新版GMP微生物限度检查法验证方案.docx

1、新版GMP微生物限度检查法验证方案 *微生物限度检查法验证方案 文件编号：VMP-VV-502-00 起 草 人： 审 核 人： 批 准 人： 批准日期： 年 月 日验证立项申请表 申请部门质量部申请日期 年 月 日验证对象*要求完成日期 年 月 日验证原因微生物验证验证类别微生物验证为了确认所采用细菌、霉菌及酵母菌计数方法和控制菌检查方法适合该品种药品的微生物限度检查，以保证检验结果的准确、可靠及检验方法的完整性。 申请部门负责人签名： 日期：质量部意见 签名： 日期：验证方案编号VMP-VV-502-00验证报告编号VMP-VV-502REP-00负责人意见 签名： 日期：验证小组成员部门

2、姓名职务备注：验证方案审批表审批程序部门负责人签名日期备注起草 审核批准负责人备注1.概述 通过验证以确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌的测定；确认所采用的方法适合于该药品的控制菌的检查，根据样品特性制订检验方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。若符合，按验证的方法和条件进行药品的微生物限度检查；若不符合，重新建立制订检验方法和检验条件，再进行验证，直至验证结果符合设立的验证标准。2.验证目的及范围 确认所采用的细菌、霉菌及酵母菌计数方法和控制菌检查方法适合该品种药品的微生物限度检查，以保证检验结果的准确、可靠及检验方法的完整性。本次验证为试验组

3、和对照组的菌回收率试验；控制菌检验方法的灵敏性、检出率及专属性试验。3.验证风险评估对于本次验证的执行进行了如下的风险分析：严重程度 S可能性 P可检测 D风险优先级 RPN = SPD1低1低1高RPN7低可以接受，无需采取措施2中2中2中16RPN8中一定程度上接受，但应按风险优先级采取措施尽可能降低3高3高3低RPN16或严重程度4高不能接受，尽快采取措施降低4关键4极高4极低步骤/单元危害S可能原因/程序失败P现行控制DRPN需采取措施SPDRPN培训验证部分项目出现偏差或漂移3方案培训不到位，方案的执行者不熟悉方案内容2严格执行经批准的验证报告进行培训，并考核合格318确认按照批准的

4、方案培训，培训者均熟练掌握所培训内容。1122检验过程操作不当未达到设定标准，验证失败。3未遵循成品微生物限度检查操作规程，未严格遵循方案规定方法。2制定成品微生物限度检查操作规程，并对规程及设立的验证方法培训，按规程及方案要求进行操作。318确认成品微生物限度检查操作规程已制定并批准，确认人员已培训；确认操作规程适用性。11224.验证前准备4.1验证人员培训：验证报告起草人有责任在方案批准后（且在验证实施前）对本次验证相关人员进行培训。培训人员记录见附件1。4.2将所有的平皿和稀释剂都应该严格按照相关的灭菌程序消毒，以确保其对试验的结果没有影响。4.3仪器与器具：恒温培养箱、生化培养箱、电

5、子天平、高压蒸汽灭菌器、净化工作台、无菌培养皿、无菌移液管。 5.验证内容5.1测试环境条件要求所有检查在环境洁净度C级下的局部A级洁净度的单向流空气区域内隔离系统内进行，其全过程严格遵守无菌操作，能防止微生物污染。5.2试验样品* 批号： ；规格： 5.3验证用菌种及培养基：5.3.1来源： 食品药品检验所 5.3.2菌落计数用菌种菌种名称内控编号大肠埃希菌(Escherichia coli) CMCC（B）44 102E-金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) CMCC（B）26 003S-枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) CMCC（B）63 501

6、B-白色念珠菌(Candida albicans) CMCC (F) 98 001 C-黑曲霉(Aspergillus niger)CMCC(F) 98 003A-注：编号由菌种首字母-传代代数-配制日期组成。5.3.3培养基及其制备方法：取市售的脱水培养基，分别按照规定方法进行配制后灌装于洁净的三角烧瓶中，然后加塞灭菌，在实验前加温熔化备用。培养基名称培养基批号配制日期有效期至改良马丁琼脂培养基玫瑰红钠琼脂培养基营养琼脂培养基5.4细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证：按照中国药典2010年版微生物限度检查法中的平皿法进行细菌、霉菌及酵母菌计数的方法学验证试验及菌落计数。5.4.1稀释液5.4.

