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1、最新的论文课件资料 水溶性咔唑衍生物与DNA结合作用的研究 学生姓名：赵曼丽 指导老师：李俊芬内容提要： 采用本实验室合成的咔唑衍生物，通过荧光和紫外可见光谱法并结合I效应、离子强度的影响、DNA变性等实验手段，研究了水溶性咔唑衍生物与小牛胸腺DNA的相互作用。结果表明，DNA对咔唑衍生物的荧光有明显的猝灭作用，猝灭过程为动态猝灭。由荧光猝灭实验数据，计算出咔唑衍生物与DNA之间作用的结合常数和热力学参数，推测两者结合的主要驱动力是熵驱动过程。KI猝灭实验发现，DNA对咔唑衍生物有明显的保护作用。NaCl浓度的增加，DNA咔唑衍生物体系荧光强度无明显变化；DNA变性实验发现，dsDNA与咔唑衍

2、生物结合能力大于ssDNA；推测咔唑衍生物可能以嵌插方式和沟漕作用相结合的混合模式和DNA作用。关键词: 咔唑衍生物；小牛胸腺DNA ；荧光光谱；紫外光谱；结合模式.前言：DNA分子基本单位是脱氧核糖核苷酸，DNA是基因表达的物质基础，更是许多药物的靶分子，研究药物小分子与DNA的相互作用，有助于认识药物与DNA的结合机理，同时也为以DNA为靶标的药物分子设计提供有价值的信息并阐述一些抗肿瘤、抗病毒药物及致癌物的作用机理, 帮助人们了解某些疾病的发病机理, 这对于寻找副作用小、疗效好的抗癌药物母体和进行体外筛选抗癌药物, 以及研究抗癌药物在生物体内治疗疾病的本质具有重要意义。DNA与许多化合物

3、相互作用主要包括三种方式：静电作用、沟槽键合和嵌插作用，其中嵌插作用是结合最为紧密和最为有效的一种作用方式。咔唑衍生物具有生物活性和强的荧光发射。本文采用荧光和紫外-可见光谱法，研究了DNA和咔唑衍生物的相互作用，运用I离子猝灭效应、DNA热变性和离子强度影响等实验手段，考察了咔唑衍生物与DNA之间的作用模式，该研究为了解咔唑衍生物与DNA的作用机理提供一定的理论基础。1 实验部分 1.1 主要仪器和试剂 Cary Eclipse型荧光分光光度计（美国WARIAN公司）；TU-1901型双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。 咔唑衍生物（本实验室合成,为紫色针状的晶体，结构

4、如图1所示），分子式为C12H52N4Na2012（M=1090），用二次水配置成110-3mol/L储备溶液；ctDNA(Sigma公司），贮备溶液用0.1mol/L的NaCL溶液配制，于0-40C保存，经UV光谱检验测定A260/A2801.8，表明基本上不含蛋白质，纯度符合要求。DNA的准确浓度以核酸的摩尔磷吸收系数（P)表示，测量DNA在260nm处的吸收光度，然后根据DNA=6600M-1cm-1来确定，经确定DNA浓度为5.210-3mol/L；0.1mol/L1 的KI溶液；0.1 mol/L1 的NaCl溶液；0.05 molL1的TrisHCl(pH 7.4)缓冲溶液；试剂均

5、为分析纯，实验用水为石英亚沸高纯水蒸馏器（江苏勤华玻璃仪器厂）二次蒸馏水。 图1 咔唑衍生物的结构式1.2 实验方法1.2.1 邻甲酚酞络合剂和咔唑衍生物的荧光光谱测定 配相同浓度110-3mol/L的邻甲酚酞络合剂和咔唑衍生物溶液，分别准确量取3mL于1cm石英杯中，扫描其荧光光谱，荧光激发狭缝设为5nm，发射狭缝设为10nm.1.2.2 吸收光谱滴定 在1cm比色皿中加入2.0mlPH7.4的TrisHCl缓冲溶液，分别测定咔唑衍生物为110-5mol/L、110-4mol/L、510-4mol/L、110-3mol/L的紫外可见吸收光谱，并以TrisHCl作为空白校正。确定110-3mo

6、l/L的咔唑衍生物溶液为与ctDNA作用的浓度。准确加入3mL的110-3mol/L的咔唑衍生物溶液，然后用微量进样器依次加入10L/次的ctDNA储备溶液，考察吸收光谱的变化。另以相应浓度的DNA溶液作为参比。1.2.3 荧光光谱滴定 准确量取3mL浓度为510-3mol/L的咔唑衍生物于1cm石英杯中，扫描其荧光光谱，其荧光激发狭缝设为5nm，发射狭缝设为10nm，然后用微量进样器依次加入5L/次的ctDNA储备溶液，在荧光分光光度计中扫描荧光光谱，直至饱和。1.2.4 KI猝灭效应 准确量取3mL浓度为510-3mol/L的咔唑衍生物于1cm石英杯中，扫描其荧光光谱，其荧光激发狭缝设为1

