糖尿病肾病诊断生物标志物研究新进展.docx

1、糖尿病肾病诊断生物标志物研究新进展糖尿病肾病诊断生物标志物研究新进展【摘要】 糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病要紧的微血管并发症。长期以来，DN初期诊断临床上要紧依托微量白蛋白尿(microalbuminuria, Malb)的测定，但作为DN诊断生物标志物(biomarker)其特异性和对疾病严峻程度的预测价值受到质疑。因这人们不断寻求DN诊断的新标志物，包括尿IgG和IgM、nephrin mRNA、Smad1及尿液炎症标志物。尽管目前已经发觉许多具有潜在价值的DN诊断生物标志物，但其对DN进展的预测价值尚未通过循证医学实验验证。 【关键词】 糖尿病肾

2、病; 生物标志物; 蛋白质组学糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病要紧的微血管并发症，以持续蛋白尿、肾功能进行性下降和高心血管疾病发病率及死亡率为特点1。据估量，2030年全世界糖尿病患者数量将从2000年的亿增加到亿，其中30%40%的2型糖尿病将进展为DN，20%40%的1型糖尿病1530年后也将进展为DN2，DN已成为引发终末期肾衰最多见的缘故之一。如何初期发觉DN，并进行初期干与是临床上迫切需要解决的问题。尽管肾活检是初期明确诊断DN的金标准,但作为一项创伤性和技术复杂的检查，它难以普及和临床反复进行。因此踊跃寻觅DN初期诊断生物标志物(biomark

3、er)将具有超级重要的临床意义，为此国内外最近几年来进行了大量的实验和临床研究，作者简要综述有关进展。1 DN诊断中的生物标志物 微量白蛋白尿(microalbuminuria, Malb)长期以来，DN初期诊断临床上要紧依托Malb测定。正常情形下，肾小球滤过膜存在电荷选择性屏障，在静电同性排斥作用下，绝大多数的白蛋白不能通过滤过膜。而在DN初期，由于肾小球滤过膜带负电荷的乙酰硫酸肝素、唾液酸等成份减少，使肾小球滤过膜的电荷选择性降低，并干扰了蛋白多糖与细胞外基质间亲和力。另外，最近研究说明高糖环境可致肾小球内皮细胞外被的多糖蛋白复合物受到破坏，致使肾小球滤过膜上滤孔孔径增大和肾小球滤过膜富

4、含带负电荷的结组成份改变3-4;细胞因子和生长因子通过量途径改变血流动力学应力致使DN结构改变，足细胞增宽伴随每一个肾小球足细胞数量减少，从而致使白蛋白在尿中排出增多。Sampaio等5应用免疫比浊法对293例糖尿病患者进行横断面研究说明，当尿白蛋白浓度(UAC)界定值为22 mgL-1时，灵敏性为%，特异性为74%，当尿白蛋白/尿肌酐(UACR)界定值为 mgg-1时，灵敏性为%，特异性为%。而UAC低界定值(10 mgL-1)尽管其灵敏性提高%)，但特异性显著降低%)，UACR也是如此。研究说明，UAC和UACR在反映Malb水平的转变中其精准性相似，对1型和2型DN诊断的灵敏性也无不同。

5、大多数研究以为，Malb程度与DN的预后紧密相关。日本学者通过对5 449例糖尿病患者进行5年随访，监测其尿白蛋白与肌酐的比值(ACR)，发觉ACR升高即便只在正常高限，也可预测肾小球滤过率估测值(eGFR)的下降6。可是，最近研究发觉，只有30%45%的Malb患者在10年内会进展为蛋白尿7，而且，临床许多情形下(如运动、发烧、原发性肾脏病、感染等)Malb也能够显著升高。因此，Malb作为DN诊断生物标志物其特异性和对疾病严峻程度的预测价值受到质疑。 免疫球蛋白(IgG和IgM)IgG是血液中要紧免疫球蛋白，多数以单体形式存在，要紧由脾和淋巴结合成，不经肾小球滤过，故正常人尿液中含量极低。

6、日本学者以为IgG升高范围与肾小球破坏程度呈正相关，且在DN初期，Malb正常时IgG已明显升高，对初期DN诊断成心义。IgG 4个亚型中IgG4带负电荷，当电荷屏障受损时，可见IgG4与白蛋白排泄率呈正相关，专门是IgG4/IgG之值意义更大，在DN晚期，由于肾小球机械屏障损害，IgG排出增多，IgG4/IgG之值下降。因此IgG4、IgG4/IgG之值可反映初期DN电荷屏障的损害。IgM是分子量较大的免疫球蛋白(分子量为120 )，尿中IgM的显现往往反映肾小球滤过屏障严峻受损8。Rafid等9对139例1型糖尿病患者进行了长期随访(平均随访期18年)，发觉患者的生存率和肾脏存活率与白蛋白

