细胞生物学实验指导汇总.docx

1、细胞生物学实验指导汇总实验一动物细胞的传代培育一、实验目的1熟习细胞培育过程中的无菌操作技术。2认识细胞传代培育的基本方法和主要操作步骤二、实验原理细胞培育 (cell culture)是指从机体内拿出某种组织或细胞，模拟机体内的生理条件使其在体外生计、生长和生殖的过程。细胞的体外培育在细胞生物学和医学研究领域有着极为宽泛的用途，这一技术已成为研究细胞生理、细胞增殖、细胞遗传、细胞癌变和细胞工程等课题的一项不行缺乏的手段。细胞培育技术的突出长处在于能为研究者供给大批的生物性状同样的细胞作为研究对象，便于人们在体外利用各样不一样的方法从不一样的角度研究细胞生命活动的规律。此外，利用细胞培育技术还

2、可令人们较为方便地研究各样物理、化学和生物要素对细胞构造和功能的影响。细胞培育可分为原代培育和传代培育 2 种状况。所谓原代培育 (primary culture) 是指直接从机体拿出组织或细胞后所进行的初次培育。 而传代培育 (subculture)是指当原代培育的细胞增殖到必定密度后，将其从原培育容器中拿出，以 1：2 或其余比率转移到另一个或几个容器中所进行的再培育。传代培育可简称传代。在体外培育过程中，要使细胞能正常地生长、生殖，需常常对其进行传代。传代的积累次数就是细胞的代数。在从事细胞培育工作时常常会接触到 细胞系 (cell line)和细胞株 (cell strain)这两个简

3、单混杂的观点。一般以为，细胞系指经过原代培育并经传代后所形成的细胞集体，因为细胞系根源于原代培育，而原代培育物中所含的细胞种类许多，故一个细胞系常常由多个生物学性状不一样的细胞集体所构成，而细胞株是利用 单细胞分别培育法或克隆形成法 从原代培育物或细胞系中选择出的细胞集体，一个细胞株常常拥有特别的生物学性状或标志并可连续存在。细胞培育是一种程序复杂、条件许多且要求严格的实验性工作。因为细胞在体外的生长、生殖会遇到温度、营养物质、酸碱度、浸透压及微生物等多种要素的明显影响，故细胞培育工作的各个环节如培育器皿冲洗消毒、营养液配制和除菌、 pH 值调整、温度调理等操作都有严格的要乞降规定，特别要注意

4、无菌操作，这是细胞体外培育成败的重点。三、实验资料人肝癌细胞株HepG2四、实验器材CO2恒温培育箱、超净工作台、恒温水浴箱、倒置相差显微镜、电热高压蒸汽消毒锅、细胞培育瓶、培育皿、吸管、除菌滤器、小烧杯、100mL 玻璃试剂瓶、橡皮瓶塞、酒精灯、记号笔。五、实验试剂1 DMEM 培育液：用天平称取 DMEM 培育基粉剂(质量依实验所需培育液的总量而定 )倒入烧杯中，按说明书要求加入三蒸水、NaHCO3、谷氨酰胺，利用磁力搅拌器使加入的固体物完好溶解， 而后加入适当浓度为20000 单位 /mL 的青霉素和1链霉素，使培育液中这两种抗菌素的浓度分别达到 100 单位 /L 。再按比率加入胎牛血

5、清，使其在培育液中的含量达到 20，将溶液充足混匀，用 5%的 NaHCO3和 1M 的 HCl 调培育液的 pH 值至。最后采纳孔径为 0.22m 的针头式滤器过滤除菌。2 PBS(不含钙镁， pH7.2)：分别称取 NaCl 8.00g、KCl 0.20g、Na2HPO4 1.15g、 KH 2PO4 0.20g，加三蒸水溶解并定容至 1000mL。3 D-Hanks 液；D-Hanks 原液：分别称取 NaCl 80.0g、Na2HPO4.2H20 0.6g、KCl 4.0g 、KH 2PO40.6g、NaHC03 3.5g，加三蒸水溶解至l000mL 。配制时要注意按次序逐个加入溶解，

