工业微生物育种资料.docx

1、工业微生物育种资料第一章：绪论一、发酵工程1、概念：利用微生物的特定性状，通过现代工程技术，生产有用物质一种技术系统。一般是在发酵罐中生产，是生物加工和生物制造实现产业化的核心技术。2、突出特点：以可再生资源为原材料； 反应条件温和（相比化学合成）多为常温常压，反应能耗低、选择性好、效率高的生产过程； 环境污染少，不产生重金属、有害化学物质；投资较小(与反应条件直接相关） 能生产目前化学生产不能生产或者生产困难的性能优异的产品。所以发酵工程已成为工业领域重点发展的行业。Eg:Aas,vit与有机酸、抗生素等。3、中国发酵工程的现状：有一定的基础，但参差不齐与国外差距大，就产量而言，主要是糖化酶

2、，高温-ainylase,碱性蛋白酶，以糖化酶为例，自1988年引进高产的菌株后，发酵水平一直鲜有提高，酶活性仍停留在3500 u/ml左右。而国外已达到50000 u/ml以上。由于剂型单一及质量不稳定，中国酶制剂产品很难进入国际市场，也挡不住国际市场产品进入国内市场，总的来说，中国生产的发酵产品的产业化程度很低，科研成果转化为生产力的周期长，速度慢，技术水平和装备水平还有待进一步提高等。所以与国外的差距大，生产成本明显高于国外。4、发酵工程队促进国民经济发展的重要作用。农业：如陈化粮的问题;； 能源：如石油的问题； 化学工业：医药工业（中国两大支柱产业）方面的提高等等。这些方面都能有效地提

3、高民族工业的国际竞争力，实现国民经济的持续发展。5、发酵工程技术的内容。提供高性能生产菌种的菌种技术；实现低成本，大规模生产产品的发酵技术；获得合格产品的分离提取技术。二、工业微生物育种在发酵工业中的地位。工业微生物：应用于发酵工业的微生物，是指通过工业规模培养能够特定产品或者达到特定社会目标的微生物。1、 菌种技术的内容：菌种筛选技术；菌种选育技术；菌种保藏技术。筛选是指从自然界中获得具有生产目的产物的菌株； 选育是指提高菌株生产性能；保藏则是指保证菌种生产能力能长时间维持。 这些都是育种学的内容。2、 Bac育种的必要性：菌种是发酵的基础，是生产的役马。既是发酵过程成败的关键，更是体现经济

4、效益和工作效益的关键，一个好的工业菌种可以形成和发展出一个工业形成一个产业；同样，现代工业生物技术的发展，也不断要求有新的性能更优越的工业菌种的出现。人类社会可持续发展的需要。大自然中Bac资源及其丰富，据估计，地球上Bac的种类有106 到107种，而被人类了解的仅占10%全世界被描述的Bac种类仅占实际的2%，目前被人类利用的Bac仅占总量的1%，人类为了自身的生存与发展，必须从自然界中索取各种资源加以利用。现在，人口急剧膨胀，工业化速度加快，自然资源特别是矿物质能源过度，过快地被消耗，环境污染日趋严重等问题，迫使人们加速开发Bac资源。利用Bac增产粮食，提供新的蛋白质资源、生产工业乙醇

5、及氢气等洁净能源。加速环境治理，比如利用Bac初级代谢和次级代谢产物，如抗生素、Aas、酶、有机酸等。发酵工业发展的需要。例如：青霉素发酵水平的提高，弗莱明在20世纪20年代发现青霉素时，所产青霉素的菌种为青霉菌，发酵单位为2u/ml,1943年，美国最早使用黄青霉，所产青霉素的单位为250u/ml。后来Demerce用X射线诱变黄青霉菌株，得到青霉素单位为500u/ml。20世纪80年代，青霉素效价为85000u/ml。是中国发酵工业的现实需要。国内菌株的发酵水平与国外相比总的来说还比较落后，发酵产品的品种也较少，如酶制剂。丹麦的诺维公司生产有-amylase糖化酶、蛋白酶、果胶酶、核酸酶、

