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1、抗体纯化大全教学资料抗体纯化大全抗体的纯化第一节 硫酸铵沉淀法基本原理硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球蛋白从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。试剂及仪器 组织培养上清液、血清样品或腹水等 硫酸铵（NH4）SO4 饱和硫酸铵溶液（SAS） 蒸馏水 PBS(含

2、0.2g/L叠氮钠) (见附录一) 透析袋 超速离心机 pH计 磁力搅拌器实验步骤以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为33%50%。一、配制饱和硫酸铵溶液（SAS）将767g（NH4）2SO4 边搅拌边慢慢加到1升蒸馏水中。用氨水或硫酸调到pH7.0。此即饱和度为100%的硫酸铵溶液（4.1 mol/L, 25C）；其它不同饱和度硫酸铵溶液的配制见表1；二、沉淀1、样品（如腹水）20 000g 离心30 min，除去细胞碎片；2、保留上清液并测量体积；3、边搅拌边慢慢加入等体积的SAS到上清液

3、中，终浓度为1：1（v/v）；4、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或搅拌过夜（4C），使蛋白质充分沉淀。三、透析1、蛋白质溶液10 000g 离心30 min（4C）。弃上清保留沉淀；2、将沉淀溶于少量（10-20ml）PBS-0.2g/L叠氮钠中。沉淀溶解后放入透析袋对PBS-0.2g/L 叠氮钠透析24-48小时（4C），每隔3-6 小时换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸氨；3、透析液离心，测定上清液中蛋白质含量。应用提示一、先用较低浓度的硫酸氨预沉淀，除去样品中的杂蛋白。1、边搅拌边慢慢加SAS到样品溶液中，使浓度为0.5:1 (v/v)；2、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时 或过夜（4C

4、）；3、3000g 离心30 min（4C），保留上清液；4、上清液再加SAS到0.5:1 (v/v)，再次离心得到沉淀。将沉淀溶于PBS，同前透析，除去硫酸氨；5、杂蛋白与欲纯化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度差别很大时，用预沉淀除杂蛋白是非常有效的；二、为避免体积过大，可用固体硫酸氨进行盐析（硫酸氨用量参考表1）；三、硫酸氨沉淀法与层析技术结合使用，可得到更进一步纯化的抗体。参考文献1、 Burd, R.S., Raymond, C.S., Ratz, C. A and Dunn, D.L (1993) A rapid procedure for purifying IgM monoclonal

5、antibodies from murine ascites using a DEAE disk. Hybridoma 12, 135.2、 T.G.库珀着，徐晓利主译生物化学工具 人民卫生出版社出版（1980），353。（夏泉）表1.室温下硫酸氨饱和度由起始浓度（S1）提高到终浓度（S2）时需加硫酸氨的量（g/L）0%10%20%25%30%33%35%40%45%50%55%60%65%70%75%80%90%56 114 144 176 196 209 243 277 313 351 390 430 472 516 561 662 76757 86 118 137 150 183 216

6、 251 288 326 365 406 449 494 592 64929 59 78 91 123 155 189 225 262 300 340 382 424 520 61930 49 61 93 125 158 193 230 267 307 348 390 485 58319 30 62 94 127 162 198 235 273 314 356 449 54612 43 74 107 142 177 214 252 292 333 426 52231 63 94 129 164 200 238 278 319 411 50631 63 97 132 168 205 245 28

7、5 375 46932 65 99 134 171 210 250 339 43133 66 101 137 176 214 302 39233 67 103 141 179 264 35334 69 105 143 227 31434 70 107 190 27535 72 153 23736 115 19877 15779第二节 DEAE离子交换层析法基本原理离子交换层析是蛋白质纯化的常规方法，与硫酸氨沈淀法联合使用可以非常有效地纯化抗体。DEAE是一种阴离子交换剂，当蛋白质溶液通过DEAE柱时，带负电荷的蛋白质可以被DEAE吸附，带正电荷的蛋白质则不被吸附而随溶液流出。纯化抗体时可选择p

8、H值大于待纯化抗体等电点的缓冲液，此时抗体带负电荷可以通过电价键吸附于DEAE离子交换剂上，然后用增加盐浓度的方法将抗体洗脱。可以用连续梯度法洗脱，也可以用不连续梯度（分段洗脱）法洗脱。本文以腹水中mAb的纯化为例来介绍此方法。试剂及仪器 抗体样品（小鼠腹水或经硫酸氨沉淀的抗体） DEAE离子交换剂（阴离子交换剂） 层析柱（2.5cm 20 cm） 缓冲液 A：25mmol/L Tris-HCl pH 8.8 +35 mmol /L NaCl 缓冲液 B：25mmol/L Tris-HCl pH 8.8 +70mmol /L NaCl 缓冲液 C：25mmol/L Tris-HCl pH 8.

