显微镜的原理和使用.docx

1、显微镜的原理和使用光学显微镜的原理和应用简介一、光学显微镜发展历史与最新进展已近400年的历史。十九世纪之前发展非常缓慢。1665年：英国物理学家R.Hoock的第一台显微镜的雏形。十八世纪初：慧更斯目镜的发明。十九世纪中：Lister和Amici制造了消色差物镜，部分消除了色差，后者首次制成水浸物镜，使数值孔径NA1。1886年：ErnstAbbe与CarlZeiss第一个生产出了复消色差物镜，消除了球差和色差的干扰，提高了数值孔径（1.4）,并奠定了现代光学理论原理。1893年：AugustK?ler教授发明了著名的柯勒照明。1890-1899年：金相显微镜、消像散透镜和双筒目镜以及第一台

2、体视显微镜的诞生。二十世纪初：出现了齐焦物镜。1932年底：诞生了透射电子显微镜，电子显微镜的分辨率是传统光学显微镜的1000倍以上。19301940年：显微分光光度计的出现，预示着显微定量技术的开始。19401950年：出现了荧光显微镜。二次大战之前：Zeiss公司基于诺贝尔奖获得者荷兰物理学家FritsZernike的光学理论制造了第一台观察活细胞的相差显微镜。1955年：物理学家GeorgesNomarski改良了Wollaston棱镜，诞生了另外一种增强活细胞反差技术的显微镜-Nomarski干涉显微镜即微分干涉差显微镜。1975年：RobertHoffman又提出了一种增强活细胞反差

3、的技术，即Hoffman调制相差显微镜。197080年：医学图像处理与分析系统197080年：流式细胞仪198090年：诞生了激光扫描共焦显微镜。比普通光学显微镜的分辨率提高了1.5倍。80年代末和90年代初：诞生了双光子扫描显微镜。二十世纪90年代末至今：全内反射显微镜，物镜数值孔径达到了1.6。分辨率：普通光学显微镜：xy-0.25m共焦显微镜：xy-0.18m,z-300nm全内反射显微镜：z-100nm4pi：z100nmSTEDxy-20nm透射电镜：xy-0.1nm二、生物光学显微镜主要种类：明场透射光显微镜：观察经过组化染色的标本。暗视野显微镜：适于观察未染色的标本-活细胞。散射

4、光成像。相差显微镜：适于观察活细胞。光相位差转换成振幅差。微分干涉差显微镜：适于观察活细胞。利用双束偏振光的干涉增强反差。荧光显微镜：观察标记了荧光探针的样品（活细胞或固定样品）。偏振光显微镜：利用偏振光观察晶体结构或具有双折射性的结构，如：细胞骨架、纤维、膜。Hoffman调制相差显微镜：观察活细胞三、光学显微镜的基本组成光学显微镜主要由光学成像部分和机械结构部分组成。光学成像：物镜、目镜、照明系统、滤片系统机械结构：镜座、镜臂、载物台、镜筒、物镜转换器、调焦装置光学成像部分：（一）物镜1.组成和作用：由凹凸透镜组成，直接使样品成放大倒立的实像（放大1100倍）。物镜品质的好坏、档次的不同决

5、定了整个显微镜的质量。2.分类1）按介质不同分类：干燥物镜（简称：干镜）（空气n=1）油浸物镜（简称：油镜）（油n=1.515）水浸物镜（简称：水镜）（水n=1.333）2）按校正像差分类：消色差物镜（achromaticobjective）平场消色差物镜（planobjective）平场半复消色差物镜（planfluotarobjective）平场复消色差物镜（planapochromaticobjective）3）按工作距离分类长工作距离物镜普通工作距离物镜4）按功能分类相差物镜偏振光物镜微分干涉差物镜5）按镜筒长度分类有限远物镜无限远物镜（二）目镜组成和作用：由凹凸透镜组成，将物镜形成的

