第1篇第08章代谢平衡试验和物质代谢试验Word格式.docx

1、如自身对照试验前后配对研究，则个体差异较小。以往用化学方法测定尿、粪及食物中的无机盐或氮含量，由于实验误差来源较多，在缺乏对照的条件下，有人主张以5%10%作为实验误差基值。也就是说，摄入与排出的物质量在总摄入量的5%10%范围内时，可视为总平衡（total balance），即总体水平上的平衡状态（balance state）。当然，如有对照，可凭统计学结果作出结论。近代的平衡试验多用稳定同位素作标记示踪剂，由于误差减少，操作环节简化，总平衡的概念应从新规定。二、实验设计（一）实验计划和对照观察 一般可分为两类：用A个体的结果同B个体进行比较。同一个体在一种处理程序（包括饮食、药物、生活安排

2、等）与另一种处理程序下的结果进行比较。因为个体差异性较大，故后一种方法的结果比较可靠1。（二）实验期限 取决于研究内容。代谢平衡试验常以34天为一代谢期。代谢期太长，费时，且不利于观察对象的变化；代谢期太短，则粪便标本可能出现较大误差。如需要，留尿的间隔可以缩短，可分为24小时或48小时，亦可每8或12小时收集标本一次。进食实验膳食数天后方可收集标本，这一时期称为过渡期或适应期。其目的在于使机体在这一特定的条件下达到相对稳定状态。过渡期的长短可根据该物质在体内代谢的时间而定，一般为12天。同一受试对象在接受不同干预时，需有足够的间隔期。（三）实验膳食 根据研究目的和受试对象的饮食习惯，由营养师

3、配制实验膳食。营养师首先要调查受试者自由饮食时的情况，然后制定食谱。要确保能量供应，并注意食物中其它相关物质的含量。试验前应试进食一天，以及时调整食谱，确保试验期间受试者能完全摄入所规定的食物。如有剩余，应及时送至实验室检查，并从总摄入中减去。由于自来水和天然水中所含矿物质浓度较高，所以烹饪和饮用的水都需用蒸馏水。（四）标记物的使用 为了保证粪便标本收集的准确性和完整性，常使用肠道不吸收物质作为标记物。卡红（carmine red）口服后大便呈红色，可在试验开始和结束时服用，作为划分实验期限的标志物。活性碳使大便呈黑色，亦可使用。此外，还可在每餐进食时加用另一种不吸收的标记物，用于校正粪便中该

4、物质的含量。常用的有聚乙烯二醇（polyethylenglycol, PEG）、Cr2O3 、CrCl3和51Cr。（五）实验期间的活动 可进行适当的轻度体力活动。保证体重无明显变化。但要注意避免显性出汗。大汗可增加水、电解质和某些物质的丢失。（六）粪便和食物标本灰化或消化2 可视测定内容的需要采用不同方法1干灰化法 通过高温灼热使样本脱水、焦化。在空气中氧的作用下，使有机物氧化分解成二氧化碳、水和其他气体挥发，残留的无机物供测定用。该方法适用范围广，可用于很多微量元素的分析。操作简便，需要设备少，灰化过程中不需要人看守，并适合于大批量样品的处理，省时省事。缺点是由于敞口灰化，温度高，容易造成

5、待测成分的挥发损失；其次是某些待测成分吸留于坩埚的孔穴中很难溶出，致使回收率降低。2湿消化法 在样品中加入硝酸、高氯酸、硫酸等强酸，加热破坏有机物。硝酸是强氧化剂，但由于沸点较低，在高温条件下易扩散，氧化能力不持久。因此当消化过程需要补加时，应先冷却。其优点是对金属具有较强的溶解能力，除了金和铂以外，几乎能溶解所有的金属。高氯酸在低温时没有氧化能力，但加热时是一种强氧化剂，其氧化能力强于硝酸和硫酸，可分解所有的有机物，消化速度也快。但需注意，在高温下，高氯酸直接接触某些还原能力强的物质（如酒精、甘油、糖类、次磷酸及其盐）时，因反应剧烈有发生爆炸的可能，故一般不单独使用，并且要避免消化液烧干，以