6、纤维素酶等品种，尽各种规格即达100多种，国内生产的一直是三大当家酶种，即糖化酶、-amylase和蛋白酶。此外，再加上近年来陆续开发的少量品种如纤维素酶、凝乳酶、异构酶等，品种数量达到30多种。但淀粉酶的产量占酶制剂总量的75%，其他酶类则更是，品种也不全，产品结构不合理，远不能满足各行各业的需要。3、 菌种选育的意义。决定发酵产品能否具有工业的价值；是发酵成败与否的关键；是提高发酵工业产品的产量和质量增加了产品的品种的关键。4、 工业Bac菌种的生产要求。稳：遗传稳定，有利于产品优良性状的传递；性能稳定，能保持较长的良好经济性能，菌种的优良性能不易退化；目的产物的产量稳定，不随生产批次的改

7、变而改变；繁殖快，易产生营养细胞、孢子或其他繁殖体；菌种生长快，种子的生长必须旺盛，在短时间内就能达到产品最佳生产期；目的产物产生的时间快，产生目的产品的时间短，即发酵时间短，提高生产效益；纯：菌种纯。是纯种，防止产品含有杂质，避免发生倒灌；易：菌种易分离提纯（以获得纯种，而且一旦感染上杂菌，能容易分离纯化）；易于突变，对诱变剂敏感，有利于菌种加强；强：抵抗能力强，有自身保护机制，能抵抗杂菌污染。即稳、快、纯、易、强。只有具备了这些条件的菌株，才能保证发酵产品的产量和质量。这既是发酵工业的最低要求，也是发酵工业的最大目的。三、遗传学的形成和发展。遗传学时生命科学领域中一门核心学科。1、 主要研

8、究内容：遗传物质的结构； 遗传信息的传递；遗传信息的功能； 遗传信息的表达。2、 分类：传递遗传学，级经典遗传学。主要研究遗传物质纵向传递的规律及基因型与表型的关系；分子遗传学。主要研究基因结构，功能和纵向传递（结构是指其化学本质与精细结构，功能指他的表达、调控、重组和变异）；群体遗传学，研究群体中基因频率和基因型频率以及影响其平衡的各种因素。3、 特点：推理性强，是一门推理性的学科。遗传学的研究方法是根据自然现象和实验数据推理出一种假设，然后通过实验加以验证； 多学科交叉与融合。遗传学主要建立在生物化学、细胞生物学和统计学的基础上，但又涉及生命科学的各个领域；发展快。遗传学的发展非常快，新理

9、论、新技术、新成果层出不穷；应用性强。转化为生产力的周期短，以其为理论基础，已派生出许多应用学和植物等微生物育种学、优生学、生物工程等。4、 遗传学的发展。遗传学的发展大致可分为三个时期：细胞遗传学时期（1910-1940）。此时期主要是确立了遗传学的染色体说。摩尔根提粗了连锁交换定律，并确定基因直线排列在染色体上 ，形成经典遗传学的理论体系；微生物遗传学和生化遗传学时期（1941-1969）。这一时期的特点是遗传学研究的对象从真核生物转向原核生物，并更深入地研究基因的精细结构和生化功能；分子遗传学时期（1953双螺旋结构模型的建立到现在）四、工业微生物育种的进展。（一）工业微生物育种的基础：

10、遗传与变异。所谓遗传是指亲代和子代相似的现象，而变异是指亲代与子代之间或同一亲代产生的不同子代之间存在的某种差异，变异提供遗传的材料，遗传则保证优良性状的积累。（二）工业微生物育种技术的发展阶段。1、自然选育：自然选育是不经人工处理而利用微生物的自发突变进行的纯种分离方法。单菌落分离，是一种简单易行的育种方法。例如：酒精发酵，利用自然选育纯种是酒精生产稳定（包括性能、产量、生产时间等方面的稳定）但是突变频率高与低，存在很大局限性。2、诱变育种（上世纪90年代）以人工诱发基因突变为基础的育种技术。例如：抗生素的生产，特别是青霉素生产。诱变育种到目前为止还是很重要的育种方法，尤其是发酵工业中优良高

