初级检验士考试微生物学检验讲义第二十七章病毒感染的实验诊断.docx

1、初级检验士考试微生物学检验讲义第二十七章病毒感染的实验诊断病毒感染的实验诊断 考点病毒的生物学性状病毒的实验室检查方法常见病毒的感染【内容讲解】第一节概述一类非细胞型微生物，个体极小，可通过细菌滤器，需用电子显微镜观察。仅含一种核酸作为遗传物质，外被蛋白质衣壳或还有包膜。病毒只能在活细胞内寄生，以复制的方式进行增殖。在临床微生物感染中，近75%的传染病是由病毒引起的。一、病毒的基本性状（一）形态结构1.大小和形状：大小：测量单位用纳米表示，一般在20-300nm之间。形态大致可分为：球形或近似球形、杆状、弹形、砖形、蝌蚪形等。2.结构（二）病毒的增殖病毒必须依赖宿主细胞，以特殊的自我复制方式进

2、行增殖。病毒的复制周期：吸附、穿入、脱壳、生物合成、组装与成熟、释放6个阶段。异常增殖：顿挫感染：病毒进入细胞后的环境不利于它的复制，不能合成本身的成分或不能组装和释放有感染性的病毒颗粒。缺陷病毒：由于病毒基因组不完整或基因位点改变而不能进行正常增殖的病毒。干扰现象：当两种不同的病毒或两株性质不同的同种病毒，同时或先后感染同一细胞或机体时，可发生一种病毒抑制另一种病毒增殖的现象。（三）噬菌体以细菌、真菌等为宿主，能引起细菌等裂解的病毒。噬菌体特异性识别细菌表面受体，可用于进行细菌的鉴定与分型。噬菌体感染细菌后产生两种后果：溶菌周期和溶源性周期。（四）非寻常病毒比病毒更小更简单的致病因子，又称为

3、亚病毒因子，包括类病毒、卫星病毒和朊粒等。朊粒个体微小，不含核酸，其主要成分是一种蛋白酶抗性蛋白，对各种理化作用的抵抗力强，具有传染性，是引起传染性海绵状脑病的病原体。朊粒致中枢神经系统退化性病变，引起牛海绵状脑病（疯牛病）。克雅病（CJD）和Kuru病被认为与朊粒感染有关。二、病毒的分类与命名科、属、种3级或科、亚科、属、种4级。DNA病毒、RNA病毒、DNA和RNA逆转录病毒三大类。按传播途径可分为呼吸道病毒、胃肠炎病毒、经性传播感染的病毒等。按感染部位与症状特征可分为肝炎病毒、出血性热病毒、疱疹病毒等。第二节病毒感染的实验诊断病毒学实验室诊断有三个方面：直接检测和分离鉴定；检测病毒蛋白抗

4、原成分和核酸；检测抗体。一、标本采集、运送及处理（一）标本采集1.采样时机：应在病人急性期或发病初期采集标本。2.标本种类：根据不同病毒感染采集不同标本，如鼻咽分泌物、脑脊液、血液、粪便等。（二）标本的运送及保存 快速传递，立即处理和接种。采集和运送过程注意冷藏。如不能立即处理和接种，可在4保存数小时，长时间保存需置-70。（三）标本处理凝固的血液需先离心，得到的血清可以用于病毒分离。肝素抗凝全血、脑脊液、胸腔液、水痘液以及尿液均可直接用于病毒分离培养。有些标本如粪便等,常需粗提、提纯和浓缩等复杂处理过程。二、分离培养与鉴定（一）分离培养1.组织培养包括器官培养、组织块培养和细胞培养。目前常用

5、的方法是细胞培养；常用细胞：原代和次代细胞培养；二倍体细胞株；传代细胞系。2.鸡胚接种一般选用9-12日龄鸡胚。鸡胚中的部位适宜病毒卵黄囊嗜神经病毒，如乙型脑炎病毒羊膜腔流感病毒尿囊腔流感病毒、腮腺炎病毒，还可制备疫苗和大量病毒抗原绒毛尿囊膜天花病毒、单纯疱疹病毒脑内狂犬病病毒3.动物接种实验室常用新生小鼠或乳鼠进行病毒分离。（二）病毒鉴定1.初步鉴定根据临床症状、流行病学特点、标本来源、易感动物范围、细胞病变特征及生物学特征、理化性质可初步判断病毒的科及属。2.最终鉴定在初步鉴定的基础上，选择适当的血清学方法对病毒分离株进行最后鉴定，常用中和试验、补体结合试验、血凝抑制试验、免疫荧光试验、酶

