果实和种子.docx

1、果实和种子果实和种子的形成是作物产量形成的基础，受精是种子和果实产生的前提。所以在被子植物的发育过程中，双受精现象显得尤为重要。双受精过程是指雌、雄配子体的相互识别后，一个精子与卵细胞结合，发育成胚；另一个精子与中央细胞结合，发育成胚乳，为胚的发育提供营养。雄配子体又称为花粉粒，能够在柱头上萌发产生花粉管，运输两个精细胞到雌配子体的珠孔端。雌配子体即为胚囊，来自于由胚囊母细胞，具有多种类型，包藏于被子植物珠心中。蓼型胚囊为 8核、7细胞的结构，包括一个卵细胞、两个助细胞、两个中央细胞核（极核）和3个反足细胞。根据蛋白质的结构，解旋酶可分为多种类型。主要包括：（1）超家族I（Superfamil

2、y I）： UvrD：存在于E. coli，作用于DNA修复；Rep：E. coli，DNA复制；PcrA：Bacillus stearothermophilus，角色未明；Dda：bacteriophage T4，复制起始。（2）超家族II（Superfamily II）：RecQ：E. coli，DNA修复；eIF4A：酿酒酵母，RNA转译；WRN：人类、DNA修复；NS3：丙型肝炎病毒，复制；TRCF（Mfd）：E.coli，转录-修复偶合因子（transcription-repair coupling factor）。（3）超家族III（Superfamily III）：LTag：SV

3、40，复制；E1：人类乳突病毒（human papillomavirus），复制；Rep：Adeno-Associated Virus（AAV），复制、site-specific integration、virion packaging。（4）类DnaB家族（DnaB-like family）：DnaB：E. coli，复制；gp41：bacteriophage T4，DNA复制；T7gp4：bacteriophage T7，DNA replication。（5）类家族（Rho-like family）：Rho：E. coli，转录终止因子（Transcription termination

4、factor）。RNA解旋酶家庭是由几个高度保守的序列组成。他们存在于所有的生物中，从细菌到人类，还有很多病毒。目前在真核细胞中发现的最小的RNA 解旋酶可以从酿酒酵母完整的序列中被预测。近年来不同家庭成员的功能分析已经有了全新的见解，并认识到这些蛋白质的重要性，它们大多数参与细胞的RNA代谢过程。RNA解旋酶是指解链的dsRNA酶。这种解链活性与核苷三磷酸（NTP）的水解有关，并且优先于ATP。在大多数情况下，依赖于NTPase的活性或受RNA影响。相比于DNA 解旋酶常规的dsDNA 结构，大多数RNA 解旋酶可能只在一步反应中调节RNA分子的部分区域。然而，精确的机制以及这些酶的底物并没

5、有被定义。虽然我们一般认为酶的反应底物是dsRNA，它也可能是一个RNA-protein复合物。有些研究人员因此将这些蛋白质称为RNA依赖的 NTPases或RNA 解旋酶，与DNA 解旋酶相区分。其作用机制尚不清楚，人们仍保留RNA解旋酶这个名字。Helicases,包括DNA和RNA Helicases,依据七个保守的Motif可分为两个主要的蛋白质亚家族(SFI和SFII)。RNA解旋酶大多为SFII家族（Fairman-Williams et al., 2010），少数属于SFI。SFI 一般是真菌中的解旋酶；高等植物、酵母、动物中一般都是SFII，它又分为DEAD-box、DEAH-

6、box、DExH、RecQ 和SW1/SNF（Jankowsky and Fairman, 2007）。依据它们特殊的保守序列可以进一步分类。通过研究ATP和核糖核酸绑定,ATP水解和解链活性可以进一步解释这些保守序列的作用。除了解旋酶区域，大多数RNA helicases还包括N 端和/或C末端。这种模块化组织表明,核心区域的功能相当于一个ATP依赖的发动机；末端区域可能具有底物特异性，包括蛋白质和/或额外的RNA结合区域,和/或可能直接作用于蛋白质的亚细胞定位。迄今为止, 不同RNA-helicase家庭中多于10个细胞和病毒蛋白已被证明具有体外RNA-helicase活性。因此,多数家族