7、排泄(RR=和尿IgM排泄有关(RR=，分层分析提示，不同程度的蛋白尿患者心血管疾病的死亡率和ESRD的发生率随着尿IgM排泄的增多风险显著增高(3倍左右)。DN患者不管是初期仍是晚期，尿液IgM排泄增加，其心血管病死亡率和肾衰的风险性均显著提高，提示尿液IgM的排泄是DN患者心血管疾病死亡率及ESRD独立预测因子。 尿足细胞相关生物标志物最近大量研究说明，足细胞损害在DN发生进展中起超级关键的作用。一方面，DN进展进程中高糖、高血脂、糖基化终末产物(AGEs)、血管紧张素(Ang)、活性氧簇(ROS)、转化生长因子 (TGF )和机械应力的增加对足细胞直接造成损伤,致使足细胞密度减少、体积增

8、大和足细胞特异性蛋白表达改变10;另一方面,足细胞作为肾小球滤过屏障的重要组成成份,其形态结构及相关分子改变必然增进蛋白尿的发生11。Jennifer等12通过对OVE26转基因糖尿病大鼠研究发觉，足细胞改变可能在DN失代偿期才增加滤过屏障的通透性。足细胞位于肾小球毛细血管外侧，故当肾小球受损时足细胞离开肾小球基底膜，在尿中可检测到。有学者以为，尿液中足细胞检测有助于对肾小球损伤严峻程度的判定，但其技术复杂。最近几年来人们通过对足细胞标记蛋白和基因的检测，有可能加倍便利地了解DN不同时期足细胞的损害。nephrin是裂孔隔膜上发觉的第一个跨膜蛋白，由足细胞表达、组成裂孔隔膜拉链样结构，与pod

9、ocin、CD2AP组成复合体，维持裂孔隔膜结构的完整，阻止蛋白滤出。研究发觉，DN患者肾小球nephrin mRNA表达减少，引发足细胞损伤脱落，滤过屏障功能破坏，通透性增加，尿蛋白排出增加13。Wang等14通过检测DN患者尿沉渣中足细胞相关分子(nephrin、podocin和synaptopodin)的mRNA，发觉其表达升高，应用血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)和Ang受体阻滞剂(ARB)医治后，逆转录定量 聚合酶链反映(qRT PCR)证明尿液沉渣中nephrin mRNA排泄减少，尿液中podocin表达的改变可能与DN预后有关15。 尿Smad1DN最要紧的形态学改变是肾小球

10、基底膜(GBM)增厚和系膜基质扩张，Takeshi等16在体外实验中证明，Smad1作为胶原4中1和2的转录因子能够上调胶原4的表达，活化肾小球硬化相关分子如胶原特异性伴侣热休克蛋白47、骨桥蛋白、1型胶原、 SMA等。链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠在24周系膜基质扩张，肾小球Smad1表达升高与系膜基质扩张程度一致。肾小球Smad1表达与肾小球胶原4和 SMA表达一致，而蛋白尿、GFR与系膜基质扩张无关。说明Smad1能够上调胶原4和 SMA的表达，而胶原4是系膜基质扩张的重要组成物质，因此Smad1在DN系膜基质扩张中起重要作用。他们以为Smad1可能比Malb更好地预测DN的系膜基

11、质扩张，能够作为DN系膜基质扩张的诊断标志物。Akira等17对STZ诱导糖尿病小鼠和db/db糖尿病大鼠尿液Smad1水平进行观看，发觉4周时小鼠尿Smad1水平与24周时系膜基质扩张相关，而蛋白尿与系膜基质扩张无明显相关。Olmesartan(奥美沙坦)医治可显著改善肾小球硬化和降低尿Smad1水平。一样地，在db/db大鼠，6周时尿Smad1与18周时系膜基质扩张有关。因此以为糖尿病初期时期尿液Smad1的增加与肾小球硬化有关，Smad1可作为新标志物预示DN晚期显现的系膜扩张。尽管很多报导都提及Smad1的激活机制，可是只有相当少的报导提示相关因子能够上调Smad1的表达，如AGEs与

12、糖尿病肾小球Smad1的表达呈正相关16。Takeshi等16一样发此刻糖尿病大鼠中肾小球TGF 和激活素受体样激酶 1(ALK 1)的表达增加，可是没有发觉TGF 和ALK 1与肾小球Smad1表达有直接关系。 尿液炎症标志物传统以为代谢和血流动力学改变是致使DN损伤的要紧缘故，此刻愈来愈多的证听说明，炎症因子介导的免疫反映在DN进展进程中起重要作用18。多种细胞，包括白细胞、单核细胞和巨噬细胞，还有其他一些分子如趋化因子(单核细胞趋化蛋白 1，MCP 1)、黏附分子(细胞间黏附分子 1，ICAM 1)、酶类(环氧酶 2，COX 2;一氧化氮合酶，NOs)、炎症因子(血管内皮生长因子，VEG

