫穗二烯 35.b.青蒿素生物合成 青蒿素合成前体和中间体的大量研究为青蒿素合成生物途径提供了丰富的 素材。近年来研究表明，青蒿素的生物合成途径属于植物类异戊

12、二烯代谢途径 （图 3）。植物类异戊二烯的生物合成至少存在 2 条途径，即甲羟戊酸途径 （mevalonic acid，MVA）和丙酮酸/磷酸甘油醛途径（deoxyxylulose 5-phosphate ， DXP）。青 蒿素等倍半萜类的生物合成途径属于 MVA 途径，该途径在细胞质中进行。根据 目前离体转化、 活体转化及同位素饲喂试验结果， 青蒿素的生物合成途径可能包 括 2 种方式，见图 4、 5。其中，第 1 种青蒿酸氧化途径可能为植物中青蒿素的 主要生物合成途径。 生物合成青蒿素的途径近年来引起了广泛关注， 但目前的工 作仅涉及合成青蒿素的生物合成中间体 28，而青蒿素最终产品的研究

13、进展不大，且鲜见报道。但这恰恰是可能提高青蒿素市场供给的最重要途径， 因此要全面加大青蒿素最终产品生物合成的研究力度。2个乙社CbA|乙乙fttCdA硫解坯 乙配乙吐g31 CoA 7触；-3合舫彳定牛比基僅磷酸（GPP）FDP合醇* 法呢基衣踽战（FDP）鲨烯台酶 / 令聲*%类化“ 鲨烯 倍半枯类中间产物* 注汕 为该途径的关msiNttlr: * irl 沁I lit* ktijF ttrcty tin* of tlir 卩 alii 怙 ny.图3植物类异戊二烯代谢途径IMVP FPPS 血 | FPP- kei/L-CtjA * HOGuA 皿 船IPPfl.to）rplH ll-d

14、ietw 师曲，Artenisirwl aT7lAVCYPHAV】 Aneaimiiiic add-*AnaiiWLiuc BcidAxiadshiuieIMUT FPRi 励mtolyl-GtA 卫L 崩一 A . CiriAVl 亠OT?1AVIAKtfjraM, 1H idle i ten. s umj 1 青鬲址f二氛古（7|醉亠二莪古禹般f二礼古爲腔礼过*1化彳勺讯IYJU11U11图55.青蒿素生物合成关键酶及其基因调控a.3-羟基-3-甲基戊二酰GoA还原酶（HMGR）HMGR催化HMG-CoA形成甲羟戊酸（MVA），由于MVA的形成是一个不可逆过程，故HMGR被视为MVA途径中

15、的第1个关键酶，具限速作用。HMGR是萜类化合物代谢中的重要调控点，尤其是倍半萜类物质的合成，与 HMGR活性呈正相关。Baldi等29研究了悬浮培养青蒿增加青蒿素产量的方法，通过增加所选 的前体（甲基戊酸内酯）和诱导子（甲基茉莉花素）到最佳浓度，发展了整体增加青 蒿素产量的策略，结果得到15.2血/L生物量及110.2 mg/L青蒿素，比对照组的 产量高5.93倍。近年来研究表明，HMGR基因是一个三基因（hmg1，hmg2，hmg3）组成的 基因家族。其基因家族成员的差异表达对 MVA途径中萜类的生成起重要调控作用。应用3种马铃薯HMGR基因（hmg1，hmg2，hmg3）作为基因针，Ch

16、oi等证 明受伤诱导的固醇积累与 HMGR1基因表达的诱导有关30。Ya ng等31 对 一些模式植物（如马铃薯）的研究结果表明，HMGR U亚基因家族的成员表达与倍 半萜类植保素的合成密切相关。b.法呢基焦磷酸合酶（FPPS）FPPS是一种1 4-异戊二烯基转移酶，它催化IPP和DMAPP通过缩合作 用形成GPP，GPP再与IPP缩合形成FPP 32-33 。IPP 与 DMAPP 是植物中萜类合成的共同前体，在相关酶 GPP 合酶、 FPP 合酶、GGPP合酶的作用下，IPP与DMAPP头尾缩合生成线性前体 GPP、FPP、 GGPP 。其中， FPP 是倍半萜、三萜、多萜的共同前体。在质