11、产菌株的选育。3、杂交育种（20世纪40年代）微生物的杂交育种不是简单的物种之间优良性状的组合而是建立在诱变育种的基础上，而且克服生物物种之间相似性的影响（即亲和性）。杂交不仅发生在种内，也可以成功地发生在种间和属间。杂交主要是消除诱变剂的“疲劳效应”等副反应，集不同菌株的优良性状于一体。4、推理育种。（20世纪50年代）又称代谢控制育种。是根据微生物代谢产物的生物合成途径和代谢调节机制，通过人工诱发突变的技术，筛选获得改变微生物正常代谢途径的突变株，从而人为地是目标代谢产物选择性地大量合成和积累的技术，以谷氨酸发酵为标志，意味着诱变由盲目性走向理性。5、代谢工程育种（即传统意义的基因工程育种

12、）利用基因重组技术对细胞代谢网络进行有目的的定向修饰，先对细胞的分解和合成代谢中的多步级联反应进行合理设计，然后利用DNA重组技术强化或灭活控制代谢途径的相关基因。6、基因组重排育种（基因组改组）是2002年新报道的对微生物整个基因进行重排的育种方法。采用的具体方法是先用诱发突变或点突变技术产生复杂子代组合库，然后采用循环原生质体融合，使其产生同源重组，产生各种各样的突变组合。第二章微生物细胞的结构与分裂第一节 微生物细胞结构与功能细胞是生命活动的基本单位，一切有机体（除病毒外）都是由细胞构成。细胞是构成有机体的基本单位；细胞具有独立有序的自控代谢体系，是代谢与功能的基本单位；细胞是遗传的基本

13、单位，具有遗传的全能性。细胞是多层及非线性的复杂结构体系，是物质与信息、能量过程精巧结合的综合体，是高度有序的，具有自组装和自组织能力的体系。微生物的分类：微生物通常是指那些单细胞的或由相同组织构成的多细胞有机体。分为五类：1、病毒。真病毒、类病毒。2、真细菌（具有原核细胞结构）古细菌3、真菌4、藻类。5、原生动物体。按细胞结构及遗传信息分为真核微生物和原核微生物。一、 细胞壁的结构与功能。功能：对细胞起保护作用；维持细胞行动；对物质的交换起部分调节作用（有些分子能进入有些则不能）；决定细菌的抗原性、致病性急对病毒的敏感性。1、主要成分。肽聚糖。细胞壁的有效成分。但G-含量低。双糖单位 N-a

14、cety/glucosamine (G) N-acety/ muramic acid (M) G、M以-1、4糖苷键连在一起，该键是溶菌酶的作用位点。短肽。由4个Aas（有时是5个）残基组成，且D型和L型交错出现，一般连在M上。肽桥。连接前前后后两个肽聚糖的一小段Aas.NH2前一短肽中的第4个Aa相连，而-COOH与后一肽聚糖单位的短肽中的第三个Aa相连（青霉素抑制转肽酶的活力，使短肽和肽桥不能形成）；磷酸壁。G+特有，分两种类型，即壁磷壁酸和膜磷壁酸，青霉素可阻碍壁磷壁酸中甘油磷酸链与肽聚糖分子间进行共价结合。膜磷壁酸甘油磷酸链与细胞膜的磷脂共价结合。脂多糖（LPS）为G-所特有，有类脂A

15、，核心多糖和O-特异性侧链三部分组成。LPS是细菌的内毒素，其物质基础是类脂A，O-特异性侧链决定抗原特异性（由3-5个单糖组成的重复单位聚合而成）。PW，G-含量多一些，G+则少一些。2、G+与G- 细胞壁成分及结构的差异。肽聚糖含量 高（G+） 低（G-）肽聚糖层 层数多 交联度高、厚 层次少、交联度低、薄磷壁？ 有 无Pw 低（约10%） 高（约60%）类脂 无或少量 高（2%-3%）诱菌酶分解作用 敏感 不敏感对？霉素作用3、缺壁细胞（1）原生质体与原生质球 原生质体-一般由G+形成 原生质球-一般由G-形成，还残留部分细胞壁（2）L-form of bacteria 通过自发突变而形

16、成的遗传稳定的细胞壁残缺型 (3) 支原体 无细胞壁的G-小型原核生物。是生物界目前能独立营养的最小型生物。（二）酵母菌cell壁 三明治结构（Hanno甘露糖）由葡聚糖、甘露聚糖蛋白质和几丁质组成。可由蜗牛消化酶水解。（三）霉菌cell壁 主要由纤维素、几丁质、葡聚糖、少量蛋白质组成-蜗牛消化酶水解（四）藻类cell 壁 主要由纤维素、木聚糖、甘露聚糖、杂多糖、脂类构成二：细胞壁以内的构造（一）流动镶嵌型1、特征：（1） 具有极性头部和非极性尾部的磷脂双分子层是生物膜的基本结构成分（2） Pro.vs不同形式镶嵌在脂双分子层的结合在其表面。Pro的类型.分布的不对称性及其与脂分子的些作用是物