7、0nm，发射狭缝设为10nm.然后用微量进样器依次加入5L/次的阴离子猝灭剂KI储备溶液，在荧光分光光度计中扫描荧光光谱。在咔唑衍生物-ctDNA的混合液（3mL浓度为510-3mol/L的咔唑衍生物和0.5mL的ctDNA）中加入不同体积的阴离子猝灭剂KI，依KI与咔唑衍生物相互作用中的方法测定荧光强度。小分子的荧光猝灭程度可以通过Stern-Volmer淬灭常数KSV的大小来衡量： FO/F=1+KSVQ FO和F分别指没有猝灭剂和有猝灭剂存在的情况下有机分子的荧光发射强度，Q为猝灭剂的浓度。1.2.5 离子强度的影响 准确量取3mL浓度为510-3mol/L的咔唑衍生物于1cm石英杯中，

8、扫描其荧光光谱，其荧光激发狭缝设为10nm，发射狭缝设为10nm.然后用微量进样器依次加入5L/次的NaCL储备溶液，在荧光分光光度计中扫描荧光光谱。在咔唑衍生物-ctDNA的混合液（3mL浓度为510-3mol/L的咔唑衍生物和0.5mL的ctDNA）中加入不同体积的Nacl，依NaCL与咔唑衍生物相互作用中的方法测定荧光强度。小分子的荧光猝灭程度可以通过Stern-Volmer淬灭常数KSV的大小来衡量。1.2.6 DNA变性实验 将ctDNA溶液在1000C下用水浴加热15分钟，然后迅速置于冰水中冷却5min，可令双螺旋的ctDNA分子发生变性，双链分裂成两条单链。准确量取两份3mL浓度

9、为510-3mol/L的咔唑衍生物与1cm石英杯中，扫描其荧光光谱，其荧光激发狭缝设为5nm，发射狭缝设为5nm.然后用微量进样器分别加入10L/次的双螺旋ctDNA和单链ctDNA，进行荧光滴定实验，并记录荧光强度。1.2.7 温度对荧光光谱的影响 配置510-3mol/L的咔唑衍生物溶液，加入3mL的PH=7的三酸缓冲溶液，并加入5mL的咔唑衍生物原液定容至10mL。将3mL的溶液加入荧光杯中，每次加入10L的ctDNA，分别在20、30、45下进行荧光滴定，测定其荧光强度。2 结果与讨论2.1 邻甲酚酞络合剂和咔唑衍生物的荧光光谱荧光光谱测定 图2为邻甲酚酞络合剂和咔唑衍生物的荧光光谱。

10、 图2 邻甲酚酞络合剂和咔唑衍生物的荧光光谱 Fig.2-1 Fluorescence spectrum of carbazole derivative and o-Cresolphthalein Complexone 由图可见，咔唑衍生物有荧光发射，而反应物邻甲酚酞络合剂没有荧光发射，3-甲酰基咔唑又不溶于水，这个现象说明本实验室成功合成了理想中的咔唑衍生物，其具有良好的水溶性和较强的荧光发射。 2.2 吸收光谱滴定 紫外-可见吸收光谱是研究小分子与ctDNA相互作用机理的最常用、最方便的方法之一。当小分子与DNA结合后，DNA会扰动小分子的电子结构使之所处的环境发生变化，DNA和小分子的结

11、合强弱可通过光谱变化的幅度反映出来。一般来讲，当DNA和小分子以嵌入模式作用时，其吸收光谱会出现减色效应和峰红移现象。这是由于DNA的碱基对与插入的小分子发生电子堆积后，其*空轨道与碱基的电子轨道发生了偶合，能级下降，产生红移现象。同时，偶合后的轨道因部分接受电子，跃迁几率减小，便产生了减色效应。 咔唑衍生物在紫外区有一定的电子吸收。吸收光谱证明了咔唑衍生物与ctDNA的键合。图3是咔唑衍生物与不同浓度的ctDNA相互作用的吸收光谱。 图3 咔唑衍生物的吸收光谱滴定曲线 【ctDNA】（1-7）=0，1.6,3.3,5.0,6.7,8.3,1010-5mol/L Fig.3 Absorptio