6、免发生危险。浓硫酸在加热条件下具有一定的氧化能力，但不如高氯酸和硝酸，它只能使样品中的蛋白质氧化脱氨，而不会进一步氧化成氮氧化物。浓硫酸对有机物有强烈的脱水作用，并使其炭化。此外，硫酸具有沸点高（338），不易挥发损失等优点。有时还需加入一些氧化剂（如高锰酸钾、过氧化氢等），以加速样品的氧化分解，完全破坏样品中的有机物，使待测的无机成分释放出来，并形成各种不挥发的无机化合物，以便作进一步的分析测定。常用的消化方法：硫酸消化法 如用凯氏定氮法测定食品中蛋白质含量，可用此法来进行消化。由于硫酸的氧化能力较弱，消化液炭化变黑后，保持较长的炭化阶段，使消化时间延长。可适当加入某些氧化剂。硝酸-高氯酸消

7、化法 可先加硝酸进行消化，待大量有机物分解后，再加入高氯酸。此法反应速度快，炭化过程不明显；消化温度低，挥发损失少。但由于两种酸经过加热都容易挥发，故当温度过高、时间过长时容易烧干，并可能引起残余物燃烧或爆炸。硝酸-硫酸消化法 在样品中加入硝酸和硫酸的混合液，或先加入硫酸。加热使有机物分解，在消化过程中不断补加硝酸。此法可缩短炭化过程和消化时间，反应速度适中。但因含有硫酸，不宜作碱土金属的分析。三、实验步骤（一）试验膳食 调查受试者的饮食习惯，根据研究目的制定食谱。试进食实验膳食一天，调整食谱。进食实验膳食12天（过渡期）。每餐同时服用PEG 1克。在实验期第一天及实验结束后第一天的早餐前服用

8、卡红0.3克（装于胶囊内），或服活性炭0.5克。实验期每餐亦同时服用PEG 1克。（二）尿标本的收集 实验期第一日上午7时令受试者排空膀胱，将尿液弃去，然后收集每日24小时尿液。用浓盐酸防腐（每100毫升尿液加0.5毫升浓盐酸）。容器上需注明受试者姓名、实验日期等，以防混淆。测定每日尿液总量。留取部分尿液，置-20保存待测。（三）粪标本的收集和处理 从第一次服用卡红后大便变为红色起，至第二次服用卡红后大便出现红色前，收集所有的大便。每日可用浓盐酸或20%硫酸20毫升防腐。测脂肪一般用冰醋酸20毫升防腐。粪便标本需储放阴凉处。将全部粪便标本移入捣碎机中，加适量蒸馏水，将大便捣成糊状。如标本较多，

9、可分成数次进行，然后混匀所有标本。将糊状粪便标本倒入一带塞且有刻度的大号容器内，视标本量的多少稀释到10003000毫升，用力摇匀。记录大便总量，留取部分样品。（四）粪标本灰化或消化 主要有两种方法：干灰化法，首先将大便溶液5毫升冷冻干燥（-18 72小时），然后放入瓷坩埚内或白金杯内，置于高温炉中（600 48小时），用浓盐酸10毫升溶解剩余物，将溶液滤入100毫升带塞量瓶中，浓盐酸冲洗滤纸5次。用蒸馏水稀释至100毫升后待测。湿消化法，取大便溶液5毫升注入凯氏烧瓶，加入适量的消化液，将瓶倾斜呈45，用电炉加热瓶的底部，直至消化完全为止。由于有大量消化酸雾和消化分解产物逸出，故需在通风橱内进