6、倒立实像放大为10-16倍的虚像。按目镜视场数可分为：非广角目镜、广角目镜、超广角目镜等。对于10X目镜而言，视场数18mm,常称为非广角目镜。视场数R18mm,常称为广角目镜。视场数20mm,常称为超广角目镜。（三）照明系统1.视场光阑2.聚光器3.光源1.视场光阑视场光阑常位于支架底座上，其光阑大小能连续改变，它通过聚光镜能清晰地成像在标本面上。所以在目镜中看清标本的同时也能看到视场光阑多边形或圆形图像。可变视场光阑的像应外切于目镜中的视场光阑，使光线只能照明需观察的标本,尽可能减少标本四周的散射光。2.聚光镜（器）组成和作用：由前端透镜、可变孔径光阑组成。作用是改变入射光的强度，调节光束

7、大小，使光源发出的光线形成一束与物镜数值孔径大小相适应的光束，达到均匀照明标本的目的。可变孔径光阑可变孔径光阑是聚光镜中非常重要的装置，由于各个物镜的数值孔径不同，要求照明光束的孔径角也相应的变化，因此，聚光镜中必定有一个能连续改变照明孔径角的可变光阑，此光阑即为可变孔径光阑。3.光源1）照明光源：天然：阳光人工：卤素灯、高压汞灯、氤灯2）照明方式：分透射照明和落射照明简介I）透射照明：光源来自标本下方，透过样本到达物镜，透射照明光源通常采用卤素灯。目前最常见的透射照明方式：柯勒照明II）落射照明：光束通过物镜落射到标本上，物镜收集反射光，进而成像。物镜本身又作为聚光镜。主要用于荧光显微镜、反

8、射光显微镜和偏光显微镜。通常荧光显微镜采用高压汞灯或氤灯作为光源。（四）、滤片系统1.普通滤片分三类：日光型滤片：用于矫正色温，把显微镜灯光的色温转变为（DFL）阳光的色温，使彩色照片颜色还原正确。中性滤片：使光源的光减弱，对波长无选择性，也不改变（N4）色温。补偿滤片：如染色为红色可选用绿色滤片增加反差。（GREEN2.荧光滤片详见第四节（荧光显微镜）第一节透射光显微镜一、光路结构与原理第一节透射光显微镜1.成像：物体在物镜后方形成倒立放大实像（此像在目镜焦点以内）通过目镜形成倒立放大虚像（此像在眼睛明视野25cm以内）通过晶状体在视网膜上成为正立的像。2.焦点：凸凹透镜焦点，凸为实焦点，凹

9、为虚焦点。3.透镜成像的基本特性-平行于光轴的入射光通过透镜的焦点出射。-通过焦点的入射光平行于透镜的光轴出射。-通过透镜轴心的入射光出射方向不变。4.有限远光路特点：1）物体位于物镜前焦点之外2）非平行光路3）镜筒长度：物镜后焦面至目镜前焦面的距离（160mm）。5.无限远校正显微镜光路（Zeiss,1824年提出；1980年后应用）特点：1）物体位于物镜的前焦平面上2）为平行光路3）具有镜筒透镜二物镜的性能1.数值孔径（numericapertureNA）数值孔径是物镜最重要的参数之一，它直接影响物镜的分辨率和物镜的光亮度。NA=nSinun：物镜与样品之间介质的折射率u：1/2孔径角，进

10、入物镜口边缘入射光束与物镜光轴之间的夹角增大u和n,可以增大NA干燥物镜：介质为空气n=1NA:0.050.95水浸物镜：介质为水n1.33NA:0.71.25油浸物镜：介质为镜油（香柏油）n1.5NA:0.851.4工作距离：物镜前透镜与样品之间的距离为工作距离。距离越短，u越大，NA越大。通常物镜的最大数值孔径为1.4，但现在有一种特殊物镜，其数值孔径可达1.6,这类物镜用于全内反射显微镜。2.分辨率（resolutionpowerR）区分物平面两个点间最小距离为分辨距离即分辨率，它代表分辨微细结构的本领。R=0.61/NA（R=0.61/2NA）入：光波波长（通常入=550nm）NA:物