17、膜特征和功效的基础。（3） 生物膜可以看成是pro在脂分子中的二维溶液2、成分（1） 膜脂成分：a.磷脂 b.糖脂 c.胆固醇和中性脂肪（细菌中不念胆固醇，但含有甘油酯特性脂分子） 膜脂的运动方式，有4种a. 沿膜平面的侧向运动 b.膜分子绕轴心的自转运动c. 脂分子尾部的摆动 d.双层脂分子之间的翻转运动（2） 膜蛋白 膜周边蛋白or外在蛋白为水活性蛋白。靠离子键or其他较弱的键与膜表面的pro.or脂分子结合。改变溶液的I or 提高T。就能从膜上分离下来。膜的结构并不被破坏2 膜内在蛋白or整合蛋白与膜结合相当紧密，只有用去污剂才能分离出来。3、膜的流动性 （1）.膜脂的流动 主要指膜分

18、子的侧向运动。 （2）.膜蛋白的流动 成斑现象和成？现象 膜蛋白在脂双层中的运动史自发的热运动。不需cell代谢产物的参与，也不需提供能量。4、膜的不对称性（1） 膜脂的不对称性： 即同一膜脂分子在脂双层中不均匀分布（2） 膜蛋白的不对称性：指酶种膜蛋白分子在cell膜上都有明确的方向性，如cell表面的受体。膜上载体蛋白都是按特定的方向传递信号与物质。膜蛋白的不对称性是生物膜完成复杂，有序的各种生理功能的保证5、Cell膜的功能（1） 为cell的生命活动提供相对稳定的内环境（2） 选择性的物质运输，包括代谢第五的输入与产物的输出，其中伴随E传递（3） 为多种En（酶）提供结合位点，是En促

19、反应高效有序地进行。（4） 提供En结合位点，是酶促反应高效有序地进行。（5） 参与形成不同功能的cell表面特征结构（如间体，鞭毛）？体又称中体，多见于G+，主要促进cell间隔的形成，并与遗传物质的复制及其相互分离有关，是cell表面特征性的一个结构。 （二）细胞质 1.空核Bac的细胞质和内含物（1）特点：不流动，中间含有内含物，包括各种贮藏体、羧酶体、气泡体等（2）贮藏体：由不同化学成分累积而成的不溶性沉淀颗粒。 功能：贮藏营养与能量；种类有能沉及能量类、氮源类、磷沉类等2.真核Bac的细胞质与细胞器（1）线粒体：氧化磷酸化、合成ATP、提供E（2）溶酶体：作用于pro糖、脂、核酸等，

20、使其水解，进行Cell内清等，维持Cell营养，防止Bac or 异物体侵袭（3）微体：过氧化物酶体、单膜、使cell免受H2O2等过氧化物的毒害。乙醛酸循环体，使cell内的脂肪通过乙酰CoA和乙醛酸循环合成糖类or其他cell成分（4）内质网 分粗面内质网（VER）和滑面内质网（SER） VER 含核糖体，合成分泌性pro和多种膜蛋白 SER 不含核糖体，合成脂质 功能：pro合成、脂质合成、pro修饰与加工-二硫键的形成 糖醛化、酰醛化 羧醛化？的折叠与装配（5）高醛体 参与Cell分泌活力，对各种pro自身携带的？信号识别进而对其进行分类、包装、？ pro的糖醛化及其修饰 pro的水解

21、及其他加工过程（如将前体加工成有活性的物质）（6）液泡 贮藏营养物质及水解酶类、调节渗透压3.核糖体 合成pro、真核80S（60S、40S）、质核70S（50S、30S）（三）细胞核与质粒1.原核生物的核质体 质核Bac没有膜包围，但与细胞质有一定的联系，一般附于间体上2.真核Bac的细胞核（1）核膜 有核小孔、供物质选择性运输，非均匀分布（2）核仁 合成rRNA，装配核糖体亚单位（3）核基质（4）染色质 分裂间期遗传物质的存在形式3.质粒 独立于染色体外的基因组质粒的基本特性 a.独立自主地复制（松弛型、严密型） b.不相密性（一般情况下同一cell种只存在一类质粒） c.转移性 d.非必