13、F;生长激素，GH;胰岛素样生长因子，IGF;TGF )和核因子(核因子 B，NF B)都与DN进程有关19-21，可是炎症因子对糖尿病患者肾损伤的作用机制知之甚少。在众多的炎症因子中白介素(IL) 一、IL 六、IL 18和TNF 与DN进展的关系较为明确21，其对DN并发症的进展也有多种作用，它们在微血管病变中有时乃至起着决定性的作用22-23。另外，流行病学调查显示炎症参数能够专门好地预测DN进展。Wolkow等24用Luminex 100 platform联合酶联免疫法(ELISA)的方式检测1型糖尿病归并Malb患者尿液标本中IL 八、干扰素诱导蛋白 10(IP 10)、MCP 一、

14、IL 六、巨噬细胞炎性蛋白 1(MIP 1)5种尿炎症标志物，发觉肾功能下降者上述5种炎症因子的浓度均高于肾功能正常者。多变量分析提示,两种标志物同时升高时肾功能受损的风险会增加5倍。提示肾脏炎症在1型DN的进展中起重要作用。Tesch25以为MCP 1/CCL 2是DN肾脏炎症、损伤、纤维化的始动者，尿MCP 1水平能够用来评估糖尿病肾脏炎症程度，可能对新疗法或联合医治成效评估有诊断价值26。另外，在啮齿动物上做的基因缺失和分子阻断实验证明MCP 1是阻断2型糖尿病进展的重要医治目标。还有证听说明人类MCP 1基因多态性与DN进展紧密相关，这可能预示这些基因是DN的危险因素27。2 DN诊断

15、中的新技术 蛋白质组学(proteomics) 以蛋白质组学技术为手腕，比较正常肾脏组织与病变肾脏组织中蛋白质水平的不同，或健康者尿样/血浆与肾脏病患者尿样/血浆中蛋白质水平不同，大大提高了DN诊断的阳性率，并有助于明白抱病理生理学机制。蛋白质组学技术包括蛋白质分离和鉴定技术。二维凝胶电泳(2 DE)是蛋白质分离的大体方式，电喷雾质谱(ESI MS)和合作辅助激光解吸、离飞行质谱(MALDI TOF MS)技术是蛋白质鉴定的核心技术，它的特点是高灵敏度、快速、直接提供样品的分子量和结构信息并可与色谱连用。Kiga等28利用这一技术观看到,在2 00010 000 Da范围内伴有DN的自发性糖尿

16、病WBN/Kob大鼠血浆中显示80个峰，与对照的Wistar大鼠相较，其中质量电荷比(m/z)为4 67八、4 73二、4 80八、9 05八、9 323和9 465的蛋白峰强度高，利用Hachimi jio gan后血糖水平没有改变而DN改善，上述不同表达蛋白质峰同时发生改变，而m/z为5 067、5 27九、7 598和7 917的质谱峰没有改变。研究结果提示m/z为4 67八、4 73二、4 80八、9 05八、9 323和9 465的蛋白质可能参与DN的发生进展,且与achimi jio gan的医治靶点有关。Sanju等29应用蛋白质组学技术构建蛋白质数据库，以成立DN预测体系。他们

17、用2 DE法从32例患有局灶节段性肾小球硬化(FSGS)、狼疮肾、膜性肾病或DN的患者中分离出两种尿蛋白。其中16例患者的尿蛋白被用来构建那个数据库，用另外16例患者的尿蛋白验证预测体系的准确性。结果说明此方式诊断以上疾病的灵敏性在75%86%之间，特异性在92%76%之间。Kasper等30在305个病例中，通过毛细管电泳法及电板离子化质谱分析法，用盲法概念并证明了一组由40种生物标志物组成的数据，可将糖尿病患者从正常人中区分出来(灵敏性89%，特异性91%)。在这些糖尿病患者中，糖尿病伴正常蛋白尿患者与DN患者有102种尿生物标志物有显著不同，一个包括了其中65种生物标志物的模版能够极为灵

18、敏地识别DN(灵敏性97，特异性97%)，并将DN和其他慢性肾脏疾病区分开来(灵敏性81%，特异性91%)。那个研究显示，应用蛋白质组学技术进行尿蛋白分析能够为DN提供初期诊断。3 展 望DN生物标志物研究关于初期诊断DN具有超级重要的价值，尽管目前已经发觉许多具有潜在价值的DN诊断生物标志物，但其对DN进展的预测价值尚未通过循证医学实验验证。尽管蛋白质组学技术已初步应用于DN生物标志物的研究，但仍存在许多技术性问题，如正常尿液蛋白含量低，对其浓缩技术还不完善;对不同疾病状态下尿液分析还缺乏充分的标准图谱等。随着技术不断改良，相信不久的以后，人们必将发觉更多与DN病理生理进程紧密相关、并能够准

19、确预测DN疾病进展和严峻程度的生物标志物，从而为DN初期诊断和医治提供更多有价值的生物学信息。【参考文献】 1 FIORETTO P, MAUER M. Histopathology of diabetic nephropathyJ. Semin Nephrol， 2007,27:195 207.2 FIORETTO P, BRUSEGHIN M, BERTO I, et al. Renal protection in diabetes: role of glycemic controlJ. J Am Soc Nephrol， 2006,17:86 89.3 YASHPAL S K, JUN

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