6、应等前一种药品完好溶解后再加下一种药品，原液配好后应分装于250mL 或500mL 玻璃瓶中，高压灭菌，置冰箱内储存。 D-Hanks 工作液：取 D-Hanks 原液 l00mL ，加三蒸水 896mL，再加 0.5的酚红溶液 4mL 混杂均匀即成。40.25胰蛋白酶 (pH7.2-7.6)：称取活性为 1：250 的胰蛋白酶 0.25g，另准备 D-Hanks 工作液 100mL。先用少许 D-Hanks 工作液将胰蛋白酶粉调成糊状，再将节余的D-Hanks 工作液所有加入，充足搅拌使酶充足溶解，必需时可将容器置于 36恒温水浴箱中，直至酶液清明，再用 NaHCO3调 pH 至。而后用玻璃

7、滤器除菌，分装于灭菌后的 EP 管中，密封后置冰箱冷冻室 (-18)中储存。六、实验方法（一）实验过程中无菌操作的要求1培育用品的冲洗消毒：实验中所需的玻璃器皿 (如培育瓶、离心管、吸管、小瓶等 )和器材 (如剪刀、镊子等 )应完全冲洗洁净， 干燥后用牛皮纸包好置高压蒸汽消毒锅中消毒灭菌 (蒸汽压力为 103kPa，20min)。而培育液、 PBS 液、胰蛋白酶液、 PBS 液等应利用抽滤法除菌。将已消好毒的实验所需物件采集并盘点好置于超净工作台内，防止实验开始后再从工作台外取物而受污染。为操作时方便，工作台内的用品应合理布局，原则是右手使用方便的用品放在右边，左手使用方便的用品放在左边，酒精

8、灯放在中央。2超净工作台的消毒：超净工作台在使用前可用75酒精纱布将其内部揩擦一变进行初步消毒，而后翻动工作台内的紫外线灯照耀消毒 20-30min。照耀杀菌完成后封闭紫外线灯并同时翻开风机，因为进入工作台内的空气是经过工作台上的除菌滤板过滤的，故工作台内是一个相对无菌的环境。3手的消毒：操作时双手及前臂要伸入超净工作台内，预先双手一定用肥皂洗刷洁净，而后用 75的酒精棉球擦抹消毒。在夏天，手的洗刷和消毒应至肘部；在冬天，双手消毒后进入工作台前应戴上无菌的袖套。4操作过程中的消毒：在超净工作台中开始操作时第一应点燃酒精灯，今后的一切操作如翻开或加盖瓶塞、安装吸管皮头、使用吸管、使用各样金属器材

9、等均要经酒精灯的火焰炙烤或在火焰旁边进行操作。培育操作时，动作要正确教捷，不可以用手涉及器皿的消毒部分，如不慎涉及，要用火焰消毒或改换。开盖的培育液或培育用瓶应尽量保持斜位搁置或平放，以防止瓶口长时间直立而增添细菌污染2的时机。汲取不一样液体时应分别使用不一样的吸管，不要混用以防扩大污染。（二）细胞的传代培育当培育瓶中的细胞已长成致密单层时即可进行传代培育，其操作步骤以下。1准备：将所需培育器具冲洗消毒后放入超净工作台内并摆好，紫外线消毒30min。将已形成致密单层细胞的培育瓶从培育箱中拿出放入超净工作台中。点燃酒精灯，在酒精灯旁将培育液倒入一小烧杯中。2消化：向培育瓶中加入消化液 (0.25

10、的胰蛋白酶 )500 L ，轻摇培育瓶，使消化液润湿整个细胞单层，置室温下 2-3min。翻转培育瓶使其底部向上，用肉眼观察细胞单层，如细胞单层上出现缝隙 (约针孔大小 )时即可倒去消化液；假如末见缝隙，说明消化程度不够，可将消化时间稍延长；假如发现细胞已大片零落，说明已消化过，在这类状况下不可以倒出消化液，而应直接进入下步操作。3停止消化：往培育瓶中加入3.5mL 培育液以停止胰蛋白酶的消化作用，用吸管汲取瓶中的培育液频频冲击瓶壁上的细胞，直至所有细胞被冲下，轻轻混匀制成细胞悬液。4计数：汲取少许细胞悬液于细胞计数器的小室中，光镜下计数，依据结果将细胞浓度调整至 5105/mL( 细胞接种的