17、体中， GPP 是单 萜的前体， GGPP 是二萜、四萜、叶绿醌等的前体。因此，要提高青蒿素的产 量，提高 FPP 的量是至关重要的。提高 FPP 的供应主要有 2 种方式，一种是导入与 FPP 合成相关的外源基因 如 HMGR 、 FPPS34-35 。另一种方式是减少 FPP 流向萜类代谢的其他途径方 法有反义 RNA 技术及同源阻断等 36-37 。c.紫穗槐-4 , 11-二烯P450单加氧酶植物细胞色素P450是分子量为4060 kDa、结构类似的一类血红素硫 铁蛋白， 属于单加氧酶的超家族。 它以可溶性和膜结合 2 种形态存在于植物细胞 内，催化许多具有立体和区域特异性的氧化反应，

18、目前已克隆 90 多个植物细胞 色素P450基因。1999年Helliwell等38在生物合成植物激素赤霉素时证实 了 CYP的逐步催化。2000年Wallaart 39提出紫穗槐-4, 11-二烯中C12氧 化是 CYP 在脱氢酶和还原酶活性存在下催化的多级酶促反应。2003 年 Schuler 等发现，作为最大的植物基因家族之一， CYP 基因家族的 基因序列差异巨大。 2005 年 Bertea 等40首次从青蒿中检测到紫穗槐 -4， 11- 二烯 P450 单加氧酶的活性， 利用气质联用法首次在青蒿的叶及其腺毛体中检 测到青蒿醇、二氢青蒿醇、青蒿醛、二氢青蒿醛和二氢青蒿酸。6. 展 望

19、综上所述，在现有的基础上，增强青蒿素的生物合成研究是增加青蒿素供 给的重要方法。加强青蒿素生物合成机理研究的同时，通过采用合适的青蒿素 中间体、温和的反应条件和减少合成步骤，逐步实现工业化生产的应用研究。 增加青蒿素产量的关键是提高合成青蒿素成品的收率，同时还应加强生物反应 器培养设备的研制，使青蒿素生物合成路线能适应工业化生产，这也是今后生 物合成青蒿素研究工作的重中之重。而通过其他各种辅助调控手段提高青蒿素 生产的能力来增加青蒿素的供给，也必须在今后的研究工作中加以关注。参考文献1.Klayman D L,Science,1985,228, 1049 1055.2.文U静明（Liu J M

20、）,倪幕云（Ni M Y）,樊菊芬（Fan J F）,屠呦呦（Tu Y Y）,吴照华（Wu Z H）, 吴毓林 （Wu Y L）, 周维善 （Zhou W S）, 化学学报 （Acta Chim.Sinica）,1979,37, 129 141.3 钟国跃，凌云 . 黄花蒿优质种质资源的研究 J. 中草药， 1998，29（4）:264 267.4 钟凤林，陈和荣 . 青蒿最佳采收时期采收部位和干燥方式的实验研究 J . 中国中药杂志， 1997，22（7）:405 406.5 青蒿素结构研究协作组 . 一种新型的倍半萜内脂青蒿素 J . 科学通报， 1977（3）:142.6Schmid G

21、, Hofheinz W,J.Am.Chem.Soc.,1983,105, 624 625.7 Xu X X, Zhu J, Huang D Z, Zhou W S,Tetrahedron,1986,42, 819 828.8Avery M A, Chong W K M, Jennings-White C,J.Am.Chem.Soc.,1992,114, 974 979.9Avery M A, Jennings-White C, Chong WK M,Tetrahdron Lett.,1987,28, 46294632.10Ravindranathan T, Anil Kumar M, Men