11、镜数值孔径若，NA=1.4,波长：550nm则R=0.61X0.55/1.4=0.24科0.25科是光学显微镜的极限分辨率数值孔径越大，波长越短，分辨率数值越小，而显微镜分辨能力越高。1=26.4%d=0.61/NA光学极限分辨率是由光的衍射特性决定的3.放大率(magnificationM)放大率(M)=物镜放大率(Mi)X目镜放大率(M2)物镜放大率：Mi=/Fi有限远光路：镜筒长度，物镜后焦面至目镜前焦面的距离(160mm)。Fi：物镜焦距。无限远光路：镜筒透镜的焦距目镜放大率：M2=250/F2250mm:眼到物的明视距离F2：目镜焦距。M2的放大率不超过16倍。4.景深一焦点深度(f

12、ocaldepth)Df景深表示清晰的像平面所能对应物平面前后空间的深度；或指焦点与样品上某点相一致时，能看清这一点及其上下两侧的结构，那麽，清晰部分的厚度即景深，也称之为焦点深度。Df=1/7NA*M+入/2NA2式中：Df:景深NA:数值孔径NAM:总放大率入：光波波长，单位:mm注：放大倍数越大，数值孔径越大，显微镜景深越小。5.镜像亮度(lightofimage,L)镜像亮度与数值孔径的平方呈正比，与总放大率的平方呈反比。L=NA2/M2,M2=(MiXM2注意：在同一放大率下选用不同数值孔径的物镜，其镜像亮度不同。数值孔径越高，镜像亮度越高。数值孔径相同或相差不大的情况下，物镜倍率越

13、高，镜像亮度越暗。这一点在观察荧光样品时尤其要注意，应权衡选用适当的物镜。NA对荧光图像的亮度尤其重要。6.物镜工作距离物镜工作距离越长，NA越小。Confocal中要观察厚的样品时，在相同倍率下，数值孔径接近的情况下，应选择工作距离长的物镜来观察。63x/1.32oilL:0.07mm聚光镜组成和作用：由前端透镜、可变孔径光阑组成。作用是改变入射光的强度，调节光束大小，使光源发出的光线形成一束与物镜数值孔径相适应的光束，达到均匀照明标本的目的。可变孔径光阑可变孔径光阑是聚光镜中非常重要的装置，由于各个物镜的数值孔径不同，要求照明光束的孔径角也相应的变化，因此，聚光镜中必定有一个能连续改变照明

14、孔径角的可变光阑，此光阑即为可变孔径光阑。聚光镜分为干、湿两种。所谓“湿”即使用时需滴上浸液.这类聚光镜NA为1.21.4。干”使用时不需滴浸液,NA常为0.9。徒卡还备有干、湿两用的聚光镜，NA0.9/NA1.25。数值孔径为0.9的聚光镜与孔径为1.25的100倍油镜配合使用，其分辨率不会降低。因为可变孔径光阑的大小可以为物镜数值孔径的2/33/4，即1.25*3/4=0.94,NA0.9干聚光镜正好与之相适应，也免去操作者滴油及清洁的麻烦。对于特别追求鉴别率的场合，则应采用湿聚光镜，使用时，应在载玻片与聚光镜上表面滴上相应的浸液。柯勒照明：是一种较为完善的照明方式，目的是得到最好的反差和