7、成员都有RNA解旋酶活性的推测也是合理的。根据氨基酸序列分析发现，不同生物解旋酶都有9 个高度保守的序列，分别为Q、I、Ia、Ib、II、III、IV、V 和VI（Fairman-Williams et al., 2010）（图1-1），猜测这些解旋酶可能起源于相同的基因。其中这些保守的区域都是ATP 酶、解旋酶活性以及NTP 和DNA 结合的功能区。如Ia 区通常是GTP 和ATP 结合的区域；区是ATP 结合蛋白B 区的特殊翻版；I 区可形成套索结构与NTP 磷酸结合，属于ATP 结合蛋白的A区；而区保守的天冬氨酸与镁离子介导的磷酸结合有关；Ia 和 区的保守酪氨酸可能与DNA 结合蛋白相

8、关，涉及多核苷酸的结合；基序VI 则参与ATP 磷酸盐的结合；其他的基序（Ia、Ib、IV、V）则参与RNA 结合以及通过结合RNA激活ATP 水解酶的活性；III 是RNA 解旋酶活性必需的结构。DEAD-box RNA解旋酶是一个依赖ATP的RNA解旋酶大家族，该家族最早由Under等人发现的，在RNA解旋酶中属于最常见的一类酶蛋白，广泛存在于从原核生物的细菌到真核生物的酵母、植物和动物中。这种酶含有两个RecAlike结构域（RecA-like domains），催化RNA转变成较高级别结构。 鉴定DEAD-box RNA 解旋酶的标准是同时存在九个高度保守的模体。在高等植物中，已经鉴定

9、了很多的DEAD-box RNA 解旋酶，其中包括拟南芥基因组中的58 个DEAD-box RNA 解旋酶成员。在植物中，已经研究发现DEAD-box RNA解旋酶在花的分生组织、叶绿体分化、植物形态的发生、幼苗生长与发育过程的调控、mRNA的输出、植物发育等过程中起着重要的作用，具有广泛的生理意义。DEAD-box 蛋白家族是由Linder 等人（Linder P et al., 1989）于1989年确定的。他们比对了与真核起始因子eIF4A 同源的八个蛋白（小鼠eIF-4A，eIF-4A，小鼠PL10，酵母TIF-4A，酵母MSS116，人p68，果蝇vasa，大肠杆菌SrmB），发现它

10、们都存在几个高度保守的模体，Linder 等人因此确定了DEAD-box 蛋白家族。这九个高度保守的模体（Linder P et al., 1989; Tanner N K et al., 2003)，分别为Q 模体, 模体（WalkA 模体），模体a，模体b，模体II （WalkB 模体），模体III，模体IV，模体V和模体VI（图1-4）（Linder P et al., 2006）。根据高度保守模体 的氨基酸序列D-E-A-D (AspGluAlaAsp) (Cordin O et al., 2006）将其命名为DEAD-box 蛋白家族。在这些保守模体中，Q 模体，模体.，模体以及模体

11、都参与了ATP 的结合和水解(Tanner N K et al., 2003; Blum S et al., 1992; Pause A et al., 1994; Pause A et al., 1992; Sviykin Y V et al., 2001),而模体.a，模体.b，模体，模体和模体，可能与RNA的相互作用和分子内重排(Sviykin Y V et al., 2001)有关。虽然DEAD-box RNA 解旋酶具有高度保守的核心序列，但是不同成员功能各异，相互之间不能取代。因此，对不同成员的生物学功能研究越来越受到关注。已经证明DEAD-box RNA 解旋酶蛋白家族参与RNA

12、代谢的方方面面。他们在多数生物中作为RNA helicases或RNPases存在。这些酶在有机体内的具体作用虽然不好描述,但是在体外已经被广泛证明,现在很多的晶体结构被采用。这给ATP的调节和核糖核酸绑定以及ATP酶和解旋酶的活动提供了帮助。它能利用RNA依赖的ATP酶活性催化RNA二级结构的构象发生变化，参与RNA的代谢。除此之外，DEAD-box RNA解旋酶还参与RNA转录、前体mRNA剪切、核糖体的发生、核质运输、蛋白质翻译以及RNA降解等生物学过程。在植物的研究中也已经发现DEAD-box RNA解旋酶在花的分生组织、叶绿体分化、植物形态发生、幼苗的生长与发育、mRNA的运输、植物