6、免疫试验等。分子生物学方法也在病毒鉴定方面得到应用。初步鉴定（举例）：细胞病变效应（CPE）：细胞形态变化病毒细胞圆缩，分散，不聚集，全部细胞被破坏肠道病毒细胞肿大，颗粒增多，病变细胞聚集呈葡萄状腺病毒细胞融合成多核细胞副粘病毒，疱疹病毒空泡状，多核巨细胞麻疹病毒脂溶剂敏感实验：有包膜（+），无包膜（-）；耐酸实验：肠道病毒（R），鼻病毒（S）。三、病毒感染的诊断（一）显微镜检查1.用光学显微镜直接检查病毒包涵体。可作为病毒感染的辅助诊断，不是特异性试验。核内包涵体：常见DNA病毒。如巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒和腺病毒等。胞浆内包涵体：常见RNA病毒。如呼吸道合胞病毒、狂犬病

7、病毒和痘类病毒等。胞质内和胞核内包涵体：麻疹病毒等。2.用电子显微镜直接检查病毒颗粒。数小时即可从病毒形态上作出明确的鉴别诊断。应用免疫电镜灵敏度更高。（二）病毒抗原检查利用特异性免疫血清检测标本中的病毒抗原。常用方法有：免疫荧光技术、酶免疫技术、放射免疫法、反相间接血凝和对流免疫电泳等方法。对于一些血清型别不多或在一般细胞培养系统中尚不能成功增殖的病毒，直接检测病毒抗原是快速而实用的方法。（三）病毒抗体检查利用特异性抗原检测病毒感染者血清中的IgM和IgG抗体。常用的方法有中和试验、补体结合试验、血凝抑制试验及免疫扩散等，还可以利用放射免疫法及酶联免疫吸附法。IgM抗体出现在病毒感染的早期，

8、所以标本采集时间对检测结果的影响很大。IgG抗体检测需采集感染急性期与恢复期双份血清，恢复期IgG效价必须比急性期增高4倍或4倍以上时，才有诊断意义。（四）病毒核酸检测利用核酸杂交和PCR技术检测病毒特异基因片段。检出病毒核酸并不等于检出具有传染性的病毒颗粒。第三节各类病毒感染的简介一、呼吸道病毒六、疱疹病毒二、肠道病毒七、肝炎病毒三、急性胃肠炎病毒八、反转录病毒四、黄病毒九、狂犬病病毒五、出血热病毒十、人乳头瘤病毒一、呼吸道病毒（一）流行性感冒病毒（二）呼吸道合胞病毒（三）麻疹病毒（四）风疹病毒（一）流行性感冒病毒1.生物学性状（1）形态：具有多形性，一般为球形或丝状，丝状多见于新分离株，感

9、染性较强。（2）结构：（2）分型与变异1）分型：根据核蛋白抗原和M蛋白的不同，将流感病毒分为甲（A）、乙（B）、丙（C）型；甲型流感病毒根据NA和HA的抗原性不同又分为若干亚型。2）变异：变异的物质基础是HA和NA。抗原变异幅度小时称为抗原漂移；变异幅度大形成新的亚型，引起大规模流行，为抗原转变。（3）培养特性：常用鸡胚接种培养，初次分离接种羊膜腔为最佳，传代适应后可移种尿囊腔。细胞培养一般用原代猴肾细胞（PMK）或犬肾传代细胞（MDCK）。利用红细胞凝集试验确定病毒的存在。（4）抵抗力：不耐热，对干燥、日光、紫外线以及甲醛、乙醇等均敏感。2.微生物检验（1）标本采集和处理：在发病急性期，以前