15、最清晰的图像。严格的柯勒照明必须符合下面三个条件：照明均匀，灯丝像位于聚光镜的前焦面上，通过聚光镜以平行光束照明标本。-孔径光阑大小可任意改变，以适应不同倍率物镜的需要。具有可变的视场光阑，以适应不同倍率物镜的不同照明范围需要。第二节物镜的分类和标识一、物镜的分类（一）按像差校正程度分类：1.消色差物镜它校正了球差，彗差和二种色光的位置色差。此类物镜存在严重的轴外像差，特别是场曲。对118mm中间像而言（以下同，成像的清晰范围约50%,即视场中心调节清晰后，边缘像模糊不?#,反之，边缘像调节清晰后，视场中心像模糊不清。物镜外壳无特殊标记。徒卡的BME及DME显微镜的物镜就属此种类型。此类物镜为

16、最低档物镜，适于普通明场观察。2.平场消色差物镜它在消色差物镜基础上，还校正了像散和场曲，像面平坦。清晰范围不低于90%。物镜外壳刻有PL或NPLAN字样。徒卡的产品目录中,NPLAN物镜就属于此类物镜。3.半平场消色差物镜这类物镜的清晰范围介于消色差物镜与平场消色差物镜之间，但明显优于消色差物镜。接近平场消色差物镜。其外壳常刻有CPLAN字样。4.平场半复消色差物镜色差的校正程度介于平场消色差物镜与平场复消色差物镜之间。但较近于平场复消色差物镜。物镜外壳刻有PLFLUOTAR此类物镜通常作为观察荧光的物镜来使用。5.平场复消色差物镜它在平视场消色差物镜的基础上，还对第三种色光校正了位置色差，

17、这种物镜成像质量最佳，其数值孔径也较同倍率物镜大。因此，鉴别率也最高，也更适于用来观察荧光。物镜外壳刻有PLAPO字样（此类物镜为最高档物镜）。（二）、按筒长分类1.筒长有限远物镜的共轲距离（物到像白距离）为195mm，物镜的机械筒长（物镜螺纹端面（物镜后焦平面）到目镜支承面（目镜前焦平面）为160mm。徒卡产品中BME,CME采用此类物镜。2.筒长无限远物镜把物体成像于无限远，因此，必须要有镜筒透镜将无限远的光线聚焦到目镜焦面上才能观察。徒卡产品中DME,DMLS,DMLB等均采用此类物镜。此类物镜的突出优点是，在物镜与镜筒透镜之间可方便地插入各种附件，而不会引起成像位置的变化，镜筒上有8标

18、识。（三）、按功能分类1.相差物镜：徒卡产品中此类物镜上刻有PH1（2或3）,数字表明应配合相应的相差环使用。2.偏振光物镜：徒卡产品中此类物镜上刻有POL3.微分干涉差物镜：徒卡产品中此类物镜上刻有D（E或C、A、B）,该字母一是代表此类物镜为微分干涉差物镜，二是表明应配合相应的屋拉斯顿棱镜使用。（四）、按工作距离分类：1.长工作距离镜头：徒卡产品中此类物镜上刻有L,通常用于倒置显微镜，用来观察培养皿的细胞。此类物镜的特点数值孔径低，非常不适于观察荧光。低倍物镜（三X10）通、常为长工作距离物镜，不需要标称L。2二、物镜外壳的标识40x/0.65160/0.17NPLAN40X/0.6500

19、/0.17.可变工作距离镜头：徒卡产品中此类物镜上刻有CORR适用于不同厚度的盖薄片。40x：有限远物镜，放大率为40倍0.65:数值孔径NA160:机械筒长160mm0.17:盖玻璃厚度（消色差物镜）NPLAN:平场消色差40x：无限远物镜，放大率为40倍0.65:数值孔径NA8；筒长无限远0.17:竖玻璃厚度第二节物镜的分类和标识第三节相差显微镜二、光学原理相差显微镜利用光的衍射和干涉特性，使相位差变成振幅差，表现出明暗对比，使人眼能辨认无色透明物体的细节（如培养的活细胞）。在相差显微镜中，为了实现相位变化向振幅变化的转变，在光路中必须满足下列两个条件：1）要能够区分通过物体的直射光和在物