7、1.1 0.9%无菌氯化钠溶液：取氯化钠9.0g，加水溶解使成1000ml，121高压蒸汽灭菌30分钟。5.4.1.2 pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液：取磷酸二氢钾3.56g，磷酸氢二钠7.23g，氯化钠4.30g，蛋白胨1.0g，加水1000ml，微温溶解，分装，过滤，121高压蒸汽灭菌30分钟。5.4.2实验中所使用的玻璃仪器及金属器皿在使用前均经过200干热灭菌2小时。5.4.3菌液制备5.4.3.1接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至10ml营养琼脂培养基中，3035培养1824小时，取此培养液1ml，加0.9无菌氯化钠溶液至10ml，采用10倍递增稀释法，稀

8、释至10-610-7，使菌数约为50100cfu/ml，做活菌计数备用。5.4.3.2接种白色念珠菌的新鲜培养物至10ml改良马丁培养基中，2328培养2448小时，取此培养液1ml，加0.9无菌氯化钠溶液至10ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-610-7，使菌数约为50100cfu/ml，做活菌计数备用。5.4.3.3接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，2328培养57天的用35ml 含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤丝的无菌毛细吸管）至无菌试管中，取1ml加含0.05%（ml

9、/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液至10ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-410-6,制成每1ml含孢子数50100cfu的孢子悬液备用。5.4.4供试液的制备：称取供试品10g，加温度不超过45pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀后，作为1:10的供试液。5.4.5验证方法5.4.5.1试验组：取1:10的供试液1ml和试验菌1ml，置直径90mm的无菌平皿中，注入1520ml温度不超过45的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。每稀释级每种培养基至少制备2个平板。大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌贴于营养琼脂培养基平皿上，白色

10、念珠菌、黑曲霉玫瑰红钠琼脂培养基平皿上。5.4.5.2供试品对照组：取1:10的供试品1ml，置直径90mm的无菌平皿中，注入1520ml温度不超过45的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。每稀释级每种培养基至少制备2个平板。大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌贴于营养琼脂培养基平皿上，白色念珠菌、黑曲霉玫瑰红钠琼脂培养基平皿上。5.4.5.3菌液组：取试验菌1ml，置直径90mm的无菌平皿中，注入1520ml温度不超过45的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。每稀释级每种培养基至少制备2个平板。大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆

11、菌贴于营养琼脂培养基平皿上，白色念珠菌、黑曲霉玫瑰红钠琼脂培养基平皿上。5.4.5.4稀释剂对照组：取稀释液1ml和试验菌1ml，置直径90mm的无菌平皿中，注入1520ml温度不超过45的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。每稀释级每种培养基至少制备2个平板。大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌贴于营养琼脂培养基平皿上，白色念珠菌、黑曲霉玫瑰红钠琼脂培养基平皿上。5.4.5.5验证试验进行三次独立的平行试验，并分别计算各次试验的菌回收率。测定结果见附件2附件6。5.4.5.6菌回收率计算 _;_Jt_*试验组的菌回收率（%）=试验组平均菌落数供试品对照组平均菌

12、落数100% _h_1_2 菌液组平均菌落数 6 k+FTDL_ 稀释剂对照组的菌回收率（%）=稀释剂对照组平均菌落数 100% /_ZZo_ _ 菌液组平均菌落数 B:)9hF_?o 5.4.6判定标准：试验组和对照组的菌回收率均应不低于70%。5.4.7结论：对细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证结果进行评价和总结。5.5控制菌检查验证方法：按照中国药典2010年版微生物限度检查法进行控制菌的方法学验证试验及检查。5.5.1验证用菌种：5.5.1.1来源： 食品药品检验所 5.5.1.2验证用菌种菌种名称内控编号大肠埃希菌(Escherichia coli) CMCC（B）44 102E-金黄

13、色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) CMCC（B）26 003S-5.5.1.3培养基及其制备方法：取市售的脱水培养基，分别按照规定的方法进行配制后灌装于洁净的三角烧瓶中，然后加塞灭菌。在实验前加温熔化备用。培养基名称培养基批号配制日期有效期至营养琼脂培养基胆盐乳糖培养基MUG培养基乳糖胆盐发酵培养基5.5.2菌液制备：接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至10ml营养琼脂培养基中，3035培养1824小时，取此培养液1ml加0.9无菌氯化钠溶液至10ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-510-7，使细菌数约为10100cfu/ml。5.5.3供试液的制备：5.