11、密度亦可依据经验进行 )。5传代：汲取 2mL 细胞悬液移入另一培育瓶中， 原培育瓶中留下 2mL 细胞悬液 (其余弃去 )，并向每瓶中加入新培育液 4mL ，盖好瓶塞，轻轻摇匀后置 37恒温箱中培育。6观察：传代后每日应付培育的细胞进行观察，若细胞贴壁存活则称为传了一代，如培育液变酸发黄要实时改换。七、注意事项在整个细胞体外培育过程中，要一直保持无菌的观点，在操作的众多环节中要注意消毒灭菌，努力做到最大限度的无菌，严防细菌的污染，不然将致使细胞培育的失败。八、实验报告写出细胞传代培育的实验记录。并记录传代培育后的贴壁细胞的生长状况。九、思虑1在细胞培育过程中，培育液的颜色为何会变黄？2在细胞

12、培育的过程中防止污染的重点环节有哪些？3实验二绿色荧光蛋白重组质粒的细胞转染一、实验目的1认识细胞转染的实验原理2掌握细胞转染的方法二、实验原理惯例转染技术可分为两大类， 一类是刹时转染， 一类是稳固转染 （永远转染）。前者外源 DNA/RNA 不整合到宿主染色体中，所以一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但往常只连续几日，多用于启动子和其余调控元件的剖析。一般来说，超螺旋质粒 DNA 转染效率较高，在转染后 24-72 小时内（依靠于各样不一样的建立）剖析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白， 半乳糖苷酶等来帮助检测。后者也称稳固转染，外源 DNA 既能够整合到宿主染色体中，也

13、可能作为一种游离体（ episome）存在。只管线性 DNA 比超螺旋 DNA 转入量低但整合率高。外源 DNA 整合到染色体中概率很小，大概 1/104转染细胞能整合，往常需要经过一些选择性标志，如来氨丙基转移酶（ APH ；新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸转移酶（ HPH），胸苷激酶（TK ）等频频挑选， 获取稳固转染的同源细胞系。转染技术的选择对转染结果影响也很大， 很多转染方法需要优化 DNA 与转染试剂比率，细胞数目，培育及检测时间等。一些传统的转染技术，如DEAE 右旋糖苷法，磷酸钙法，电穿孔法，脂质体法各有益弊。除上述传统方法外，最近几年来国际上推出了一些阳离子聚合物基因转染技术，

14、以其合用宿主范围广，操作简易，对细胞毒性小，转染效率高。此中聚乙烯亚胺（Polyethylenimine，PEI）是一种多用途的转染试剂对各样贴壁细胞有较高的转染效率、也合用于转染悬浮细胞和原代细胞。可用于转染大分子 DNA 、小分子寡核苷酸和 siRNA 等。 PEI 是一种拥有较高的阳离子电荷密度的有机大分子，每相隔二个碳个原子，即每 “第三个原子都是质子化的氨基氮原子，使得聚合物网络在任何 pH 下都能充任有效的“质子海绵 ”(protonsponge)体。这类聚阳离子能将各样报告基因转入各样种属细胞。大批实考证明， PEI 是特别有希望的基因治疗载体。当前在设计更复杂的基因载体时， P

15、EI 常常作为核心构成成分。本研究即取传代培育后细胞交融率在 70%-90%的 HepG2 细胞，将建立好的含有绿色荧光蛋白 （EGFP）报告基因标志的重组质粒， 转染细胞并使细胞表达 EGFP报告基因。三、实验资料体外培育的人肝癌HepG2 细胞株。带有 EGFP 报告基因标志的质粒。四、实验试剂无双抗的 PBS 缓冲液，无双抗 15%血清 DMEM ，胰酶，无血清无双抗的 DMEM 培育液。五、实验方法细胞转染操作（以6 孔板或 35mm 细胞培育皿为例）1待细胞长至75%密度时（此时成效为最正确） ，准备转染。2取 A 、B 两个 EP 管，分别加入 100l无血清无双抗 DMEM ，A