22、需性（对宿主细胞而言是非必需的）在后面的基因工程中 主要讲集中具体的类型，此处略。（四）芽孢与伴孢晶体三、cell wall以外的构造（一）荚膜 组成：水（70%）、多糖、多肽、pro 功能：a.保护作用、防干燥、防吞噬、防噬菌体b.贮藏养料 c.堆积代谢废物 d.表面附着（二）鞭毛 1.细菌的鞭毛、菌毛、性菌毛 鞭毛：运动、年老的易失去 菌毛：吸附功能 性菌毛：供体菌DNA转移到受体菌2.真核生物的鞭毛与纤毛：是真核生物cell骨架的成分之一，功能是运动第二节 cell分裂真核Bac细胞有核仁，进行有丝分裂和减数分裂，细胞分裂与DNA复制严格同步Pro细胞无核仁，进行无丝分裂和减数分裂，细胞

23、分裂与DNA复制并不同步1.细菌的繁殖(1)二分裂，细菌最普遍，最重要的繁殖方式a.在原间体上形成以新间体（DNA附在间体上）b.一股DNA断裂并以其一端附在新的间体上c.两股DNA分别复制成两分子DNA，与此同时，cell物质增加，cell膜延长，两DNA分离d.细胞中央部分两个间体之间形成隔膜e.得到两分子cell（2）不等二分裂，如柄细菌，单一端单毛菌带鞭毛的细菌鞭毛端长出一个柄，鞭毛消失细菌伸长，在柄的相对端长出一根鞭毛二分裂形成一带柄cell和一个在柄的相对端极生一根鞭毛的细菌有鞭毛的细菌游走（3）出芽生殖；(4)二分裂；（5）多分裂G- 的蛭弧菌以多分裂存在于宿主中形成多个子cel

24、l2、放线菌的繁殖：大多数以分生孢子繁殖，有些以菌丝断裂的方式繁殖 真核生物有丝分裂，有性生殖，减数分裂（略）第三章 遗传的物质基础一、 遗传物质基础的确定 （遗传物质的基础是核酸）1、 肺炎链球菌转化实验2、 噬菌体的感染实验3、 烟草花叶病毒拆分和重建实验（RNA）第一节 染色体一、 真核生物与原核生物的遗传物质的主要区别1、 真核生物的遗传物质是DNA，而原核生物的则为DNA or RNA2、 真核生物的染色体由DNA和组蛋白组成，而原核生物的则由纯DNA or RNA组成3、 真核生物的染色体不止一个，而原核生物往往只要一个4、 真核生物的染色体为核膜包被，而原核生物则没二、DNA在真

25、核生物中的存在状态（一）染色体 1、分类 根据着丝粒的位置分为四类：中着丝粒染色体；近着丝粒染色体；端着丝粒染色体；远着丝粒染色体。 2、结构 （1）着丝粒：两个染色单体相连的部位，在染色体上的位置固定形成主缢痕 （2）次缢痕：除主缢痕外，染色体上其他的浅染色缢痕部位，它的数目位置和大小是某些所特有的特征 （3）核仁组织区(NOR)：位于染色体的次缢痕部位，但并非所有的次缢痕部都有NOR （4）端粒：染色体两个单部特化结构 （5）随体：位于染色体末端的球星染色体的末端，有随体的称为sat 染色体（二）染色体外的DNA真核生物染色体外的DNA主要以细胞器的形式存在。一般都和其他物质在一起。细胞器

26、包括：线粒体、叶绿体、中心体、毛基体、质粒、纺锤体等。这些细胞器存在一些共性1、 成分复杂（DNA、RNA、糖、脂、RNA等）2、 结构复杂（叶绿体和线粒体具有复杂的膜结构，中心粒和毛基体具有微管结构）3、 功能不一，且与细胞生命活动不可分，作用大4、 数目多少不一5、 自主复制6、 一旦消失，后代cell中不再出现（三）真核生物染色体结构 1、染色体的基本结构单位核小体（1）每个核小体单位包含200bp左右的DNA超螺旋和一个组蛋白八聚体。H2A、H2B、H3、H4各两个）及一个分子的组蛋白H1。（2）组蛋白八聚体构成核小体的盘状核心结构（由四个二聚体、两个H3A、H4形成四聚体，位于核心颗