9、8 +500 mmol /L NaCl 缓冲液 D：25mmol/L Tris-HCl pH 8.8 PBS (见附录一) 透析袋 (MW CO 10 000) 磁力搅拌器 蠕动泵和部分收集器 紫外检测仪 梯度发生器 电导仪 pH计 离心机实验步骤整个层析过程最好在4C 进行,可在冷室操作；1、抗体样品对缓冲液B 透析过夜（4C）；2、按说明处理DEAE离子交换剂。然后用缓冲液A 平衡。用20倍体积缓冲液A洗交换剂，可用过滤或离心法反复洗到流出液的电导率等于缓冲液A；3、将处理好的DEAE离子交换剂悬浮在缓冲液A 中，装入层析柱。4、用等体积的缓冲液D 稀释透析过的抗体样品，使之与缓冲液A 的

10、离子强度一致；5、稀释后的样品10 000g 离心10 min（4C），除去沉淀变性的蛋白质；6、层析柱与蠕动泵、部分收集器及紫外检测仪连接；7、抗体样品以1ml/min 流速上柱，然后用缓冲液A 洗柱1ml/min，将未吸附的蛋白质洗出。直到流出液在280 nm 的吸光度小于0.05；8、吸附的蛋白质，用连续增加NaCl的浓度来洗脱。用线性梯度缓冲液（35-500 mmol/L NaCl）或分段缓冲液（35、70、140、280、500 mmol/L NaCl）洗脱。流速1ml/min ，分部收集洗脱液 2ml / 管 （图2-4-1）；9、椐紫外检测结果，将抗体峰部分合并。装入透析袋对PB

11、S(含0.2g/L叠氮钠)4C 透析或冷冻（视抗体的稳定性而定）；10、 DEAE离子交换剂可按照商品说明再生使用。图2-4-1 DEAE离子交换柱层析纯化小鼠IgG流速：1ml/min 样品：0.5ml腹水检测方法1、大部分小鼠的单克隆抗体IgG可在50200mmol/L NaCl浓度之间洗脱。2、可用SDS-PAGE 或定量免疫学方法（RIA、ELISA）检测各部分洗脱液的抗体存在及效价。实验要点及说明1、要得到满意的分离结果，每ml DEAE 离子交换剂所加样品中蛋白质总量最好不超过10mg。2、用经硫酸铵沉淀初步纯化的抗体代替小鼠腹水作为样品，可得到更好的纯化结果。3、如抗体与DEAE

12、离子交换剂不能有效的结合，可将起始缓冲液的pH提高0.1个单位,直到可以有效结合为止。4、如果没有合用的蠕动泵和部分收集器，可用手工上样和收集。洗脱液每管收集0.5-2ml ,然后用分光光度计测定各管280nm波长的吸光度值。5、该方法可按比例扩大。用适合于高流速的大柱和相应的交换剂来纯化大量的蛋白质样品。参考文献1. Corthier, G., Boschetti, E. and Charley-Poulain, J. (1984) Improved method for IgG purification from various animal species by ion exchange

13、 chromatography J. Immunol. Meth . 66, 75-79.2、张保真编译西安医科大学出版（1986）免疫组织化学理论与技术 69-71。（夏泉）第三节 羟磷灰石层析纯化抗体基本原理羟磷灰石Ca10(PO4)6(OH)2吸附蛋白质的机理，通常认为与其晶体表面的Ca2+ 和PO43- 两种基团相关。因为带电基团紧密排列于晶体表面，可能通过偶极子之间的相互作用来吸附蛋白质。样品被吸附剂吸附后，用适当的洗脱液（较高浓度的盐溶液）冲洗，可使之解析。解析下来的物质在流经层析柱的过程中向前移动，遇到前面新的吸附剂可再被吸附。在反复的吸附解析再吸附再解析的过程中，由于待分离物质