12、n titration of carbazole derivative 由图可见，与ctDNA的结合导致咔唑衍生物的吸收光谱出现了变化，吸收峰出现了微弱的红移现象。另外，随着ctDNA浓度的增加，咔唑衍生物各吸收带的吸光度逐渐下降，出现了“减色效应”。说明在基态下，咔唑衍生物与ctDNA发生了结合作用，形成了复合物。从吸收光谱的特征上看，咔唑衍生物可能是以嵌入模式与DNA作用的。 2.3 荧光光谱滴定 荧光光谱也是研究小分子与ctDNA相互作用机理的最常用、最方便的方法之一。对与自身荧光较高的化合物来说，与ctDNA作用后其荧光会猝灭。在水溶液中以264nm激发，咔唑衍生物的荧光强度较强。以荧

13、光滴定法考察咔唑衍生物与ctDNA作用后荧光光谱的变化。图4为不同浓度ctDNA存在下咔唑衍生物的荧光光谱。 如图可见，低浓度的ctDNA即可使咔唑衍生物的荧光强度显著减小。随着ctDNA浓度的增大，咔唑衍生物的荧光强度逐渐增大，说明ctDNA与咔唑衍生物发生了相互作用。 图4 加入不同浓度ctDNA时咔唑衍生物的荧光光谱 【DNA】（1-11）=0，1.6,3.3,5.0,6.7,8.3,1010-5mol/L Fig.4 Fluorescence spectrum of carbazole derivative with increasing concentration of DNA 2.

14、4 KI猝灭效应 阴离子猝灭实验被广泛应用于小分子和DNA作用模式的推断。当DNA与有机小分子发生结合反应后，通过阴离子猝灭剂对有机小分子荧光的猝灭常数KSV可推断有机小分子与DNA的作用方式。如果有机小分子嵌入到DNA的碱基对中，DNA的磷酸骨架带有负电荷，对阴离子猝灭剂有强烈的排斥作用，有机小分子受到有效的保护从而使其受到猝灭的程度减小；在有机小分子与DNA发生沟槽键合时，有机小分子作用于DNA的大沟或小沟上，暴露在溶液分子中，更容易受到阴离子猝灭剂的进攻。因此对于嵌入式结合的小分子，在DNA的存在下，阴离子猝灭剂对有机小分子的猝灭程度比没有DNA存在下要小，而对于沟槽结合，在DNA存在下

15、，阴离子猝灭剂对有机小分子猝灭程度比不加DNA时要大。 本文以KI为猝灭剂，考察了体系中有无DNA存在时，咔唑衍生物的发光被猝灭的情况，结果如图5所示。 图5 KI对咔唑衍生物的荧光猝灭曲线 Fig. 5 Fluorescence quenching plots of carbazole derivative and carbazole derivative-DNA 如图所示， KI对咔唑衍生物荧光强度的影响比对咔唑衍生物-DNA体系的荧光强度的影响大，可见加入DNA后阴离子对咔唑衍生物发光的猝灭程度比不加DNA小。说明加入了DNA保护了咔唑衍生物，两者的作用方式主要是嵌插作用。2.5 离子强

16、度的影响 NaCL对体系的影响主要来自于离子强度。本文通过加入NaCL溶液来考察体系中有无ctDNA的存在下，不同浓度的NaCL对体系荧光强度的影响。实验结果如图6。 图6 盐效应对咔唑衍生物与ctDNA作用的影响 Fig.6 The effect of NaCL on the fluorescence intensity ratio(I/IO) of carbazole derivative NaCl溶液中的Na+能够中和DNA磷酸骨架上的负电荷，使DNA磷酸骨架间的静电斥力降低，从而使得DNA链紧缩。若体系中咔唑衍生物与DNA之间存在有静电作用，随着Na+浓度的不断增大，必然会与咔唑衍生物

17、产生竞争，而减弱咔唑衍生物与DNA之间的作用，使荧光猝灭程度减弱12。然而如图所示，NaCL的存在对咔唑衍生物DNA体系的荧光强度变化几乎没有影响，说明咔唑衍生物不与DNA双链上的磷酸根产生静电作用，它们相互作用不是静电作用。2.6 DNA变性实验 双螺旋的ctDNA（dsDNA）变性后双链发生分裂，成为两条单链（ssDNA)。如果和ssDNA结合后，咔唑衍生物的荧光强度降低幅度减小，则说明咔唑衍生物是通过嵌插作用进入到ctDNA分子的碱基对里面的。咔唑衍生物分别于相同浓度的未变性和变性的ctDNA分子结合后的荧光强度比较结果见图7。表1 咔唑衍生物与相同浓度的未变性和变性的ctDNA分子结合