16、 管中加入 8L PEI 转染试剂， B 管中加入 4gDNA，分别孵育 5min。43将 A 、 B 混杂（ A 加入 B 中），用移液枪吹打混匀，复合物孵育15min。4取待转染的细胞，弃掉旧的培育液， 用无血清无双抗 DMEM 冲洗细胞两次 （注意冲洗时动作要轻），每孔中补加 1.8mL 无血清无双抗 DMEM 。5将 PEI-DNA 复合物逐滴滴加到细胞表面，边滴加边轻晃细胞培育板。6 4h 后改换 2mL 含有血清的培育液。7 24h 后检测细胞内绿色荧光蛋白的表达状况。六、注意事项转染实验的成败与众多要素的影响有关，包含细胞状态、血清选择、抗生素的加入、转染用质粒的启动子的选择、质

17、粒提取的质量、试剂保留等等。细胞状态：关于体细胞系建议传代细胞传到第三代左右时就进行转染，取对数生长久状态优秀的细胞。依据细胞种类和培育基种类，选择适合的稳固的培育温度、湿度和 CO2浓度，整个实验过程需要严格的无菌操作，防备细胞污染。血清选择：选择质量稳固的血清。尽量在无血清条件下进行转染，转染效率会比较高。转染后换成新鲜的培育基进行细胞培育，能够有效供给细胞的存活率。抗生素的加入：在转染培育基、细胞铺板培育基、稳固转染时的选择性培育基中防止使用抗生素，不然转染效率会遇到很大的影响。七、实验报告于转染后 24h 观察转染了表达绿色荧光蛋白质粒的细胞转染状况，对实验结果进行描绘，并进行议论。5

18、实验三细胞内参基因的RT-PCR 检测一、实验目的掌握 RT-PCR 实验技术的原理及操作二、实验原理GAPDH 是甘油醛 -3-磷酸脱氢酶（ glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）的英文缩写。该酶是糖酵解反响中的一个酶，由 4 个 30-40kDa 的亚基构成，分子量 146kDa。该酶基因为持家（ house keeping）基因，几乎在所有组织中都高水平表达，在同种细胞或许组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，故被宽泛用 于RT-PCR、Western blot 等实验操作的标准化内参。本实验以人的肿瘤细胞株为研究资料，经过逆转录-聚合酶链反响（

19、ReverseTranscription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR）的技术手段检测细胞中内参基因 GAPDH 的表达状况。 RT-PCR 的原理是：提取组织或细胞中的总 RNA ，以此中的mRNA 作为模板，采纳 Oligo（ dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成 cDNA 。再以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，而获取目的基因或检测基因表达。 RT-PCR 使 RNA检测的敏捷性提升了几个数目级，使一些极为微量RNA 样品剖析成为可能。三、实验资料传代培育的人肝癌细胞株HepG2四、实验器材PCR 仪，水浴锅，各样量程的移液枪，吸头，EP 管，试

20、剂瓶，量筒，容量瓶，试管架；冰块。五、实验试剂DEPC（焦炭酸二乙酯），氯仿，甲醇，乙醇， EDTA ，TRIzol ，琼脂糖。反转录试剂盒试剂构成： M-MLV （反转录酶） Enzyme Mix ，2Reaction Mix ， Oligo(dT) 18。PCR 反响试剂盒构成： 0.1U Taq Polymerase/ L ，500 M dNTP，20mM Tris-HCl（pH8.3），100mM KCl ，3mM MgCl 2。六、实验方法（一）实验器具的办理与准备1塑料制品：（包含枪头、 EP 管、匀浆管等）先将 DEPC 水冷静量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡此中，此中小枪头

21、需要吸管打入 DEPC 水，留宿，而后高压，再烤干备用，实验前将枪优等放入吸头台，再高压蒸汽灭菌一次（ EP 管）。2玻璃制品：泡酸留宿，冲刷洁净，锡纸包装烤干备用（DEPC 水泡）（洗净后先泡0.1%DEPC 留宿，再烤干）。（二）实验试剂的配制：1DEPC 水：吸出 1mLDEPC 放在 1000mL 双蒸水中配成 DEPC 水，放在 1000mL 容量瓶中静置 4h 备用。275%乙醇：用无水乙醇与 DEPC 水配，而后放 -20保留（此中 DEPC 水需先高压蒸汽灭菌 30min 以灭活其毒性）。3异丙醇：放入棕色瓶中。64氯仿：放入棕色瓶中。5上样缓冲液： 0.25%溴酚蓝， 30%