14、与吸附剂之间的吸附能力不同，它们沿洗脱液流动方向移动的速度也不相同，所以在洗脱过程中各组分便会由于移动速度不同而被分离。抗体与其它蛋白质一样可以用羟磷灰石吸附柱层析进行纯化。试剂及仪器 抗体样品（腹水或培养上清液） 羟磷灰石（Hydroxylapatite 有售） 层析柱（2.5cm 20 cm） 吸附缓冲液：20mmol/L 磷酸钾缓冲液pH6.8 含30mmol /L NaCl 洗脱缓冲液：500mmol/L 磷酸钾缓冲液pH6.8 含30mmol /L NaCl PBS (见附录1) 透析袋 (MW CO 10 000) 磁力搅拌器 蠕动泵和部分收集器 紫外检测仪 梯度发生器 离心机实验

15、步骤1、羟磷灰石柱的准备：将羟磷灰石悬浮于吸附缓冲液中，使之充分水合后装柱。用10 柱体积的吸附缓冲液洗柱；2、样品的预处理：含抗体的样品先在4C对吸附缓冲液透析过夜或用该缓冲液10倍稀释，再将透析或稀释后的样品4 000g 离心15min（4C）；3、仪器安装：将蠕动泵、紫外检测仪和部分收集器与层析柱连接；4、上样：将样品上清液以1ml/min的流速加到柱上，然后用20 柱体积的吸附缓冲液洗柱；5、抗体的洗脱：提高磷酸盐的浓度可以将抗体洗脱。常用的方法有两种：一种是用梯度发生器进行线性浓度梯度洗脱，浓度为20500 mmol/L的磷酸钾缓冲液；另一种方法是用不连续浓度梯度洗脱，例如可以用35

16、、70、140、280和500 mmol/L的磷酸钾缓冲液依次分段洗脱。收集洗脱液 2ml / 管（图2-4-2）；6、合并洗脱液中含抗体的部分（见下面检测）对PBS透析。根据抗体的稳定性4C或冷冻防腐（0.2g/L 叠氮钠）保存；图2-4-2 羟磷灰石柱层析纯化单克隆抗体IgG流速：1ml/min 样品：腹水1ml检测方法1、 单克隆抗体IgG通常在200400mmol/L磷酸钾浓度之间洗脱。2、 可用SDS-PAGE 或定量免疫学方法（RIA、ELISA），检测各部分洗脱液的抗体。应用提示1、每100ml 羟磷灰石可吸附大约500 ml细胞培养上清液或3 ml 的腹水或血清中所含的抗体。2

17、、使用羟磷灰石柱较适合的 柱长/直径 可以在5/115/1之间（典型尺寸：2.5cm 20 cm 柱长）。3、在吸附过程中应避免有对钙的亲和力大于磷酸盐的物质（如EDTA和柠檬酸等）的存在，以免减少羟磷灰石的吸附容量。4、用过的羟磷灰石柱可以用吸附缓冲液平衡再生后重复使用。或加入甲苯（0.03%， v/v)或叠氮钠（0.2g/L）储存。5、如果没有合适的蠕动泵和部分收集器，可手工加样和收集洗脱液2ml / 管，并用分光光度计测定各管在 280nm 波长的吸光度。6、与本方法类似的吸附和洗脱过程也可用来纯化其它蛋白质。参考文献Bukovsky, J. and Kennett, R.H. (198

18、7) Simple and rapid purification of monoclonal antibodies from cell culture supernatant and ascites fluids by hydroxylapatite chromatography on analytical and preparative scales. Hybridoma 6 ,219-228.（夏泉）第四节 抗体的辛酸纯化法基本原理在人、羊或兔血清或 含有IgG的培养上清中及小鼠的腹水中加入辛酸, 可与其中大部分蛋白质形成沉淀，而对IgG的性质没有影响，因此是纯化IgG的有效途径。沉淀后经

19、离心即可获得IgG。辛酸沉淀法与硫酸铵沉淀法比较其主要优点为可减少聚合物的形成，但与其相同，所得的抗体纯度不够，还需用其它方法以进一步提高其纯度。试剂及仪器s 腹水或细胞培养上清s 0.06 mol/L醋酸钠缓冲液（pH4.0）（见附录1）s 1N HCls 辛酸（ 正-八碳酸，n-octanoic acid）s 1N NaOHs PBS（见附录）s 透析袋 （MWCO 10,000）s 电磁搅拌器s 离心机操作步骤1 用烧杯加20ml 0.06 mol/L醋酸钠缓冲液（pH4.0）到10ml腹水或细胞培养上清中；2 用1N HCl调节pH到4.8，后滴加辛酸同时用力搅拌，具体用量参见表1；3

