第一章-病毒农药.ppt

1、第一章 病毒农药,病毒是非细胞形式的最小有机体，是一种最原始的生命形态。一个病毒由两部分构成：内部是核酸，外部是衣壳，成分是蛋白质。,结构简单。只含有一种类型的核酸RNA或DNA。没有细胞器和细胞构造、不能独立生活，只能在活的寄主细胞内才能复制增殖。,第一节 病毒杀虫剂概述,一、病毒的主要特征1.什么是病毒病毒只含一种核酸，DNA或RNA，而其他生物一般同时含有DNA和RNA两种核酸；病毒依靠自身的核酸通过复杂的生物合成过程进行复制，复制在特定的宿主活细胞中进行，而不是通过二分裂或类似二分裂方式繁殖；病毒缺乏完整的酶系统，不含核糖体，必须利用宿主细胞的核糖体合成自身蛋白质，脱离宿主不能进行任何

2、形式的代谢活动；病毒对抗菌素或其他对微生物代谢途径起作用的因子不敏感；昆虫病毒的主要组成成分是核酸和蛋白质，只有核酸能够繁殖和具有感染能力。,昆虫病毒是指以昆虫为宿主并对昆虫有致病性的病毒超显微没有细胞结构在活细胞里专性寄生的大分子微生物在活体外具有一般大分子的特征，进入宿主细胞又具有生命 特征,80%的昆虫病毒都是农林业中常见的鳞翅目害虫的病原体，因此是害虫生物防治的巨大资源库,2、历史和现状家蚕和蜜蜂黄疸病。中国陈旉所著农书(1149)中即有关于家蚕“高节”、“脚肿”病的记载，即中国农民俗称的“脓病”。20世纪初才证明“脓病”病原是核型多角体 1949年加拿大引进欧洲云杉叶蜂NPV(核多角

3、体病毒)控制害虫。1940-60年代主要应用细菌防治，70年代才利用病毒。1981年，对病毒病的描述，几乎遍及昆虫纲的各个目，记载了800多种寄主昆虫和螨类的1200种病毒病。1980年代，我国已经分离出200种以上的昆虫病毒。,俄：黄叶蜂NPV、甘蓝夜盗蛾、舞毒蛾、美国白蛾、天幕毛虫等。捷：美国白蛾GV法：松带蛾CPV日：1974年注册了赤松毛虫CPV，直升飞机喷洒。还对茶小卷叶蛾、茶卷叶蛾GV进行研究利用。埃及、中：斜纹夜蛾NPV新西兰：牧草蝙蝠蛾WNPV斐济：独角仙病毒,国际上已报道过的昆虫病毒有1600多种，分属于6个目的昆虫，60%为杆状病毒，能引起1100种昆虫和螨类发病，可控制近

4、30%的粮食和纤维作物上的主要害虫。至少有60多株进入大田应用或示范，约20多株制成杀虫剂，仅就俄罗斯而言，1990年已有14种病毒杀虫剂，其中有7种年总产量为60多吨，防治面积150万公顷。1971年，棉铃虫NPV在美国成为第一个商品化制剂，1987年美国加强了对舞毒蛾、黄杉毒蛾、苜蓿尺蠖等NPV的研究。,我国已报道220种，250株，绝大部分为杆状病毒，寄生在70多种寄主中。始于60年代，先是调查、收集，70年代后做了大量工作。1987年我国将棉铃虫NPV投入商品化生产。北京、广东(斜纹夜蛾NPV)、武汉、华东(棉铃虫NPV)都进行过卓有成效的工作。我国有20株进入大田应用或示范，7株制成

5、制剂，先后建立5座工厂，一种新的生物农药产业。,3、优点1)选择性好：仅能寄生一种或少数同科同属亲缘相近的昆虫种类，不损伤天敌，不易引起生态平衡的破坏。2)传播性强：很快扩散蔓延，造成流行病，能垂直传播，造成区域流行病。3)持久性长：包涵体可抵抗不良环境，具有非常好的稳定性，是自然环境中的一部分，能起长期控制作用。4)经济效益高：剂量低，使用简便。5)安全性好,4、缺点1)防治效果慢：10天，潜伏期较长，往往降低其商业价值和实际效果。2)防治谱窄：不能成功地用来防治种植地区生长季节内繁衍的多种害虫。3)受到温度、阳光等环境条件影响较大。4)不易生产,二、病毒的分类与命名病毒的分类原则 ICTV