13、发育等过程中起作用，具有广泛的生理意义。 DEAD-box RNA解旋酶响应非生物胁迫。AtRH9和AtRH25（Kim Y S et al., 2008）在冷应激反应条件下明显上调,而在盐和干旱胁迫下转录水平明显下降。转基因植物和T-DNA插入突变体的表型分析表明超表达AtRH9或AtRH25导致盐胁迫条件下拟南芥种子萌发推迟。AtRH25,但不是AtRH9能够增加拟南芥植物的耐寒性。AtRH9和AtRH25都能够替补 BX04大肠杆菌对冷敏感的表型的突变细胞,但AtRH25比AtRH9的互补能力更加突出。体外核酸绑定实验表明,AtRH9绑定顺序一样,而AtRH25优先绑定poly(G)。总

14、的来说,这些结果说明AtRH9和AtRH25在盐胁迫条件下影响拟南芥植物种子萌发,并且AtRH9和AtRH25之间耐寒性能力的差异主要源于不同的核酸结合属性。另外还有拟南芥的STRS1基因,能够抑制植物对盐胁迫，渗透胁迫和热胁迫的应答（Kant P et al., 2001）；STRS2,抑制植物对盐胁迫，渗透胁迫，热胁迫的应答；增强植物对低温胁迫(零上低温和零下低温)的抗性(Kant P et al., 2001; Kim J S et al., 2008)；PMH1对低温下上调；对盐胁迫以及干旱胁迫下下调；主要定位于线粒体；(Matthes A et al., 2007; Kim J S

15、et al., 2008)；大麦HVD1： 对盐胁迫和冷胁迫下上调；定位于叶绿体 (Nakamura T et al., 2004)；豌豆PDH45：过表达能够增强植株的抗盐性；在盐胁迫，低温，损伤，甘露醇，ABA 处理条件下均上调(Sanan-Mishra N et al., 2005)以及紫花苜蓿MH1 ： 干旱胁迫，盐胁迫，ABA 处理后上调，定位于细胞核(Luo Y et al., 2009)。总之，DEAD-box RNA 解旋酶在植物的应答胁迫反应中发挥着极其重要的作用。DEAD-box RNA 解旋酶参与营养物质的运输。植物细胞间运输通道，胞间连丝(PD),能够穿过细胞壁,使大分

16、子在细胞间运输。ise1（Solomon Stonebloom et al., 2009）是拟南芥中的一个胚胎致死突变体，导致PD的增加。ise1突变体比野生型的胚胎具有更高频率的分支PD。ISE1编码一种特定的植物DEAD-box RNA解旋酶，定位于线粒体。 DEAD-box RNA 解旋酶与植物细胞的增殖有关。拟南芥分生组织能够产生特定的器官,使细胞分裂停止。Steven 等人(Jacobsen S E et al., 1999) 在1999 年发现拟南芥一个隐性突变体 caf，能够把植物的分生组织转换为不确定的状态。它们产生额外的雄蕊轮生体以及数量不定的心皮。因此，推测CAF可能抑制植

17、物分生组织的细胞分裂。另外caf突变体植株还显示其他缺陷，包括缺乏腋生的花序分生组织，和异常形状的叶子和花器官。CAF基因编码1909个氨基酸的蛋白质，其中包含一个N端DExH / DEAD-box类型RNA解旋酶区域，连接到C端的RNAseIII-like区域。DEAD-box RNA 解旋酶在有丝分裂中起作用。AtRH36（Huang C K et al., 2010）， 在拟南芥中编码DEAD-box蛋白。该基因在整个植物中都有。atrh36-1 和atrh36-2的纯合突变体均无法获得。杂合体后代中野生型与杂合体的比值约为1:1，这表明atrh36基因参与了配子体的形成。根据正反交实验