10、行。也可将样品和消化液放入硬质锥形瓶中，瓶口放一小漏斗，置于电热板上进行加热消化。在消化过程中需要补加酸或氧化剂时，首先要停止加热,待消化液稍冷后沿瓶内壁缓缓加入，以免发生剧烈反应，引起喷溅，造成对操作者的危害和样品的损失。消化完全的样本应为无色液体，冷却后移入100毫升容量瓶内，稀释至100毫升待测。（五）食品取样和处理 膳食成分的测定，有两种方法：一种方法是按照食物成分表计算，另一种方法是直接分析食物的样品。按照食物成分表计算的结果，只能供营养师配制膳食时参考之用。不同时间和不同来源的食物成分，可能有相当大的差异。计算的结果与实际分析的结果往往有较大的差别，所以不能作为分析研究资料的数据。

11、准确的代谢研究必须采用直接分析法。食物的样品可于配制实验膳食时另外配制完全相同的一份作为分析用。但全份食物浪费较大，一般可用全份食物的1/3或1/5。标本处理方法同前。四、结果分析标本分析后须审查换算步骤，如稀释倍数等。尿、粪排除量可用肌酐和标记物校正。常用的参数：平衡值=每日或总摄入量每日或总粪排除量+每日或总尿排除量；肠净吸收率=每日或总摄入量每日或总粪排除量/ 每日或总摄入量100% 在解释结果时，要考虑实验本身可能发生的误差。个体试验的正或负平衡值小于摄入总量的10%时，有可能是机体调节或试验误差所致，不一定具有重要的实际意义。该方法是一种传统的了解物质代谢平衡的方法，曾被广泛应用于各

12、种生理条件下各物质需求量和病理条件下某一物质代谢的研究36。但它仅能反映整体的正负平衡变化，不能显示体内的代谢途径和详细变化，也无法计算内生性物质。此外，从皮肤、汗液、头发等部位丢失的部分无法计算，存在一定的局限。【同位素示踪代谢试验】一、放射性核素示踪法放射性核素示踪是利用放射性核素或其标记物作为示踪剂，采用口服或静脉注射的方法引入体内，从体外或取标本观察示踪物的去向，以了解机体在生理、病理过程中物质的吸收、分布、代谢和排泄。放射性核素或其标记物的化学性质及生物性质与相应的非标记物的性质完全相同，即它们在生物体内所发生的化学变化、免疫学反应和生物学过程都是完全相同的，但却有不同的物理性质，既

13、放射性核素可发射出射线，通过核测量仪器可对射线进行测量和定量，观察被放射性核素所标记物质。用放射性核素研究物质代谢的示踪实验，除前面平衡实验设计中需要考虑的问题外，还包括以下几个方面。（一）放射性示踪物的选择 主要根据实验目的、实验周期和测量方式考虑7。1核素的半衰期 所用半衰期过长或过短的核素都不合适。半衰期过短的核素，实验尚未结束，其放射性已衰变过多，导致测量困难；使用半衰期太长的核素，则放射性物质在机体内残留时间太长，对机体不利。实际工作中除考虑核素的物理半衰期外，还要考虑该示踪物在体内的生物半衰期。有些示踪物虽然物理半衰期很长，但在体内停留时间不长（生物半衰期短），同样可安全使用。如1

14、4C的物理半衰期为5千多年，有利于运输和保存，但它的生物半衰期只有10多天。因此，应根据实验周期，同时注意考虑示踪物的物理半衰期和生物半衰期，即该示踪物的有效半衰期。2放射性核素射线的类型 一般粒子很少用于生物示踪实验。射线穿透力强，发射此类射线的示踪物样品制备和测量都比较简便，在体外观察示踪物于体内运动规律，则必须使用发射射线的核素标记物。发射射线的核素如3H、14C、32P等大多数可以进行同位素标记（既以放射性原子替代原来非放射性的相同原子），各种代谢转换的研究多选用发射射线的核素。3足够的放射化学纯度和比活度 对放射化学纯度的要求是不应有放射性杂质（包括其他放射性核素及同一核素标记的其他