27、粒中心，两个H2A、H2B二聚体位于四聚体两侧）（3）146bp的DNA分子超螺旋盘绕组蛋白1、75圈，组蛋白H1在核心颗粒外的20bpDNA，锁住核小体DNA的进口和出口，在稳定核小体的作用下，H1和166bp的核小体结构又称染色质小体（4）两个相邻核小体之间以DNA相连，长度o-80bp不等，典型长度60bp（5）组蛋白和DNA之间的相互作用主要是结构性的，本不依赖于核苷酸的特异序列，即具有自主装配的性质（6）核小体沿DNA的定位受不同因素的影响2、染色体包装的结构模型（1）染色体包装的多级结构模型DNA 压缩7倍 核小体 6倍 螺线管 40倍 超螺线管 5倍 染色单体（2）染色体包装的放

28、射环状结构模型DNA核小体螺线管DNA复制环微带染色单体每18个复制环呈放射状排列，结合核基质形成微带二、DNA在原核生物中存在的状态原核生物的染色体DNA的量远小于真核生物，原核生物中，细菌和放线菌的遗传物质为双链DNA，在病毒中则有DNA or RNA，是ds or ss ,呈放射状or线状。（一） 大肠杆菌染色体dsDNA+pro（Hu和H2vs）超螺旋功能域环脚手架（二） 染色体外DNA：质粒三、染色体数目 真核生物多为二倍体，原核生物多为单倍体 整倍体：个体中的染色体数为常数的整数倍。如二倍体，三倍体，单倍体 非整倍体：指个体中的染色体数为常数的非整倍数。Eg： 缺对性个体：缺少一对

29、或几对染色体 单体性个体：缺少一对或几对的一条的染色单体 二体性个体：加倍体 三体性个体：一对或几对染色体增加一条染色单体第二节 核酸一、 核酸 种类 A、T、G、C、U 磷酸核酸核苷酸 戊糖 核苷 碱基按规定，DNA or RNA的序列5写在右边，故DNA or RNA链有极性二、RNA or mRNA有二级结构。 tRNA的二级结构为三叶草，三级结构为L-型，rRNA有二级结构三、DNA 1、model double belix 2、DNA构型 3种（1）B-DNA 即Watson-crick Model ,右手螺旋，正常生理状态时，DNA为B-DNA，DNA分子每绕一圈为10.4个bp（

30、2）A-DNA 右手螺旋，高盐or脱水状态时，DNA的构型活体中DNA与RNA or RNA配对时为此种形式，DNA每绕一圈11个bp（3）Z-DNA 左手螺旋，双链中碱基平面与螺旋中轴不再成直角，Z-DNA每绕一圈为12bp，该构型多集中于调控区与基因表达的调控有关3、DNA复制（1）互补复制 （2）酶促反应（dNTP、聚合酶、Mg2+） （3）链的伸长（前导链、滞后链） （4）DNA复制的起点与复制子：独立复制的单位为复制子，高等生物为多复制子，原核生物为单复制子 （5）合成时需要合成RNA引物，这是由于DNA 复制的DNA聚合酶不能开始新的DNA的合成，只能在RNA后面先加入一个碱基脱氧

31、核苷酸 第三节 基因的组织与结构一、 基因组1、 概念：对原核生物来讲是它的整个染色体，对多倍体生物而言是指能维持配子or配子体正常功能的最低数目的一套染色体2、 DNA序列分类重复序列是基因结构的一个特点，根据重复序列可将DNA分为四类（1） 单一序列：在一个基因组中只有一个copy（2） 轻度重复序列：在一个基因组中有1-20个copy（3） 中度重复序列：在一个基因组中有1012万个copy，对基因起调节作用，一般不编码（4） 高度重复序列：在一个基因组中有几百个几百万个copy，有一些是rRNA和某些tRNA基因，大多为不编码序列二、基因1909年，丹麦遗传学家W.L Johonsson首先使用“gene”这个词，用来表达孟德