18、发现AtRH36主要参与雌配子体发育。在atrh36-1中雌配子发育被延迟，同一个雌蕊中存在不同时期的雌配子体。敲除AtRH36基因出现多种表型，导致未加工的18 S pre-rRNA的积累。这些结果表明，AtRH36在雌配子发育过程中对有丝分裂至关重要，在拟南芥rRNA生物起源中扮演一个重要的角色。DEAD-box RNA 解旋酶参与营养器官的发育。例如，在上面提到的caf 突变体中，其叶片增厚，叶腋次生分生组织缺失，部分叶片退化成丝状结构(Jacobsen S E et al., 1999)。还有vdl突变体出现叶片畸形，根的生长受到明显抑制(Wang Y C et al., 2000)等

19、表型。DEAD-box RNA 解旋酶参与植物的有性生殖过程。在拟南芥突变体caf 中比野生型多出一到两轮雄蕊圈，其雌蕊也出现明显异常：雌蕊由一个雌蕊柄和两个不育的未融合心皮组成，不同于正常由两个融合的心皮组成的雌蕊。在第一轮心皮的内部还可见到类似心皮的其它组织。另外，烟草eIF-4A8 基因在花粉中特异表达(Op den camp R G L et al., 1998)，玉米的一个DEAD-box RNA 解旋酶基因ZmDRH2 在花粉发育的后期表达上调(Kato A et al., 2001)。DEAD-box RNA 解旋酶还参与miRNA以及核糖体RNA 的代谢。2001 年，Wonk

20、eun Park 等人发现CAF 对拟南芥miRNA 的生物发生是必须的，在突变体caf-1 中，只有少量miRNA 的积累。玉米中发现的一个与MA16 互作的DEAD-box RNA 解旋酶ZmDRH1，MA16 是一个富集甘氨酸的RNA 结合蛋白（GRP），使ZmDRH1 能够与核纤维蛋白(fibrillarin)发生相互作用。ZmDRH1 蛋白主要定位于细胞核的核仁中。推测ZmDRH1 和MA16 可能是核糖核蛋白复合体的组成部分，它们同时参与了核糖体RNA(rRNA)的代谢过程。雄配子体，也称为花粉粒或小配子体，在雄蕊的花药中产生，并且由两个精子细胞包裹在营养细胞中(McCormick

21、, 1993, 2004)。雌配子体，也称为胚囊或大配子体，在胚珠内发育，主要存在于心皮中。最常见的雌配子体形成，如图1-5所示，由四个不同的细胞类型即8 核7 细胞的结构: 近合点端的三个反足细胞，在受精前就降解，可能起吸收、转运和分泌营养物质到胚囊的作用（Chaudhury et al., 1997; Yang et al., 2000）；两个助细胞，主要作用是引导花粉管进入胚囊，并且分泌某些酶，使花粉管的末端破裂，释放精子，从而促进精子和其他内含物质进入胚囊，此外还有吸收、贮藏、转运珠心的物质进入胚囊的功能；近珠孔的一个卵细胞， 胚囊中完成受精发育成胚；一个中央细胞(Maheshwari

22、, 1950) （内有2 个极核，或者一个次生核），受精后发育成胚乳（Walbot et al., 2003）；用于储藏营养物质。有些植物的胚乳在种子发育的后期降解，推测可能给胚的发育提供营养。雌配子体发育是被子植物生殖过程中至关重要的步骤，与花粉管导向、受精、种子的发育以及受精后的母系遗传有关（Yadegari R et al., 2004）。开花植物雌配子的发育开始于功能大孢子，在大孢子母细胞（MMC）减数分裂后形成(Olmedo-Monfil V et al., 2010)。通过分析拟南芥和玉米的雌配子体发育阶段的突变体，可以揭示雌配子体发育过程的调节机制。此外，在雌配子体中突变体基因缺