15、化合物或游离的放射性核素），其放射化学纯度应在95%以上，放射化学纯度的降低势必干扰示踪实验的测量结果。由于放射性示踪剂在体内应用过程中都会被大量稀释，并且要求最后制成的样品必须仍能达到测量要求，则起始应用的示踪物放射性比活度必须较高。如果比活度太低，为了满足测量要求就需要增加化学量，导致化学量过高而引起示踪实验结果失去生理真实性。另一方面，比活度过高，可能引起被标记的化合物分子受到辐射损伤，亦影响示踪结果。（二）确定合适的示踪用量 实验中示踪用量的确定包括示踪物的化学用量和核素的放射性活度。化学量应为示踪量，即尽可能低或者根据实验目的的要求用一定的化学量。放射性活度的确定原则是：使用的放射性

16、测量手段可以较灵敏地测出最后样品的放射性，在达到测量结果准确的条件下，确定最小的放射性活度。具体应用时要考虑不同给予途径时的标记物利用率，其在系统内的稀释程度及分布和廓清特点、实验周期长短、观察方法、测量方法及测量效率等，待测样品所含的放射性活度，为达到测量结果的准确性，最后样品要求测得的最低计数率，用反推法估算需引入的放射性活度：根据被测样品的最低计数率要求，并校正在实验过程中各种影响因素所造成的放射性活度的损失量，计算初始应用的示踪剂量。例如：静脉注射示踪物，被观察的整个组织可摄取该示踪物的量约占引入总量的1%，拟观察10天，在此期间示踪物从该组织中消失约为初始摄入量的90%，拟取待测样品

17、约为该组织总量的10%，测量最低计数率要求为250cpm，测量仪器的计数效率为50%，于是最少放射性dpm=25050%=500dpm；取样时该组织的总dpm：50010%=5000dpm；初始时该组织的总dpm：5000（1-90%）=5106dpm；初始应引入的示踪量：510660=83.3kBq。如果采用口服的方式还要考虑示踪物的吸收率（由摄入量、吸收效率和示踪剂通过胃肠的速度等因素决定）。（三）放射卫生防护和废物处理 放射卫生防护包括实验工作人员及实验对象的防护。辐射损伤需一定的剂量，只有在超过最大允许剂量的照射后才对机体有损害。同时应采取必要的防护措施，注意防止不必要的辐射。动物实验

18、时，除考虑个体动物引入的示踪量，还必须考虑到放射性核素示踪实验与一般理化实验不同，动物接受了放射性核素，既便对个体动物是安全剂量，但动物同时成为辐射源，动物间可相互照射，动物还要排除放射性物质可污染、照射周围环境。因此，对动物群体饲养和排泄物的处理应采取适当的措施。对操作器具、放射性组织标本、动物尸体及其他放射性废物的处理，应根据具体情况和条件，按照放射卫生防护和废物处理的有关规定进行操作处理。（四）实验方法和步骤 有单标和双标二种方法。同位素经口服或（和）静脉注射，然后留取血、尿或粪标本，测定标本中的同位素量，通过计算了解物质的代谢状况。常用的放射性同位素有15O、13N、14C、45Ca、

19、47Ca、28Mg、65Zn、59Fe、55Fe。现列举测定钙吸收的几种方法。45Ca释放射线（半衰期165天），47Ca可释放和射线（半衰期4.7天）。1单标法 受试者隔夜空腹，口服一种放射性同位素5Ci45Ca（20mg 45CaCl溶于250ml蒸馏水），1小时后抽血，离心，采用液闪仪测定血浆中的同位素活性（Fx/L），乘以体重的15%，求得1小时在血浆和细胞外液中的理想量（FC），或用ordin提出的公式：FC=Fx/10L15.4（1/体重0.0154），然后套入经验公式：每小时吸收率=1.17FC+2.54FC28。 该法简便、快速，价格低廉。Nordin 等应用该技术在甲旁亢和肾

20、结石的病人中发现钙吸收增加，骨软化和肾衰病人钙吸收下降，正常人和骨质疏松症患者钙吸收与血中降钙素水平相关。髋部骨折的妇女钙吸收低下。用1-羟化维生素D3治疗骨质疏松后钙吸收增加。Krall等9采用计算2小时血中45Ca的量/口服总45Ca的量测定钙吸收率，发现吸烟可致肠钙吸收减少。2双标法 较单标法更精确和可得到更多的资料。受试者隔夜空腹，在早餐结束时服用一种同位素，之后静脉注射另一种同位素，35分钟内注完。在6、12、30、45、60、120、240、480分钟抽血，留6、12或24小时尿。通过测量血或尿中的二种同位素比确定吸收率。用47Ca和45Ca需要花费的时间较长，约68周。这是由于4