20、 在室温下继续搅拌30分；4 5，000 g 室温离心30分，保留上清；5 用1N NaOH 调节pH到5.7；6 含有IgG的上清对PBS透析，然后分装、置-20保存。表1 沉淀不同来源IgG的辛酸参考用量IgG来源 辛酸用量（每10ml腹水或上清）小 鼠 400l人 700l羊 700l兔 750l质量检察上清中IgG的纯度可用SDS-PAGE分析及合适的酶标免疫测试法测定其免疫活性来确定。上清中可能存在少量杂质，可通过DEAE离子交换层析除去。参考文献1. Russo,C., Callegaro,L.,Lanza,E., and Ferrone,S. (1983) Purificatio

21、n of IgG monoclonal antibody by caprylic acid precipitation. J. Immunol. Meth. 65,269-2712. Steianbuch,M. and Audran,R. (1969) The isolation of IgG from mammalian sera with the aid of caprylic acid. Arch.Biochem.Biophys. 134, 279-284（朱正美）第五节 Sephadex凝胶过滤纯化抗体基本原理凝胶过滤又称分子筛层析。是一种借助分子筛效应将分子大小不同的混合物进行分离的

22、方法。交联葡聚糖凝胶Sephadex是常用的层析介质。它是一种含有许多网眼的球形小颗粒，网眼大小分布均一。当分子大小不同的混合物通过凝胶柱时，其中较大的分子不能进入凝胶网眼，将毫无阻力或阻力很小地随洗脱液流出，而小分子物则能扩散进入网眼，被阻滞在层析柱上，分子量越小，扩散出来所耗时间就越长。因此分子大小不同的MoAb可以借助分子筛效应进行分离提纯。本文以IgM的纯化为例介绍此方法。IgM因分子特别大（900 kd）而不能进入凝胶颗粒的网孔，可首先被洗脱达到初步纯化的目的。试剂和器材 Sephadex G 100 或G 200 粗制IgM-MoAb培养物或抗血清，腹水等 洗脱缓冲液：0.01mo

23、l/L Tris-HCl缓冲液pH 8.0 含0 .5mol /L NaCl 层析柱（1.0 cm 30 cm或1.5cm 40 cm） 透析袋 (MW CO 10 000) 磁力搅拌器 部分收集器 紫外检测仪 离心机步骤1、 样品处理：将腹水、抗血清或培养上清液离心4000g 20分钟，以除去细胞碎片。较稠的腹水和血清需适当稀释；2、 装柱：根据样品量选择合适的层析柱，将0.01mol/L pH 8.0 含0 .5mol /L NaCl的Tris-HCl缓冲液加到柱长的1/4处，然后将漂洗溶涨的Sephadex G 100 或G 200 倾入柱中，自然沉降30分钟， 再用同样的缓冲液平衡柱1

24、小时，流速0.5ml/min；3、 仪器连接：将紫外检测仪和部分收集器与层析柱连接；4、 上样和洗脱：待柱上平衡缓冲溶液接近凝胶上表面时，缓慢加入样品溶液0.5ml/min。当样品液 面接近凝胶上表面时，加少量缓冲液清洗柱壁，然后接上缓冲液洗脱并收集1-2 ml/管。280nm 检测的第一蛋白峰即为IgM-MoAb。5、浓缩与保存：将280nm检测的第一蛋白峰合并，移入透析袋在磁力搅拌器上4C对PBS流动透析过夜。透析后的溶液可经聚乙二醇或五氧化二磷真空干燥浓缩后，分装封管，-20C保存备用。检测1、可用SDS-PAGE 或定量免疫学方法（RIA、ELISA）检测各部分洗脱液的抗体。2、IgM

25、-MoAb一般在外水体积洗脱。应用提示1、凝胶过滤不变换洗脱液，一次装柱后可反复使用多次。操作简单，快速经济。2、实验可重复性高，样品回收几乎可达100%，且方法温和，不易引起生物样品变性失活，可进行大量样品的分离纯化。3、用于小分子物（如无机盐）从大分子物（MW20 000）分离的层析柱，柱体积应大于样品体积4-10倍，其高与直径的比例应为5:1-15:1；用于大分子物之间的分离（如免疫球蛋白之间的分离），则柱体积应大于样品体积25-100倍，高与直径的比例应为20:1-100:1。4、Sephadex凝胶装柱时，应灌制均匀无断层和气泡。在整个操作过程中，凝胶应始终保持在液面以下。5、提取的