23、陷也导致胚乳的发育异常。从这些研究中，我们可以理解并构建参与雌配子体发育和调节的网络。在发育过程中，雌配子体呈现沿chalazal-micropylar轴的极性生长。大孢子母细胞经过减数第一次分裂，会形成两个含有单倍体的细胞核，遗传物质减半。随后胞质分裂成两个不等大的细胞。功能端的细胞从大孢子母细胞中继承较多的细胞质，所以比较大。而非功能端的细胞虽然也含有大孢子母细胞中的各类细胞器，但是因为接受了比较少的细胞质，所以体积比较小（Christensen et al., 1997）。大孢子母细胞经过减数第二次分裂会形成四个大孢子。四个大孢子中哪一个会成为功能大孢子常常是固定的。在蓼属植物中，靠近合

24、点端的大孢子存活，其他三个大孢子细胞死亡。在细胞分化过程中，珠孔端形成卵细胞、中央细胞、助细胞，合点端形成三个反足细胞。据推测，大孢子母细胞的不均等分裂，以及分裂形成的四个大孢子沿合点珠孔轴的相对位置排布，共同决定了大孢子的命运（Schneitz et al., 1995）。在拟南芥雌配子体的发生过程中，从功能大孢子开始到发育成成熟的胚囊是一个连续的过程，人为的将其分为七个时期，即FG1 期、FG2 期、FG3 期、FG4 期、FG5 期、FG6 期和FG7 期（Schneitz et al., 1995; Christensen et al., 1997）。其中FG1 期的显著特征是功能大孢

25、子在细胞质成分上已经有明显的增加，体积增大，核糖体和粗糙内质网的数目增多，线粒体和质体呈多种形状并开始分裂。FG2期主要是发生核分裂，形成一个含高浓度核糖体的双核的胚囊，并且含有较多的粗糙内质网和高尔基体。随着有丝分裂的进行，中央大液泡形成，将两个细胞核分开，一个位于珠孔端，一个位于合点端，并逐渐增大，约占据雌配子体体积的三分之一，即FG3 期（Webb et al., 1990）（图1-7）。随即开始第二次有丝分裂，产生四核雌配子体，这四个核在形状上并无明显区别，此时中央液泡、合点端的液泡继续与脂质体、内质网、小囊泡、造粉体等细胞器发生融合，胚囊体积进一步增大，到达FG4期（图1-7）。在F

26、G5 期四核雌配子体进行核分裂，产生八个核，被中央液泡分开，形成4n+4n 的格局。细胞核的大小也没有明显的区别。此时的雌配子体处于FG5发育的早期。不久，将来发育成极核的两个核会逐渐增大，和其他核的大小出现明显差异。位于合点端的的极核逐渐向珠孔端移动，同时位于珠孔端的极核也会向反方向移动，最终，在中央液泡的中部相遇。此时细胞边界、液泡和极性等逐渐形成。FG5 期另一个变化是细胞化的完成，形成含有七个细胞的八核胚囊，此即FG5 晚期（图1-7）。FG6 期的主要特征是两个极核融合。在细胞化完成后不久，处于胚囊中部的两个极核相互融合，形成一个二倍体的中央细胞核（次生核）。这个时期存在时间较短。另

27、外在中央细胞中含有大的中央液泡和一个2n 的中央细胞核，占据胚囊的绝大部分（图1-7）。大多数物种中，在受精以前反足细胞就已经退化，这就是通常所说的FG7 时期，此时的雌配子体已经具有在生理上完全成熟的结构（图1-7）。卵细胞、助细胞和中央细胞高度极性化，卵细胞靠近合点端，大液泡占据珠孔端三分之二的位置，有人认为卵细胞的高度极性化可能与胚胎发生过程中顶-基轴的建立有关；两个助细胞则与卵细胞的极性相反，液泡靠近合点端；中央细胞核和细胞质靠近卵器。此时的雌配子体已经准备好接受花粉管运输的两个精细胞，为双受精做准备（Murgia et al., 1993; Schneitz et al., 1995