14、5.3.1称取供试品10g，加稀释剂至100ml，混匀后，作为1:10的供试液。5.5.3.2取1:10的供试液10ml，加稀释剂至100ml，混匀后，作为1:100的供试液。5.5.3.3取1:100的供试液10ml，加稀释剂至100ml，混匀后，作为1:1000的供试液。5.5.4控制菌检查方法的验证5.5.4.1大肠埃希菌：5.5.4.1.1供试品组：取供试液(1:10)10ml，直接接种至100ml胆盐乳糖培养基上，培养1824小时。取上述培养物0.2ml，接种至含5mlMUG培养基的试管内，培养，于5小时、24小时在366nm紫外光下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。若管内

15、培养物呈现荧光，为MUG阳性；不呈现荧光，为MUG阴性。观察后，沿培养管的管壁加入数滴里靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，为靛基质阴性。制备2个样品，记录结果。5.5.4.1.2试验组：取供试液(1:10)10ml，直接接种至100ml胆盐乳糖培养基上，培养1824小时。取上述培养物0.2ml，接种至含5mlMUG培养基的试管内，培养，于5小时、24小时在366nm紫外光下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。若管内培养物呈现荧光，为MUG阳性；不呈现荧光，为MUG阴性。观察后，沿培养管的管壁加入数滴里靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，为靛基质阴性

16、。制备2个样品，记录结果。5.5.4.1.3阳性对照组：取试验菌1ml，直接接种至胆盐乳糖培养基上，培养1824小时。取上述培养物0.2ml，接种至含5mlMUG培养基的试管内，培养，于5小时、24小时在366nm紫外光下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。若管内培养物呈现荧光，为MUG阳性；不呈现荧光，为MUG阴性。观察后，沿培养管的管壁加入数滴里靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，为靛基质阴性。制备2个样品，记录结果。5.5.4.1.4阴性对照组：取稀释剂10ml，直接接种至胆盐乳糖培养基上，培养1824小时。取上述培养物0.2ml，接种至含5mlMUG培养基的试

17、管内，培养，于5小时、24小时在366nm紫外光下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。若管内培养物呈现荧光，为MUG阳性；不呈现荧光，为MUG阴性。观察后，沿培养管的管壁加入数滴里靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，为靛基质阴性。制备2个样品，记录结果。5.5.4.1.5阴性菌对照组：取供试液(1:10)10ml，直接接种至胆盐乳糖培养基上，培养1824小时。取上述培养物0.2ml，接种至含5mlMUG培养基的试管内，培养，于5小时、24小时在366nm紫外光下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。若管内培养物呈现荧光，为MUG阳性；不呈现荧光，为MUG阴性。观

18、察后，沿培养管的管壁加入数滴里靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，为靛基质阴性。制备2个样品，记录结果。5.5.4.1.6验证试验进行三次独立的平行试验，并分别记录结果。测定结果见附件7。5.5.4.1.7判定标准：供试品组MUG培养基、靛基质菌应为阴性；试验组MUG培养基、靛基质菌应为阳性；阳性对照组MUG培养基、靛基质应为阳性；阴性对照组MUG培养基、靛基质菌应为阴性。5.5.4.1.8结论：对大肠埃希菌检查验证结果进行评价和总结。5.5.4.2大肠菌群：5.5.4.2.1供试品组：取含适量（不少于10ml）的乳糖胆盐发酵培养基管3支，分别加入1:10的供试液1ml、1:

19、100的供试液1ml、1:1000的供试液1ml，培养1824小时。观察乳糖胆盐发酵管的菌落情况，记录结果。5.5.4.2.2试验组：取含适量（不少于10ml）的乳糖胆盐发酵培养基管3支，分别加入1:10的供试液及试验菌各1ml、1:100的供试液及试验菌各1ml、1:1000的供试液及试验菌各1ml，培养1824小时。观察乳糖胆盐发酵管的菌落情况，记录结果。5.5.4.2.3阳性对照组：取1支乳糖胆盐发酵培养基管加入大肠埃希菌1ml，培养1824小时。观察乳糖胆盐发酵管的菌落情况，记录结果。5.5.4.2.4阴性对照组：取1支乳糖胆盐发酵培养基管加入稀释液1ml，培养1824小时。观察乳糖胆