26、IgM浓度过低或反复冻融会引起变性，应分装后在-70C或-20C冻存，或者加0.2g/L叠氮钠在4C可保存数月。6、如无合用的部分收集器，可手工收集1-2ml/管，用分光光度计测定各管吸光度值。参考文献1、 周本正编着 层析技术及其应用 湖北科学技术出版社（1992）28-302、 M.Z.阿塔西, C.J.范奥斯, D.R.阿勃索洛姆 主编 郑昌学,吴安然等译 分子免疫学 科学出版社 (1988) 212-214第六节 免疫球蛋白G的亲和层析纯化法（蛋白A或蛋白G法）基本原理蛋白A是金黄色葡萄球菌的细胞壁(cell wall)(cell wall)成分。蛋白G是G组链球菌的细胞壁(cell

27、wall)(cell wall)成分。这两种蛋白质分子可通过免疫球蛋白的FC区和大多数哺乳动物(mammal;mammalian)(mammal;mammalian)的IgG结合(见表1)。利用基因工程(Genetic Engineering)(Genetic Engineering)技术，将蛋白A和蛋白G分子中与Fc区结合的结构域部分的基因融合，所产生的融合蛋白，则具有更广泛的IgG结合特异性。蛋白A、蛋白G或融合蛋白A/G与免疫球蛋白Fc段的结合性能使它成为可用于IgG分离的、天然的亲和配基。将这些配基蛋白结合到固体支持物上，提供了应用亲和层析纯化抗体的一步法的基础。试剂及仪器l 含IgG

28、的样品l PBS(见附录)l 装有2ml固相化的蛋白A、蛋白G或蛋白A/G的小型层析柱(有商品供应)l 透析袋(MWCO 10,000)l 结合缓冲液：0.1mol/L Tris-HCl pH7.5 + 0.15mol/L NaCll 分步收集器(可按需要选用)l 洗脱缓冲液:0.1mol/L Gly-HCl pH2.8+0.15mol/L NaCll 中和缓冲液：1mol/L Tris-HCl pH 8.0l 蠕动泵(可按需要选用)l UV监测器l pH计操作步骤* 样品(可为血清、腹水、含有IgG的单克隆和多克隆抗体的细胞上清液)。1 样品在4,对结合缓冲液透析过夜，或将其与至少1：1稀释

29、的结合缓冲液混合；2 如果条件充许，将层析柱与蠕动泵、分步收集器和UV监测器相连；3 至少用10ml结合缓冲液, 以1ml/min速度, 洗涤柱中的2ml亲和层析介质；4 上样；5 一旦样品进入凝胶，用结合缓冲液洗柱（至少10个柱体积），直至A280nm 小于0.03；6 用洗脱缓冲液洗脱所结合的IgG,分布收集2ml/管；7 收集过程中,每管立即加入0.1ml中和缓冲液，以中和洗脱所得的IgG液。8 含IgG的各管对PBS透析,其后根据抗体的稳定性,加入防腐剂(0.020g/L叠氮钠)，置4或冷冻保存。实验要点及说明通常可通过SDS-PAGE分析或通过适当的免疫方法 (如Western bl

30、ot, ELISA等)，对洗脱组分进行纯度鉴定和免疫活性测定。1. 上样量由层析柱的对特定免疫球蛋白的容量确定，2ml柱对于小鼠IgG 的容量约10mg，对于人IgG的容量约为 18mg；2. 柱上结合的抗体被洗脱的速度很快, 通常在第一洗脱流份中；3. 下列缓冲液也可用为结合缓冲液：含0.15mol/L NaCl的50mmol/L硼酸钠pH8.0,或含0.15mol/L NaCl的0.1 mol/L 磷酸盐液pH7.5。 高盐结合缓冲液（1 mol/L NaCl）可能增加总的柱结合容量约50%；4. 应用pH8.0-9.5的缓冲液作为结合缓冲液，通常能增加蛋白A对小鼠IgG的结合力；5. 对于蛋白G的层析柱，可用低pH的结合缓冲液,如pH5.0含0.15 mol/L NaCl的50mmol/L 醋酸缓冲液；6. 对pH敏感的抗体,需用比较温和的洗脱液, 如:含0.2mol/L NaCl的0.1mol/LTris-醋酸pH7.7或3mol/L KCl或5.0mol/L KI或3.5mol/L MgCl2；7. 蛋白G也能与IgG的CH1区结合,所以不能用于F(ab)2与Fc的分离；8. 如果无蠕动泵和部分收集