6、，国际病毒分类委员会，2005年发布，3个目、73个科、11个亚科、289个属2.病毒分类的依据 1）病毒粒子特性：形态特征；病毒生理生化和物理性质；病毒基因组；病毒蛋白；病毒脂类和碳水化合物的含量及特性；病毒基因组组成和复制特性；2）病毒抗原性质 3）病毒生物学特性,3.病毒命名 地名、人名、病毒感染引起的症状、病理特性、病毒粒子形态、宿拼字以及字母和数字进行命名。,1.昆虫的病原病毒 属于13个病毒科，2个病毒亚科，21个病毒属a.根据病毒核酸的类型分为：DNA病毒dsDNA病毒，包括：杆状病毒科；多分DNA病毒科；痘病毒科；泡囊病毒科；虹彩病毒科 DNA病毒ssDNA病毒，包括细小病毒科

7、 DNA和RNA反转录病毒，包括：前病毒科；变位病毒科,三、昆虫的病原病毒与病毒杀虫剂,RNA病毒dsRNA病毒，包括：呼肠孤病毒科；二分RNA病毒科 RNA病毒ssRNA病毒，包括：微RNA病毒科；野田村病毒科；T4病毒科果蝇X病毒属于二片段双链RNA病毒(Bisegmented ds RNA)，与其它类似的病毒在一起，可能成为一新科，包囊病毒也是。在已发现的昆虫病毒中，最小和最庞杂的是小RNA病毒。全世界已发现的昆虫病毒，划分成22个类型，且每一个类型给予一个编码。,b.根据包含体在寄主细胞中的部位，分为：核型多角体病毒(NPV)寄生在寄主细胞核内，包含体内含有多个杆状病毒粒子质型多角体病

8、毒(CPV)寄生在寄主细胞质中，包含体内含有多个球状病毒粒子颗粒体病毒(GV)在感染的细胞核里和细胞质里均可发育形成。多为椭圆形，也有肾形，每个包含体一般仅含一个杆状病毒粒子无包含体病毒如昆虫浓核病毒、感染病毒的寄主细胞核膨胀、核内物质呈浓密、丰盈现象昆虫痘病毒(Vagoiavirus)寄生于细胞质内，但纺锤形包涵体是不包埋病毒粒子的,2.病毒杀虫剂 病原病毒=病毒杀虫剂？主要有：杆状病毒科、逗病毒科、细小病毒科、呼肠 孤病毒科1962年，棉铃虫核型多角体病毒,有20种左右杆状病毒杀虫剂进入田间试验或实际应用，包括：棉铃虫、甜菜夜蛾、斜纹夜蛾、苜蓿银纹夜蛾、春尺蠖、舞毒蛾、木毒蛾、美国白蛾、甘

9、蓝夜蛾、茶毛虫、灰茶尺蠖、茶尺蠖、大蓑蛾、油桐尺蠖等核型多角体病毒 小菜蛾、菜青虫、黄地老虎、杨扇舟蛾、玉米螟、茶蚕等颗粒体病毒。,感染病毒的幼虫形成大量包含体，扩散、传播杆状病毒有宿主专一性，宿主仅限于节肢动物，对脊椎动物、植物完全不感染应用安全主要见于昆虫体内，是已知昆虫病毒中类群最大、发现最早、研究最多，且实用意义最大的主要应用：作为载体，表达外源基因作为杀虫剂，有效地控制农业害虫的发生，并且对环境不造成污染,杆状病毒,A亚组核型多角体病毒(NPV)，如家蚕NPV，棉铃虫NPV，松毛虫NPV，春尺蠖NPV，舞毒蛾NPV，斜纹夜蛾NPV，粘虫NPV，中国刺蛾NPV等；B亚组颗粒体病毒(GV

10、)，如黄地老虎GV，菜粉蝶GV，茶小卷叶蛾GV等；C亚组非包涵体核型杆状病毒，如印度棕榈独角仙病毒；D亚组非包涵体多分体DNA基因组核型杆状病毒，如甜菜尺蠖姬蜂病毒。,第二节 DNA病毒杀虫剂,杀虫活性 7个目，290多种害虫，主要为鳞翅目，其次为膜翅目、双翅目、鞘翅目和直翅目昆虫。LD50：50100微克/头。害虫死亡高峰在施药后的4-5天。甜菜夜蛾核型多角体病毒只对甜菜夜蛾有效，药后4天达到死亡高峰；棉铃虫病毒只对夜蛾属的昆虫有效，死亡高峰在第5天,广谱性的杆状病毒：苜蓿银纹夜蛾病毒 对10多种害虫有效。克服防治谱窄的部分弱点 但活性低12个数量级。研究最为深入,一、核多角体病毒(nucl