10、3天为最好。采集鼻腔洗液、咽拭子、鼻拭子等，置于Hanks液中。放入冰壶中，速送实验室。若48小时内未能进行接种，标本应放于低温中保存。（2）分离培养与鉴定：标本接种于鸡胚羊膜腔，353天后，收集羊水和尿囊液进行血凝试验并测定滴度。血凝阳性者，用已知抗体作血凝抑制试验进行鉴定。若血凝阴性时，需用鸡胚盲传12次，仍不出现血凝阳性者，方可判断病毒分离阴性。也可接种原代猴肾细胞（PMK）或犬肾传代细胞（MDCK）。（3）快速诊断1）免疫荧光技术和酶免疫技术。2）分子杂交技术。3）PCR技术。4）免疫电镜技术。（4）血清学诊断：需同时检测急性期（5天以内）和恢复期（24周）血清，在相同条件下进行血凝抑

11、制试验，如恢复期抗体效价比急性期高4倍或4倍以上即有诊断意义。3.临床意义病毒随飞沫传播进入易感者呼吸道，依靠血凝素与黏膜柱状上皮细胞相应受体结合，感染细胞。主要在呼吸道柱状上皮细胞内复制增殖，很少入血，但代谢毒素样物质可进入血流引起发热、头痛和全身酸痛。甲型流感可以是散发，也可以是全球性大流行。乙型流感的播散速度及范围不如甲型。（二）呼吸道合胞病毒1.生物学性状：属副粘病毒科、肺病毒亚科、肺病毒属。球形，具有多形性。核酸为单负股RNA，不分节段。包膜上有两种刺突：G蛋白作用于类似于流感病毒的血凝素蛋白HA； F蛋白是融合蛋白，介导病毒穿入和细胞融合。2.微生物学检查（1）标本采集和处理：可采

12、用鼻腔洗液或鼻咽拭子，置转运培养基中冷藏（4）运送至实验室，尽可能立即接种。（2）分离培养与鉴定：不能在鸡胚中增殖，可在人类上皮细胞传代细胞系内增殖。培养后37天，细胞病变为合胞体形成即细胞融合成多核巨细胞，胞质内形成嗜酸性包涵体。（3）直接检测病毒抗原：可利用免疫荧光技术和酶免疫技术。（4）血清学诊断：常用中和试验、免疫荧光试验和酶免疫试验检查血清中IgG、IgM及IgA。中和试验需双份血清，检测IgG滴度变化。检测患者IgM、IgA可进行早期诊断。3.临床意义：最常见的传播途径是经飞沫传染。引起婴幼儿下呼吸道疾病的最常见的病毒。最易引起婴幼儿细支气管炎和细支气管肺炎，若不及时处理，死亡率较

13、高；较大儿童和成人主要引起上呼吸道感染。（三）麻疹病毒1.生物学性状：属副粘病毒科、麻疹病毒属。球形，核心为单负链RNA，三种衣壳蛋白（L、P、N），外被包膜，包膜内面为M蛋白，包膜表面有血凝素（H蛋白）和融合蛋白（F）。H蛋白与细胞表面病毒受体CD46结合，感染宿主。病毒抵抗力不强，对阳光和一般消毒剂敏感。2.微生物学检查（1）标本采集：在病人急性期内采集标本，如鼻咽拭子、鼻咽吸取物、痰等。（2）直接检测病毒：感染细胞产生细胞融合和多核巨细胞，胞质和胞核内有嗜酸性包涵体。电镜或免疫电镜检查病毒颗粒。免疫荧光技术及酶免疫技术，如EIA进行病毒抗原检测。PCR技术或核酸探针进行鉴定。（3）病毒分