22、甘油， 6缓冲液， 4保留61.0%琼脂糖凝胶的配制： 1.0g 琼脂糖 100mL 电泳缓冲液，微波炉中火30 秒至沸腾，融化的琼脂物冷却至60时加入 10mg/mL 溴化乙锭 2.5 L，充足混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下搁置30-45min 后现进行电泳。（三）实验详细流程1 RNA 提取用冰预冷 PBS 冲刷培育瓶中的细胞，每孔加入 1mLTRIzol 频频吹打充足裂解细胞并采集细胞于 1.5mL 离心管中，室温静置5min；每管加入 200L 氯仿，强烈振荡15s，室温静置 2-3min；于 4， 12000r/min 离心 15min，将上层水相转移至新离心管中

23、，加入 500uL 异丙醇轻轻颠倒混匀，静置 10min；于 4，12000r/min 离心 10min，弃去上清，获取 RNA 积淀；加入 1mL 75%乙醇振摇以冲洗积淀； 12000r/min 离心 10min，弃上清得积淀物；干燥后，加适当 DEPC 水溶解积淀，取少许用于 RNA 浓度和纯度的测定（于紫外分光光度仪下分别测定样品在260nm 和 280nm 波长下的的吸光度并计算A260/A280 比值， 1.8-2.0 为 RNA 纯度较好时的 A260/A280 比值）及 RNA 凝胶电泳判定，节余 RNA 保留于 -80冰箱用于 RT-PCR的检测。注意事项：防止 RNAase

24、 污染，防备 RNA 降解或实验中的交错污染。建议在特意的地区进行 RNA 操作，使用特意的地区进行 RNA 操作，使用特意的仪器和耗材，操作人员带口罩和一次性手套并常常改换手套，实验有关耗材应用0.1%DEPC 水溶液在 37办理 12 小时，并高压灭菌30min 后使用。2反转录（本实验采纳 First-Strand cDNA Synthesis试剂盒，注：依据预实验结果，实验周使用的试剂盒可能有所改动，试剂加样量和实验步骤有稍微差异，实验原理不变）。反转录详细操作方法以下： 将各组分溶解，点甩离心，并置于冰上备用。依据以下表格配置反响系统，整体积为20L试剂加入体积RNA Templat

25、e2L （0.1ng-2g）Oligo(dT) 181L2Reaction Mix10LEnzyme Mix1LRNase-free Water6LTotal20L 涡旋震荡混匀，短暂离心，使管壁上的溶液采集到管底。反响条件为 42温浴 30min；85， 5min 结束。反响结束后，若将逆转录产物置于-20，可长久保留。3 PCR 反响7PCR 反响试剂盒为由 Taq DNA Polymerase、PCR Buffer 、 Mg2+、 dNTPs 以及 PCR 稳固剂和加强剂构成的预混系统，浓度为 2，拥有操作简迅速、敏捷度高、特异性强、稳固性好的长处，可最大限度地减少人为偏差和污染。 PC

26、R 反响系统试剂20L 反响系统模板1-2LSense Primer (10 M)1LAnti sense Primer (10 M)1L2Master Mix10LRNase-Free水补水至 20L PCR 反响条件步骤温度时间预变性953min变性9530s退火55-6230s25-35 个循环延长7230s终延长 72 5min 结果检测：试剂盒中的产品已加入染料（蓝色）；反响结束后取 5-20l反响产物直接电泳检测结果，无需再使用上样缓冲液。七、注意事项一般实验中退火温度比扩增引物的溶化温度Tm 低 5，退火时间一般为30-60s，没法获取理想的扩增效率时，适合降低退火温度；发生非特