11、ear polyhedrosis viruses，简称NPV)是研究最早、最详细的一个类群，我国至少已发现60多种，已有比较成功的病毒制剂。主要寄生在鳞翅目昆虫中。NPV生物学特性(1)形态特征病毒粒子的形态结构：呈杆状，具囊膜，基因组为双链环状DNA分子，以超螺旋形式压缩包装在杆状衣壳内。,包涵体的形态结构：呈多边形，具梭角。常因寄主种类的不同而不同，即使同种昆虫，甚至同一细胞，多角体的形态和大小也有区别。常见的有三角形、四角形、五角形、六角形、立方形、近圆形和不规则形。核型多角体病毒的包涵体呈多角形，有两种包埋形式：一种是多角体内包埋着许多单个的病毒粒（单粒包埋型），简称SNPV；另一种是

12、1个包膜内包裹着多个核壳(一般称为病毒束)，成束地被包埋于多角体蛋白基质中(多粒包埋型)，简称MNPV。,不同多角体的形状,同一品系或分离株病毒的多角体的形状是趋于稳定的，相同寄主而不同品系或分离株病毒的多角体的形状和平均大小就可能判别比较大。如从盗毒蛾幼虫体分离的NPV的两菌株，一个多角体是多形状的，另一个是立方形的，而用它们混合感染盗毒蛾幼虫时，在同一感染细胞内并未同时发现两个病毒株，因而多角体的形状可以作为辨别一个病毒品系或分离株的标志。多角体的表面有膜，若多角体被溶解，则会留下囊状空泡，再延长时间，也会被溶解，与核膜相似,棉铃虫MNPV的病毒束可有2-6个核衣壳，最多达20 多个；斜纹

13、夜蛾为2-10个；盗毒蛾为6-10个。两种不同包埋型的病毒，与不同的病毒品系或分离株有 关，是由遗传性决定的。同一种昆虫病毒的两种不同包埋型的NPV，它们对寄主 的感染力、专一性、对环境的抵抗力以及多角体蛋白的 化学持性、血清学特征等方面都可能有较大的差异。,扫描电子显微镜下的隐纹稻苞虫NPV的多角体,对不同化学药剂具有高度抵抗力不溶于水及多种有机溶剂不被细胞或细胞蛋白酶分解在pH值22.9时，可被胰蛋白酶破坏溶于强酸和强碱溶液比重大于水，对低温有较强的抗力，抗高温能力差不溶于昆虫血淋巴，所以将其接种于昆虫的血腔，幼虫不会感染必须通过幼虫食入，经消化液消化后，才能释放出有 感染力的病毒粒子。,

14、（2）理化性质,经干燥后，可以保存多年性质不变，如家蚕多角体在无 水氯化钙中保存37年，其在碳酸钠中的溶解性不变。可以抵抗细菌的腐败作用，在提纯或死虫尸为细菌污染 时，多角体一般不受收破坏。在昆虫幼虫消化认中的溶解性不受寄主范围的限制，对 非敏感昆虫也是如此。有较强的折光性，成熟的多角体不易被一般染料着色，但经酸碱处理一可为一些染料所强染。,NPV致病机理 通过幼虫口服侵入。多角体在易感虫体中肠内迅速溶解，侵入上皮细胞，并出现最初的复制；在侵染昆虫细胞核内充满大量的多角体，体内组织液化；病毒蛋白酶产生，细胞核和细胞裂解。专化性强，一般只感染同种昆虫。,昆虫表现症状 初期：行动迟缓，缺乏食欲，体

15、躯肿胀，变黄或乳白色，皮肤变脆，组织液化，一触即破。后期：趋向最高处，如植株项端，头朝下倒挂。,中毒症状：初期无明显变化，渐而行动迟缓，食欲减退，体色变淡或油光色，血淋巴变乳白色。体内组织液化，躯体前端膨大，皮肤易裂，破后流出乳白色或褐色浓绸液体，无特殊臭味。,棉铃虫幼虫的环节处被核型多角体病毒感染,3.NPV杀虫剂的生产 1987年建成我国第一座棉铃虫病毒杀虫剂实验工厂，开始步入商品化生产；1993年，由中国科学院武汉病毒所同湖北蒋湖农场登记了我国第一个昆虫病毒杀虫剂产品棉铃虫核型多角体病毒杀虫剂；随后共有12个昆虫病毒制剂品种登记注册，1个原药品种获得登记。开发最成功的是棉铃虫病毒杀虫剂，