14、离：接种传代细胞系HeLa、Vero以及原代人胚肾细胞等。镜下观察是否有细胞病变出现。（4）血清学诊断：双份血清作补体结合试验，酶免疫测定及血凝抑制试验等。用ELISA法检测血清特异性IgM可协助诊断。3.临床意义：麻疹是儿童时期最常见的急性呼吸道传染病。通过飞沫直接传播，冬春季易发。侵入上呼吸道和眼结膜上皮细胞内增殖，通过局部淋巴组织入血，出现第一次病毒血症，病毒随血流侵入全身淋巴组织和单核吞噬细胞系统增殖，再次入血形成第二次病毒血症，并感染眼结膜、皮肤、口腔黏膜、呼吸道、消化道、血管。远期并发症是亚急性硬化性全脑炎（SSPE）。（四）风疹病毒1.生物学性状：球形，核心为单正链RNA，外被包

15、膜，包膜表面有血凝素。能在绿猴肾、兔肾和人胚肾细胞内增殖。抵抗力不强，不耐热，对脂溶剂敏感，紫外线能灭活病毒。2.微生物学检查（1）标本采集：在早期采集标本，如咽拭子、皮疹液、尿液以及死亡婴儿的各种脏器等。（2）直接检测病毒：利用PCR技术或核酸探针进行鉴定。（3）病毒分离与鉴定：接种非洲绿猴肾Vero以及原代人胚肾细胞等。镜下观察是否有细胞病变出现。用酶标或荧光素标记的单克隆抗体进行病毒鉴定。（4）血清学诊断：双份血清作血凝抑制试验等。用ELISA法检测血清特异性IgM可协助诊断。患儿出生时血清中有抗风疹病毒IgM抗体和从母体获得的IgG抗体，或宫内羊水中有IgM抗体可判定为先天性风疹综合征

16、。3.临床意义：风疹是儿童时期常见的传染病。风疹是全身麻疹样出疹伴耳后及枕下淋巴结肿大为特征的急性呼吸道传染病。病毒在局部淋巴结增殖后，通过病毒血症播撒全身。大多数情况下，属于一过性和无明显临床症状的感染。孕妇在妊娠早期感染病毒，经胎盘垂直传播感染胎儿，可引起先天性风疹综合征。胎儿出生后患先天性心脏病、耳聋、失明、智力障碍等。二、肠道病毒肠道病毒属小RNA病毒科肠道病毒属。由粪-口途径传播。主要包括脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒和一些新肠道病毒。（一）生物学性状无包膜，由简单的病毒衣壳和单股正链RNA组成。能在猴肾、人胚肾、人羊膜细胞、HEP-2、HeLa细胞中增殖。对外界抵抗力较强，在

17、污水及粪便中可生存数月。对酸及乙醚稳定，对紫外线、干燥及热敏感，5630分钟可灭活。（二）微生物学检查1.标本的采集与处理：合理采集相应标本，如脑脊液、血液、尿液、直肠拭子、咽喉拭子、鼻腔洗液等，将液体标本置无菌试管内立即送检。2.直接检测病毒：电镜检查及酶免疫法均可直接检测肠道病毒。PCR在肠道病毒检测方面更具优势。3.病毒分离：猴细胞系对脊髓灰质炎病毒，B组柯萨奇病毒和ECH0病毒具有良好的敏感性。人类二倍体成纤维细胞适合于A组柯萨奇病毒的分离。4.病毒鉴定：中和试验进行病毒鉴定，此为鉴定的标准方法。PCR及免疫荧光法进行快速鉴定。5.血清学诊断：常用方法有中和试验、补体结合试验、及血凝抑

18、制试验。三种试验只有中和试验较特异，但操作繁琐。（三）临床意义肠道病毒虽然以感染胃肠道作为开始，但却很少引起胃肠道疾病。病毒的靶器官以神经系统、肌肉和其他系统为主。在粪便中有肠道病毒排出时，多数病人往往无任何症状。中枢神经系统、血液、眼结膜分泌物和泌尿生殖道等部位的标本中检出肠道病毒，就意味着真正的病毒侵入。肠道病毒疾病脊髓灰质炎病毒损害脊髓前角运动神经细胞，导致脊髓灰质炎即小儿麻痹症柯萨奇病毒以幼年儿童最常见，极少数患者出现无菌性脑膜炎和轻瘫等症状。可引起心肌炎和心包炎、急性结膜炎等。ECH0病毒以幼年儿童最常见，极少数患者出现无菌性脑膜炎和轻瘫等症状。肠道病毒71型导致手足口病、无菌性脑膜