21、7Ca和其产物47Sc可干扰45Ca活性的测量，因此，必须待47Ca和47Sc自动减少后，才可确定45Ca活性。为缩短时间，De Grazia等提出同时在标准和样本中沉淀Ca，保持Sc的比例相同，这样可只测/率，得出钙吸收率。有学者则用85Sr替代45Ca作为静注示踪物，而用47Ca口服，因为Sr的血液动力学在310小时与Ca相同。Griessen等提出先在Sc通道测量47Ca的活性，比上用Ca通道所测活性。计算47Sc和47Ca的比率，得出纯47Ca量，然后求得47Ca与45Ca之比10。3核素稀释法 核素稀释法是根据化学物质在被稀释前后其质量不变的原理建立起来的。如:已知放射性活度为S1，

22、质量为M1的标记物和未知质量Mx的同一种化学形式的非标记物充分混匀后，标记物被非标记物所稀释，测混合物的放射性比活度S2必然比S1低，但是稀释前后的放射性总活度相等，即：S1M1=S2（M1+M2）。因为混匀后放射性比活度S2保持恒定，不随取量的多少而变化，测定时只要取出部分样品做分离定量，测定其比活度，代入公式中求得待测物质的质量。该方法可以从总的粪便排泄中区分出来自内源性的排泄，计算出物质的真实吸收量（率），已应用于动物中钙、锌、锰、铁、钴等元素的生物利用度的研究。该技术测定钙的生物利用度的方法11是：首先动物进行饲喂方式和时间的适应。肌注适量的45Ca，注射液用生理盐水稀释45CaCl2

23、配制而成。用于标记机体内源性钙库，此后出现在粪便中的放射性钙均为内源性钙。待机体达到平衡后，选择适当的参比组织，如血液，测定比活性（45Ca活性/组织中的钙量）。同时测定粪中45Ca的活性。粪便、饲料、血浆、尿液经干灰化法处理后，可用原子吸收光谱法测钙含量。计算内源性粪钙：内源性粪钙（mg/d）=粪中45Ca的活性（Bq/d）/参比组织的比活性。计算钙的真实吸收量（率）：真正吸收率（%）=总钙摄入量- （总粪钙排泄量-内源性粪钙）100%/总钙摄入量放射性核素示踪法灵敏度高，通常可精确测出10-1410-18g的放射性物质，因而对研究微量生物活性物质具有特别价值；放射性核素及其标记物的用量很少

24、，引入后几乎不会改变体内的正常生理平衡，实验结果接近正常生理状态；测量方法简便，不受其他非放射性物质的干扰及其他物理和化学因素的影响，不必对样品进行复杂的分离和提纯。但应用范围受限；实验过程中可能存在放射生物效应，影响实验结果的准确性；实验操作时，对环境有放射性污染。因此，此法正逐步为稳定核素所替代。二、稳定核素示踪法稳定核素示踪技术在本世纪二十年代已被应用于生命科学的研究，近十余年来，随着稳定核素生产技术的发展以及探测技术的改进，使稳定核素示踪技术被广泛应用。由于它不具有放射性，没有放射生物效应，因此对于临床应用方便，适用于儿童、妊娠及哺乳的妇女；标记的化合物不会衰变，不会辐射和自动裂解，不

25、需要采取防护措施，实验不受时间限制。（一）原理 稳定核素是同一元素的同位素，具有相同的化学性质，它们在有机体内所发生的化学变化和生物学过程完全相同，但与同一种天然元素具有不同的质量，故具有可测量性。稳定核素标记的示踪剂可以应用气相-质谱联用法（GC-MS）、高效液相色谱-质谱联用法（HPLC-MS）、热离子质谱仪（thermal ionization mass spectrometry）、电感偶合质谱仪（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）、高速原子轰击-继发离子质谱仪（fast atom bombardment-second