16、十多年里，累计生产2000余吨，累计推广面积超过1000万亩次。,病毒杀虫剂生产工艺(以NPV杀虫剂为例),病毒的提取技术,防菌保护剂,增效诱饵剂,病毒杀虫剂安全性试验,填充剂,辅助剂,NPV剂型配制,称量标准计数,生物活性测定,产品分装、包装、保藏,病毒多角体检测,感病虫体的收集、破碎、匀浆过滤,NPV的采集、分离、鉴定,NPV毒株的引进,天然饲料养、添食、使感染，大量增殖NPV,直接从野外大量收集NPV虫尸,用人工半合成饲料大量增殖NPV,重组(遗传改良)昆虫杆状病毒,二、颗粒体病毒(Granulovirus，简称GV)最早是法国人于1926年在患病的大菜粉蝶中发现的。主要存在于鳞翅目昆虫

17、幼虫中，至1980年，全世界已发 现100种昆虫感染这种病毒，其中只有一种是膜翅目昆虫我国从20多种昆虫中发现这种病毒病有较强的致病性。,GV生物学特性(1)形态特征颗粒体的形态结构：呈杆状，常弯曲，大小因寄主种类不同而异。病毒粒子从颗粒体中释放出来后，其直径和长度有增大的现象，病毒粒子脱去囊膜，其长度也会增加。如黄地老虎GV，完整的病毒粒子大小为31070nm，脱去囊膜后，核衣壳大小为32545nm。每个病毒粒子 两层膜包被：囊膜、衣壳；两层膜之间有空隙。,菜粉蝶GV颗粒体经弱碱溶解后释放出的病毒粒子,包涵体的形态颗粒体是包涵和保护病毒粒子的结晶状蛋白质，体积较多角体小，呈卵形、椭圆形、肾形

18、，有时也出现长角状、角状、分叉状、不规则形、多角形等。在同一昆虫体内，颗粒体的体积也有不同一个颗粒体仅包埋一个（偶尔2个）病毒粒子,稻纵卷叶螟GV颗粒体,比重大于水 不溶于水及多种有机溶剂 强酸和强碱条件下迅速溶解，并使粒子变性失活 耐低温，高温和紫外线易使粒子失活 有包涵体的颗粒体病毒，在外界环境中较稳定，在 室内和野外土壤中的存活时间长达数年 没有包涵体保护的颗粒体，稳定性差。,(2)颗粒体病毒的理化性质,GV致病机理 口服侵入易感虫体，颗粒在中肠内溶解，粒子通过肠道柱形细胞的微绒毛侵入细胞，在细胞核中增殖，新形成的粒子释放入血液，继发感染。,中毒症状：初期无明显病症，发展出现反应迟钝和停

19、止取食，在不同组织中颗粒体大量累积，体色有明显变化，腹面出现淡白或乳白色或带黄色。体壁出现斑点或变色，身体变软，皮肤易破。,3.GV 杀虫剂的生产和应用对昆虫有很强的致病性，常常在野外爆发自然流行病，抑 制寄主种群的发展，实验室饲养昆虫种群也往往因受GV 感染而大量死亡作感染力测定常以死虫尸内含物的稀释倍数作剂量单位。小龄幼虫比大龄幼虫敏感，大龄幼虫受感染后，可以化蛹 并发育为成虫，但受感染的蛹常常死亡。经血腔接种，幼虫不受感染。专一性比NPV强，交叉感染只限于种内或属内。,三、昆虫痘病毒(Entomopoxvirus，简称EPV)EPV生物学特性(1)形态特征 病毒形态：卵圆形或砖形 鳃角金

20、龟子痘病毒：400250毫微米 鳞翅目和直翅目痘病毒：350250毫微米 双翅目痘病毒：320230毫微米 包涵体有2类：球形体（包埋病毒粒子）纺缍体（不含病毒粒子）,均在细胞质中形成,2.EPV 致病机理 害虫食入包涵体，包涵体进入消化道后溶解，散出病毒粒子。粒子在体腔感染寄主脂肪体、气管上皮细胞和生殖腺等。害虫染害后，体呈恶白色，脂肪体呈泡沫状，血细胞增大，病毒在脂肪体细胞和血细胞的细胞质内增殖。病毒传递主要通过口服和接种进行，没有卵传现象。,3.EPV 杀虫剂的生产和应用 Herpin和Vago于1983发现，可感染鞘翅目、鳞翅目、双翅目和直翅目昆虫。我国新疆地区发现的新疆西伯利亚蝗寄主