18、后的荧光强度比较 ctDNA浓度（10-3mol/L) 相对荧光强度（F0-F) dsDNA ssDNA 0.3 34.5 40.3 0.7 54.162.8 1.0 66.183.1 1.3 93.1100.8 1.6 110132.7 2.0 119.4141 2.3 138.7155.9 2.6 141.3168.3 2.9 158184.4 3.2 171.5189.2 图7 咔唑衍生物同未变性和变性ctDNA分子结合的相对荧光强度 Fig7 The relative fluorescence intensity of carbazole derivative in dsDNA and

19、 ssDNA 如图所示，咔唑衍生物与ssDNA分子结合后的荧光增强趋势未减小反而增大，说明ssDNA更有利于两者的相互作用，可能是ssDNA充分暴露的碱基使之与小分子的结合能力大于dsDNA。因此两者之间的作用是沟槽作用。2.7 荧光猝灭机理 荧光猝灭机理有很多种，常见的有由于猝灭剂如KI与荧光物质之间的碰撞引起的动态猝灭以及形成基态复合物而引起的静态猝灭等。为了进一步研究咔唑衍生物的猝灭机理，考察了温度对两者相互作用的影响。实验结果表明，随着DNA的加入，咔唑衍生物的荧光强度依次降低，说明DNA与咔唑衍生物发生了作用。根据SternVolmer方程：F0 /F =1+ KsvDNA= Kq0

20、 DNA，由实验数据作出F0/FDNA关系图8，并求出不同温度下ctDNA对咔唑衍生物的荧光猝灭的动态猝灭常数Ksv，见表2。 如表所示，随着温度的升高，Ksv增大，推测此荧光猝灭机理为动态猝灭。 图8 不同温度下的Stern-volmer曲线 Fig.8 Carbazole derivative under different temperatures表2不同温度下咔唑衍生物与DNA作用的猝灭常数KsvTable 2 SternVolmer quenching constants for the interaction of carbazole derivative with DNA at

21、different temperatures T (K) KSV (L. mol1) R2 293 1.25103 0.9767 303 1.79103 0.9946 318 1.83103 0.94612.8 结合常数和结合位点 DNA对咔唑衍生物的荧光猝灭结合常数可由LineweaverBurk双倒数方程：lg(F0F) /F=lgK+nlgQ, 求得不同温度下的结合常数K，如图9。 图9 咔唑衍生物与DNA分子的结合常数曲线 Fig.9 Binding constant carbazole derivative of morphine with DNA 通过斜率和外推截距可求出咔唑衍生物

22、与DNA之间的结合常数和结合位点。结合常数为8.28103mol/L，结合位点数均为1.109，线性相关系为0.9877.结合常数表明咔唑衍生物与ctDNA之间的亲和力较强。结合位点数说明大约每一个碱基对之间有一个位点。 根据热力学参数之间的关系式lgK=H/2.303RT + S/2.303R，G = H TS ，可分别求得焓变(H)、熵变(S)和生成自由能变(G)并列于表3 中。 表3咔唑衍生物与DNA作用的结合常数和热力学参数Table 3 The binding constants K and thermodynamic parameters for DNAcarbazole deri

23、vative complex T (K)K (L. mol1)R aH (kJ .mol1)G (kJ .mol1)S /(J .mol1 K1)2931.391030.976873.1787.0747.113030.341030.99487.543180.051030.992388.25 S0为疏水作用力；H0或较小，S0为静电作用力;H0，且熵变对自由能变的贡献比焓变大，说明咔唑衍生物与DNA间的结合作用主要是熵驱动过程，同时由于实验在pH=7.0条件下进行，咔唑衍生物结构中的羟基很难大量电离，因而静电作用力不可能是两者结合的主要作用力。3 结 论 本文采用荧光和紫外可见光谱法、I效应、离

24、子强度的影响、DNA变性、不同温度对ctDNA和咔唑衍生物相互作用的影响对咔唑衍生物与ctDNA的键合作用和作用方式进行了研究。由上述实验得出以下几条结论： 1. 二者间存在较强的相互作用。DNA可以猝灭咔唑衍生物的荧光。2. 咔唑衍生物与DNA间的猝灭机理为动态猝灭。3.咔唑衍生物可能以嵌插方式和沟漕作用相结合的混合模式和DNA作用。准确的作用方式有待进一步研究。4. 咔唑衍生物与DNA的结合属于自发的，二者间相互结合力不是静电力。 参考文献1YANG Ran(杨冉), YANG Su-ling(杨素玲), QU Ling-bo(屈凌波), LI Jian-jun(李建军). Journal

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