28、; Christensen et al., 1998; Yadegari et al., 2004）。人们认为花粉外壁蛋白、蜡、脂质提供花粉附着和萌发所需的信号。事实上，突变引起改变的蜡状表皮会导致花粉缺陷和发育受损。例如, cer 和pop-1突变体，花粉败育影响水合(Preuss et al., 1993; Hlskamp et al., 1995a)，花粉粒的含油层缺乏长链脂质。这些数据表明，长链脂质作为信号刺激花粉水合，对花粉管萌发起作用(Wolters-Arts et al., 1998)。一个助细胞就足以产生吸引花粉管的信号，两个细胞则使这种信号增强。受精后, 尽管一个助细胞持久存

29、在，胚囊不再吸引花粉管。这可能参与阻止多精入卵（Higashiyama T et al ., 2001）。花粉管生长、调控和指导花粉管导向珠孔吸引越来越多的研究者。这些过程被视为控制受精和繁殖的重要阶段，也作为一个有吸引力的模型暗示生长、细胞间的相互作用和信号转导（Franklin-Tong V E et al., 1999）。通过对突变体的分析，已经分离到一些影响胚胎发育的基因。LEC2 基因编码一个含 B3 区域的转录调控因子，来调控胚的正常发育，在胚发育早期和后期都有大量表达（Stone et al., 2001）。FACKEL 基因编码一种固醇还原酶类（sterol C-14reduc

30、tase），主要影响发育过程中胚细胞的分裂和增大（Sieburth and Meyerowitz, 1997）。拟南芥 AP2 基因属于 AP2/EREBP 转录因子，参与调控花器官，花分生组织的建立以及胚珠和种皮的发育等过程。研究发现，AP2 是通过母本效应来影响种子的大小，AP2 基因对种子大小的母本控制主要有对胚的细胞数目和大小的调控（Ohto et al., 2005）。ANT 基因编码属于类 AP2 家族中的一个转录因子（Elliott et al., 1996; Klucher et al., 1996）。过表达 ANT 基因导致植株的叶、花、角果和胚珠的体积都变大。但是由于 AN

31、T 过表达植株的花粉囊及胚珠的不正常增大，导致大部分过表达的株系种子败育。当采取人工授粉使转基因植株中 ANT 基因适度表达，结果就产生了增大的胚，这得益于胚细胞增殖时期的延长（Mizukami and Fischer, 2000）。RETARDED GROWTH OF EMBRYO1 (RGE1)是碱性-螺旋-环-螺旋（bHLH）转录因子家族的一员（Heim et al., 2003）。RGE1 功能缺失突变体在心形胚后出现发育迟缓的现象，但是胚的形态转变和形成模式正常，从而产生干瘪变小的种子（Kondou et al., 2008）。GNOM编码鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF），主要作用于

32、ADP 核糖基化因子（ARF）-G 型蛋白，通过影响合子的第一次分裂起作用，gnom 突变体中合子的第一次分裂是对称的，这与正常合子的不对称分裂不同。作为一种营养物质，胚乳在种子的发育成熟过程中，有的会被耗尽，有的会一直存在到种子的成熟，如禾谷类。胚乳在种子的发育中主要参与营养物质转运到胚中(Hirner et al., 1998)。在少数种类植物中，原初胚乳核的分裂比合子的提前，推测胚的发育可能依赖胚乳的早期发育。已经鉴定的三个编码蛋白质的基因，在抑制种子发育中起作用，特别是在未授粉或未受精的条件下影响胚乳的发育。这些基因的突变体，FIS1、MEA(4 - 6)、FIS2(4、5)和FIS3

33、或FIE(4、5、7)，能够产生两个重要的表型：未授粉的情况下种子正常发育；如果授粉，在心形胚阶段种子发育受阻，胚乳不能正常细胞化（Luo M et al ., 2005）。另外，人们通过分子遗传学手段鉴定出一些通过调控胚乳发育影响种子大小的基因，如AP2基因编码植物特异的转录因子，并且含有由68个氨基酸组成的AP2结构域（Riechmann and Meyerowitz, 1998）。该突变体表现为种子变大，胚的数目和大小都增大（Jofuku et al., 2005; Ohto et al., 2005），种皮的表皮细胞变长，中央细胞增大，并且胚乳的细胞化过程延迟。影响胚乳发育的调控因子还有IKU2和MINISEED3，其对应的突变体均表现为种