20、体中被衍射的光。2）应改变非衍射光即直射光的相位和振幅，以产生进行相干干涉的最佳条件。因此，相差显微镜中利用环状光阑（相差环）和相位板来减少直射光的强度（振幅），并推迟直射光或衍射光的相位，从而创建产生相干光和干涉的条件。三、装置1.环状光阑：大小不同的环状孔做成光阑，透明部分透光，位于多功能聚光镜支架处，与相应相差物镜配合使用，此类物镜由“P膜示。作用：把直射光与衍射光所成的像分开。2.相位板：为一种玻璃板，其上装有两种膜，即：相位膜与吸收膜；两种膜重叠在一个区域范围。位置：安装在相差物镜内，位于物镜的后焦平面处。1）相位膜：喷镀氟化镁。作用：推迟直射光或衍射光的相位相位板的符号：A卡相位板

21、：推迟直射光1/4波长使直射光和衍射光处在同一相位上，两种光干涉合成光为二者振幅之和结果：物体亮，背景暗，明反差。A相位板：推迟衍射光1/4波长，使直射光和衍射光差1/2波长，两种光干涉，合成光振幅为二者振幅之差结果：物体暗，背景亮，暗反差。2）吸收膜：喷镀铭、银作用：使直射光能量衰减75%第四节微分干涉相位差显微镜（DIC）微分干涉差显微镜也是用来观察未染色的活体细胞，它是利用偏振方向不同的偏振光产生光的干涉，使物体边缘的高度差，成为光的振幅差，而形成反差来观察透明物体。一、偏振元件1.偏振片自然光（全方位振动的光）通过某个光学元件后转换成只在某个方向振动的偏振光，这种元件称为偏振元件。更确

22、切的说，应称为起偏振器。常用的起偏振器可用来使自然光转换成直线偏振光。它们是利用反射与折射，双折射和二向色性（或称选择吸收）的原理制成的。第四节微分干涉相位差显微镜二、光学原理微分干涉差显微镜和相差显微镜一样也是用来观察透明的位相物体。相差显微镜是利用透过标本细节的衍射光和周围介质的直射光，对直射光或衍射光加以干扰，使两光束满足相干条件，而达到相位差变振幅差的目的。微分干涉差显微镜是使两束偏振光中一束通过标本细节，另一束通过周围介质，进而使两束偏振光满足相干条件，以其光程差的变化转变成振幅差来观察未染色的物体。第四节微分干涉相位差显微镜第四节微分干涉相位差显微镜自然光经过振动方向为45。起偏振

23、器后成为线偏振光射向屋拉斯顿棱镜。此棱镜由二个光轴正交且平行于入射面和出射面的双折射晶体胶合而成。通常由石英晶体或方解石晶体制成。一束线偏振光在棱镜的胶合斜面上分离成二束振动方向互相垂直的寻常光（O）和非寻常光（e）,由于棱镜位于聚光镜的焦面上，经聚光镜后O光和e光平行地剪切位相物体。然后经物镜后聚焦在物镜的后焦面上。所谓屋拉斯顿棱镜2与屋拉斯顿棱镜1相仿，其差别仅仅其中一个棱镜的光轴与出射面成一定的角度.目的使O,e光的汇合在一起，棱镜胶合面使汇合点与物镜后焦面重合.这样,O,e光经此棱镜后，0光变e光,e光变O光,但又合二为一.但振动方向不在同一平面上，因此无法干涉.为此在其后方向安置一块

24、振动方向为45。的检偏振器，使O,e光在同一振动面内.相干成像于显微镜的中间像面。第五节荧光显微镜二、荧光特性1.分子不能将全部吸收的能量转变为荧光，部分能量以其它的形式释放，因此，荧光的效率总是小于1。荧光效率可由下式表示：上式中发射光量子数即荧光强度，吸收光量子数即激发光强度，在一定范围内，激发光越强，荧光也越强。荧光强度由下式表示：荧光强度=荧光效率X激发光强度2.由于分子在无辐射跃迁中失去一部分能量，因此，发射荧光的能量总是比激发光能量小，发射荧光波长总是长于激发光波长。3.一定物质在一定条件下有一定的激发（吸收）光谱和发射光谱的能力。因此，也就有最大激发（吸收）峰（MaximumEx