20、盐发酵管的菌落情况，记录结果。5.5.4.2.5阴性菌对照组：取1支乳糖胆盐发酵培养基管加入金黄色葡萄球菌1ml，培养1824小时。观察乳糖胆盐发酵管的菌落情况，记录结果。5.5.4.2.6验证试验进行三次独立的平行试验，并分别记录结果。测定结果见附件8。5.5.4.2.7判定标准：供试品组应无菌生长或有菌生长但不产酸产气，为阴性；试验组应有菌生长并产酸产气，为阳性；阳性对照组应有菌生长并产酸产气，为阳性；阴性对照组应无菌生长，为阴性；阴性菌对照组应无菌生长，为阴性。5.5.4.2.8结论：对大肠菌群检查验证结果进行评价和总结。6.变更和偏差处理： 验证过程中如果出现偏差和变更，应立即通知验小

21、组对偏差和变更进行详细记录，分析偏差产生的根本原因并提出解决方法。所有偏差和变更得到有效处理后，验证方可进入下一步骤。偏差处理单和变更单经过批准后其原件必须附在验证报告中。见附件9。7.验证结果评定及结论： 质量部负责收集各项验证试验结果及评价记录、修改后的产品微生物限度检查操作程序，起草验证报告，报验证委员会。验证委员会负责对验证结果进行综合评审，做出验证结论，发放验证证书，确认产品微生物限度检查操作程序的验证周期。见附件10。8.拟定再验证周期： 验证小组根据验证情况，拟定再验证周期，报验证领导小组审批。9.会审及批准 会 审： 批 准：附件1培训人员记录表部 门培训人员签名签到日期培训师

22、签名日 期附件2 大肠埃希菌回收率测定（平皿法）试验批号供试品稀释倍数菌落计数(平均数)cfu/ml回收率%平皿试验组菌液组供试品对照组稀释剂对照组试验组稀释剂对照组 12平均 12平均 12平均 12平均 12平均验证结果评定操作人日期复核人日期附件3 金黄色葡萄球菌回收率测定（平皿法）试验批号供试品稀释倍数菌落计数(平均数)cfu/ml回收率%平皿试验组菌液组供试品对照组稀释剂对照组试验组稀释剂对照组 12平均 12平均 12平均 12平均 12平均验证结果评定操作人日期复核人日期附件4 枯草芽孢杆菌回收率测定（平皿法）试验批号供试品稀释倍数菌落计数(平均数)cfu/ml回收率%平皿试验组

23、菌液组供试品对照组稀释剂对照组试验组稀释剂对照组 12平均 12平均 12平均 12平均 12平均验证结果评定操作人日期复核人日期附件5白色念珠菌回收率测定结果（平皿法）试验批号供试品稀释倍数菌落计数(平均数)cfu/ml回收率%平皿试验组菌液组供试品对照组稀释剂对照组试验组稀释剂对照组 12平均 12平均 12平均 12平均 12平均验证结果评定操作人日期复核人日期附件6黑曲霉回收率测定结果（平皿法）试验批号供试品稀释倍数菌落计数(平均数)cfu/ml回收率%平皿试验组菌液组供试品对照组稀释剂对照组试验组稀释剂对照组 12平均 12平均 12平均 12平均 12平均验证结果评定操作人日期复核人日期附件7 大肠埃希菌（平皿法）检查结果试验批号 结果项目供试品组试验组阳性对照组阴性对照组阴性菌对照组MUG12靛基质12MUG12靛基质12MUG12靛基质12验证结果评定操作人日期复核人日期附件8 大肠菌群检查结果试验批号 结果项目供试品组试验组阳性对照组阴性对照组阴性菌对照组10-110-210-310-110-210-3乳糖胆盐发酵12乳糖胆盐发酵12乳糖胆盐发酵12验证结果评定操作人日期复核人日期附件9偏差处理与变更记录验证项目名称验证项目编号偏差说明：可能的原因：