26、ary ion mass spectrometry，FAB-SIMS）、核磁共振光谱法（nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMRS）、红外分光光度法（infrared spectrophotometry）、发射光谱分析法（emission spectrometric analysis）等测定方法，计算稳定同位素丰度，对标记物质进行定性、定量及定位研究。（二）实验方法和步骤 近十年来多采用稳定同位素标记进行代谢研究。方法和步骤与放射性同位素相似。通过给予一种（口服）或两种（口服和静注）稳定同位素标记的物质，测量该物质所携带的同位素量，了解该物质的排泄

27、和体内存留量。这一方法提高了试验的精确性，可了解体内代谢过程。常用的稳定同位素有：13C、18O、15N、42Ca 、44Ca、46Ca、48Ca、25Mg、26Mg、67Zn、70Zn、58Fe、57Fe。13C呼气试验和15N尿试验是两种常用的方法7，12，既可用于糖、脂肪酸、蛋白质和氨基酸等物质的代谢研究，又可用于临床多种代谢疾病的诊断。缺点是所需的试验条件较高。目前某些物质（如锰）还不能找到相应的稳定同位素。113CO2呼气试验 13C标记的化合物在体内被氧化为13CO2，通过测定一定时间内呼气中13CO2/CO2比值的变化，了解某一化合物在体内的代谢过程。它具有方便、无创伤等优点，但

28、由于呼气中的13CO2被体内大量的CO2所稀释，丰度不高，需要灵敏的检测仪器。步骤如下：受试者应禁食12小时，避免对本底13C的影响。试验日先收集一次呼气样品，然后摄入13C-标记物。摄入量应根据标记物的同位素丰度、标记物在体内吸收和氧化的速率、分析仪的精度制定。摄入13C-标记物后，每间隔1030分钟收集一次呼气样品。纯化呼气样品。测定结果。临床应用：13C-葡萄糖诊断糖代谢疾病 可用于诊断儿童糖尿病及药物治疗观察。1-13C-亮氨酸、1-13C-苯丙氨酸、13C2-甘氨酸研究氨基酸和蛋白质的体内氧化代谢。13C-乳糖和13C-蔗糖可诊断双糖吸收不良。13C-碳酸氢钠用于研究肝脏血浆蛋白的合

29、成13C-醋酸盐和13C-乙醇了解醛脱氢酶缺乏症。215N尿试验 含氮物质在体内的代谢产物主要通过尿排泄,检测尿液中的15N含量,可了解某一物质的代谢过程。这一方法较13C呼气试验精确。试验步骤如下：受试者在实验前需禁食一夜，实验前将尿排空，并留尿样作本底。予以15N-标记物，收集一定时间的尿液，20保存。根据研究的内容对尿液进行处理。测量尿液中的15N丰度，计算结果。【糖代谢的动力学研究】一般采用稳态单库模型。在空腹时，通过恒速注入稳定同位素标记的葡萄糖，使血浆中的葡萄糖的同位素丰度出现平台。这时输入葡萄糖的速率等于体内内生葡萄糖的生成率。由于葡萄糖分解后，一部分丙酮酸又可转变为葡萄糖。因此，示踪剂的再循环成为影响计算葡萄糖转换率的因素。采用不同的稳定同位素或同一同位素不同标记位置，则得到的葡萄糖生成率不同13、14。二、实验方法和步骤常用6，6-2H-葡萄糖、1-13C和U-13C-葡萄糖。其方法是：示踪剂溶入无菌等渗盐水中，用Millipore膜滤过灭菌。受试者禁食过夜，试验当日在空腹状态下。从一侧肘前静脉插入导管，用于采集血样。注入示踪剂前留取血样，作为本底。在另一侧前臂静脉注入示踪剂。首先予以初始剂量，为持续注入速率的5090倍，随后予以持续恒速静滴，输注率：6，6-2H-葡萄糖25gkg-1min-1、1-13C葡萄糖6min-1，U