25、citation-Ex）和最大发射峰（MaximumEmmision-Em）。吸收光谱偏向于短波方向，发射光谱偏向于长波方向，两者成镜像对称关系。同样，最大吸收峰波长短于最大发射峰波长（ExEm）。三、光路原理荧光显微镜采用落射光光路。为使人眼能在目镜中观察到发射荧光，在显微镜光路中必须采取两个措施：1）落在标本上的光应为包括激发峰且具有一定带宽的单色光，通常由激发滤片来实现。2）对于从标本发出的光除发射荧光外，还有很强的被反射的激发光，且被标本反射的激发光的强度远远大于发射荧光的强度，因此，采用二色光分光镜和阻挡滤片双重作用来抑制激发光到达目镜。第五节荧光显微镜2.荧光滤片系统1）激发滤片：

26、位于光源和物镜之间，作用是选择适于特定荧光物质的激发波长。2）二色光分光镜：它的放置方向与激发光的方向呈45,位于激发光滤片和发射光滤片之间，具有特征值M（lecica显微镜用RKP表示）。波长短于M的光被反射，波长大于M的光可通过，也就是说它对激发光具有高反射率，而对激发出的荧光具有高透过率，它是分离激发光（短波长）和发射荧光（长波长）的一个重要组件。3）阻挡滤片：位于目镜之前。其作用是进一步使发射荧光与激发光分离，以获得更纯的发射荧光。第五节荧光显微镜4）荧光滤片的种类a）带通滤片（BP:BandPassfilter）符号BP530/30代表只允许波长在515-545nm范围内的波长通过。

27、即以530nm为中心，带宽为30nm。常作为阻挡滤片和激发滤片。第五节荧光显微镜b）长波通滤片（LP:LongPassFilter）符号LP530,代表只允许波长长于530nm的光通过，常作为阻挡滤片。思考题：若激发光为蓝光，阻挡滤片分别为带通滤片BP530/30和长波通滤片LP530时，在观察红绿荧光双标记的样品时效果有何差异？c)二色光分光镜(DichromeBeamSpliter)符号RKP510(Leica公司)，代表510nm以下波长的光被反射，510nm以上波长的光可以通过。是荧光光路中最重要的滤片装置。第五节荧光显微镜为了使用方便，常将激发滤光片，二色光分光镜及阻挡滤光片组合成一

28、个模块。对于不同的荧光染色法，必须选用合适的模块才能得到满意的结果。常用模块至少三类：紫外光激发模块UV蓝光激发模块B绿光激发模块G这些模块对应着不同染色法，如B模块常用FITC染色法，G模块常用TRITC染色法。第六节显微镜的使用1.柯勒照明的调节：a.用10x物镜将标本调节清晰。b.可变视场光阑关至最小。c.上下调节聚光镜，使可变视场光阑的多边形图像在目镜中清晰可见，调节聚光镜调中螺钉，使可变视场光阑居中，打开可变视场光阑，使其外切于目镜视场光阑。d.拔出目镜，用肉眼直接观察物镜后焦面，调节可变孔径光阑，使可变孔径光阑的大小为物镜通光孔的2/33/4，插入目镜观察。或者不用拔出目镜，将可变孔径光阑的显示数字(18)设置为物镜数值孔径的78倍即可。第六节显微镜的使用物镜的正确选择：1.观察荧光时尽可能使用高数值孔径物镜。2.物镜工作距离与样品厚度。3.功能物镜与相应功能的配套使用。4.注意盖片厚度对成像的影响。5.聚光镜的数值孔径与物镜数值孔径的配合。