22、on R, Hiremath S V,TetrahdronLett.,1990,31,755 758.11Zhou W S, Xu X X,Acc.Chem.Res.,1994,27, 211 216.12Feireica J F S ，Janick J.Floral morphology of artemisiaannua with specialreference to trichomesl J.Int J PlantSci ， 1995， 156（6）： 807-815.13Woerdenbag H J ，Jos F J ，Win V U，et al.Production of the

23、new anti-malarialdrug artemsinin in shoot culture of Arteaiisia atinua LI J .Plant Cell Tissue Callus and OrgCuture ，1993，32： 247-257.14耿飒，叶和春，李国凤，等 . 青蒿试管苗开花及用花器官为外植体诱导丛生芽生产青蒿 素 J. 应用与环境生物学报， 2001，7（ 3）：201-206.15 张龙，叶和春，李国凤 . 青蒿无性系中青蒿素生物合成的相关因素 J. 应用与环境生物学报， 2004， 10（3）：277-280.16 Geng S， MaM，Ye H

24、 C，et al.Effacts of ipt gene expression on the physiologicaland biochemical characteristics of Ariemisia annua L J.Plant Science ，2001，161：691-698.17 郭晨，欧阳藩，叶和春，等 . 流化床生物反应器培养青蒿毛状根生产青蒿素 J. 应用与环境生物学报， 1998，4（ 4）：345-348.18 郭晨，刘春朝，叶和春，等 . 温度对青蒿毛状根生长和青蒿素生物合成的影响 J .西北植物学报， 2004，24（10）：1 828-1 831.19 刘春朝

25、， 王玉春， 欧阳藩，等. 青蒿毛状根合成青蒿素的培养条件研究 J. 植物学报，1998，40（9）：831-835.20 蔡国琴，李国珍， 叶和春， 等 .Ri 质粒转化的青蒿发根培养及青蒿素的生物合成 J.生物工程学报， 1995， 11（ 4）： 315-320.21 刘本叶，叶和春 . 青蒿发根生长及青蒿素生物合成动态的研究 J. 生物工程学报， 1998，14（ 4）：402-404.22 Fulzele D P ， Sipahimalani A T ， Heble M R.Tissue culturs of Artem isia annua ： organogenesis and

26、artemisinin production J .Phytotherapy Res，1991，5（ 5）：149-153.23刘春朝，王玉春，郭晨，等 .流化床生物反应器培养青蒿毛状根生产 J. 应用与环境生物学报， 1998， 4（ 4）：24刘春朝、王玉春，康学真，等 . 利用新型雾化生物反应器培养不定芽25汪猷，夏志强，周凤仪，等.青蒿素生物合成研究川化学学报， 1988, 46: 1 152-1 153.26 Abdin M Z， lsrar M ， Rehman R U， et al.Atemisinin ， a novel antimalarial dtug ： Biochemi

27、cal and molecular approaches for enhanced prodctction J .Planta Medica , 2003, 69（4）: 289-299.27 Martin V J J, Pitera D J, Withers S T, et al.Engineering a mevalonate pathwayin Escherichia coli for production of terpenoids J .Natur Biotechnology , 2003,21（ 7）: 769-802.28 白东鲁,陈凯先 . 药物化学进展 M . 北京:化学工业

28、出版社, 2005.435-442 .29 BALDI A, DIXIT V K.Yield enhancement strategies for artemisinin pro-ductionby suspension cultures of Artemisia annua J .Bioresource Tech-nology , 2008,99（11）:4609 4614.30 CHOI D, WARD B L, BOSTOCK R W.Differential induction and suppression of potato 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase genes in response to Phytophthora infestans and to its elicitor arachidonicacid J.The Plant Cell Online , 1992, 4（10）:1333 1344.31 YANG Z, PARK H, LACY G H, et al.Differential activation of Potato3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reduc