21、。,四、细小病毒(Parvoviridae，简称DNV)DNV生物学特性(1)形态特征 病毒粒子为六角形二十面等轴对称体，核心为单链DNA，无膜，无包涵体。只有3个种，其中只有浓核症病毒侵染昆虫,2.DNV 致病机理 幼虫不肿胀而呈萎缩形，死后呈茶褐色，有时为暗红色。可与菜粉蝶颗粒体病毒混合感染，也可单独感染，混合感染多呈肿胀型，单独感染呈萎缩型。害虫死亡较快，在25下，染虫后23天即可死亡。,DNV 杀虫剂的生产和应用 国外：蜡螟浓缩核症病毒和鹿眼蝶浓缩核症病毒。国内：菜粉蝶浓缩核症病毒 可感染：鳞翅目、鞘翅目、膜翅目害虫,五、其他DNA杀虫病毒-虹彩病毒（Iridoviridae,IV)生

22、物学特性(1)形态特征 病毒粒子为二十面体，直径120200毫微米，核心为双股氧核糖核酸，无膜，无包涵体。代表种为：二化螟虹彩病毒，是鳞翅目幼虫感染虹彩病毒的第一个例子。发现于日本九州。,2.IV致病机理 食入病毒感染，粒子大量复制，在组织内形成大量结晶体，活体昆虫出现虹彩颜色。感染部位主要在脂肪细胞，其次为皮肤上皮细胞、神经细胞和肌肉细胞。,3.IV杀虫剂的生产和应用 感染28种双翅目，10多种鳞翅目，也可感染鞘翅目、半翅目和膜翅目昆虫。主要寄主有：棉铃象甲、叶跳虫、深山叶蝉、稻绿叶跳虫、黑尾叶蝉、小褐飞虱，蚊虫。,一、质型多角体病毒(polyhedrovirus，简称CPV)1950年在患

23、病的灯蛾幼虫 中发现的，已在鳞翅目、双翅目、膜翅目、鞘翅目和脉翅目等200多种昆虫 发现。已知寄主种类 和数量，仅次于NPV，在我国已发现有10多种。,第三节 RNA病毒杀虫剂,CPV生物学特性(1)形态特征及理化性质 六角形、二十面体、圆球形、椭圆形、四角形和正方体 不溶于水，但在水中经较长时间易被蚀刻，从而容易失去粒子；在碱液中的溶解度小于NPV，粒子在碱液中迅速失活。一个多角体可以埋1001000个病毒粒子 大多数粒子为二十面体，具12条突起,CPV病毒粒子模式图,家蚕CPV立方形多角体,2.CPV致病机理 通过幼虫口服侵入，主要感染幼虫的中肠部位，也能蔓延到其他组织。然后进行复制。,昆

24、虫表现症状 初期：食欲不振，体形缩小，比例失调形成大头，长刺毛。皮肤不被侵染，其它组织也很少侵染，无组织液化现象。幼虫消化道吐现不透明和淡黄色或乳白色，失去半透明和淡绿色。后期：皮肤出现白色斑块。中肠细胞液化后，多角体可被呕吐出来或由粪便排出。,3.CPV 杀虫剂的生产和应用 100多种害虫，主要为鳞翅目、少数为双翅目和膜翅目。染 虫后720天死亡。口服感染。进入虫体，在后部第7节穿透中肠，在细胞间扩 散，直至中肠前端。中肠上皮细胞核内是病毒RNA合成部位，核周围的细胞质是 病毒蛋白质合成部位。致病性强，低剂量即可使寄主昆虫感染 死亡率与剂量没有直接对应性 可通过母代传递至寄主的子代，成为长期

25、抑制寄主种群的 一个致病因子,五、其他RNA杀虫病毒双RNA病毒科野田村病毒科四对称病毒科,一、病毒杀虫剂遗传改造的研究进展 病毒杀虫剂的优缺点？重组昆虫病毒的分子生物学基础重组病毒的稳定性重组病毒在环境中的适应性重组病毒的安全性重组病毒的生态安全性,第四节 病毒杀虫剂的遗传改造,二、病毒杀虫剂遗传改造的方法 基因重组技术：插入外源基因（昆虫激素和酶基因、BT杀 虫基因、神经毒素基因、增效基因、植物来源基因）RNA干扰 修饰或缺失病毒基因（egt、gp64、p10）异源病毒重组,三、研究展望 亲本病毒完整性；解决加快杀虫速度和发挥病毒农药传播快、效果久之间的 矛盾；增效基因和多种病毒基因同时转入病毒；改善重组病毒剂型。,