27、异性反响时，提升退火温度，由此优化反响条件。延长时间依据所扩增的片段大小设定， 试剂盒中所含的 Taq DNA Polymerase的扩增效率为 1kb/30s。 可依据扩增产物的下游应用设定循环数。循环次数多，错配机率会增添，非特异性背景严重。所以，在保证产物得率的前提下，应尽量减少循环次数。注意防止有毒、有害试剂损害自己和别人：氯仿、溴化乙锭（EB）、紫外线等。 注意防止试剂污染。一直注意防止 RNA 酶的污染。 保留好自己专用的试剂，公用试剂保留好，互相协调，注意实验室卫生。八、实验报告绘制 PCR 电泳检测结果，并针对实验过程和影响实验结果的要素进行议论。8实验四细胞膜的浸透反响一、实

28、验目的1认识细胞膜对物质通透性的一般规律 : 细胞膜的浸透性及各种物质进入红细胞的速度。2认识溶血现象及其发活力制。二、实验原理细胞膜是细胞与环境进行物质互换的选择通透性屏障。它是一种半透膜，可选择性控制物质进出细胞。各样物质进出细胞的方式是不一样的，水是生物界最广泛的溶剂，水分子能够依据物质浓度梯度从浸透压低的一侧经过细胞膜向浸透压高的一侧扩散，这类现象就是浸透。浸透作用是细胞膜的主要功能之一。将红细胞放在低渗盐溶液中，水分子大批渗到细胞内，可使细胞胀破，血红蛋白开释到介质中，由不透明的红细胞悬液变为红色透明的血红蛋白溶液，这类现象称为溶血。将红细胞放在某些等渗盐溶液中，因为红细胞膜对某些溶

29、质拥有通透性，溶质可进入细胞内，致使膜内浸透压高升，胞外的水随之进入细胞内，发生溶血现象。所以，发生溶血现象所需时间长短可作为丈量物质进入红细胞进度的一种指标。本实验采纳红细胞作为细胞膜透性的实验资料，将其放入不一样的介质溶液中，观察红细胞的变化，判断红细胞对不一样物质的通透性怎样。三、实验资料鸡血四、实验器材50mL 小烧杯、 10mL 移液管、试管（ 15mL）、试管架。五、实验试剂抗凝剂：肝素（ 5 g/mL ）0.17M 氯化钠0.17M 氯化铵0.17M 醋酸铵0.17M 硝酸钠0.12M 草酸铵0.12M 硫酸钠0.32M 葡萄糖0.32M 甘油0.32M 乙醇0.32M 丙酮六、

30、实验方法（一）鸡红细胞悬液以肝素液润湿 5ml 注射器内壁，推出剩余的肝素液（针头内一定留下肝素液，不要进空气），取鸡的静脉血 2mL 左右。取 50mL 小烧杯一只，加一份鸡血和十份 0.17M 氯化钠溶液，形成一种不透明的红色液体，此即稀释的鸡血。（二）低渗溶液取试管一只加入 10mL 蒸馏水，而后再加入 1mL 稀释的鸡血，混匀，注意观9察溶液的颜色变化，由不透明的红色渐渐澄清，红细胞发生破碎，造成 100%红细胞溶血，使光芒比较简单透过溶液。（三）鸡红细胞的浸透性1取试管一只，加入 0.17M 氯化钠溶液 10mL，再加入 1mL 稀释的鸡血，轻轻摇动，注意能否有颜色变化？能否有溶血现象？为何？2取试管一只，加入 0.17M 氯化铵溶液 10mL ，再加入 1mL 稀释的鸡血，轻轻摇动，注意能否有颜色变化？能否有溶血现象？若发生溶血，记下时间（自加入1mL 稀释鸡血到溶液变为红色透明澄清所需时间）。3分别在以下八种等渗溶液中进行实验，步骤同2。0.17M 醋酸铵 0.17M 硝酸钠 0.12M 草酸铵 0.12M 硫酸钠 0.32M 葡萄糖 0.32M 甘油 0.32M 乙醇 0.32M 丙酮七、注意事项1肝素用量要适合，过少无抗凝作用，过多易致使溶血。2为了保证明验结果的精准性，应正确计时，并确立开始