19、炎等，目前尚无有效的疫苗。三、急性胃肠炎病毒轮状病毒1.生物学性状：球形，核心含双链RNA，外被双层衣壳，内层核衣壳的壳粒呈放射状排列，电镜下犹如车轮状外形。常用的细胞为原代猴肾细胞和传代猴肾细胞。病毒抵抗力强，耐酸碱，耐乙醚。5630分钟可灭活。可被消毒剂灭活。2.微生物检验（1）标本采集与处理：发病早期采集腹泻粪便，密封送检。（2）标本直接检查：1）电镜和免疫电镜检查2）抗原检测常用ELISA法、胶乳凝集试验3）病毒RNA聚丙烯酰胺凝胶电泳分析用于病毒分型4）检测核酸（3）分离培养3.临床意义：轮状病毒是引起婴幼儿急性腹泻的主要病因。在发展中国家发病率高。其发病和婴幼儿病死率仅次于呼吸道感

20、染。A组感染引起婴幼儿急性胃肠炎，感染以温带地区的秋冬季为主。B组引起成人腹泻，无明显季节性。四、黄病毒一大群通过吸血的节肢动物而传播疾病的病毒。（一）流行性乙型脑炎病毒1.生物学性状：基因组为单正链RNA。结构蛋白有三种：M、C和E。M位于包膜内面，C在衣壳中，E是镶嵌在包膜上的糖蛋白，组成血凝素。最易感染的动物为出生23天的乳鼠，经脑内接种后35天即可发病。在地鼠肾，幼猪肾等原代培养细胞内增殖，并引起明显的细胞病变。抗原性稳定，很少变异。2.微生物学检查（1）标本直接检查：免疫荧光技术及酶免疫技术进行病毒抗原检测。PCR技术或核酸探针检测核酸。（2）分离培养与鉴定：接种乳鼠脑内，或原代金色

21、地鼠肾细胞等培养细胞。根据细胞病变、红细胞吸附试验证实病毒的增殖，阳性即可传代或鉴定。（3）血清学诊断：可以利用血凝抑制、补体结合试验等进行血清学诊断。3.临床意义：猪为最重要的宿主和传染源。通过三带喙库蚊叮咬传播，引起流行性乙型脑炎。夏秋季节流行。人感染后，绝大多数表现为隐性或轻型感染。只有少数发生脑炎。病毒侵入脑组织内增殖，造成脑实质病变，表现为高热、惊厥或昏迷症状。五、出血热病毒（一）汉坦病毒1.生物学性状：圆形、椭圆形或多形性。单负股RNA，有长、中、短三片段。在人肺传代细胞（A549），非洲绿猴肾细胞（Vero-E6），人胚肺二倍体细胞（2BS）及地鼠肾细胞中增殖，不引起明显的细胞病

22、变。中和试验可将世界各地分离的汉坦病毒分成6个血清型。对脂溶剂敏感，对酸抵抗力弱，601小时可被灭活。2.微生物学检查（1）病毒分离与抗原检测：常用Vero-E6细胞、A549细胞分离病毒。免疫荧光抗体染色检查细胞胞浆内的病毒抗原。（2）血清学诊断：免疫荧光染色，检查病人血清中的特异性IgM或IgG抗体。ELISA检测特异性IgM适用于早期诊断。3.临床意义：引起肾综合征出血热（HFRS）。侵入人体后约有2周的潜伏期，可引起流行性出血热，起病急，典型临床表现为高热、出血和肾损害。伴有三痛（头痛、眼眶痛、腰痛）及红（面、颈、上胸部潮红）。眼结膜、咽部及软腭充血。软腭、液下、前胸等处有出血点。六、

23、疱疹病毒（一）单纯疱疹病毒（HSV）（二）水痘-带状疱疹病毒（三）巨细胞病毒（四）EB病毒（一）单纯疱疹病毒（HSV）1.生物学性状：有包膜的DNA病毒，基因组由两个互相连接的长片段（L）和短片段（S）组成，为双股线状DNA。在多种细胞内增殖，如原代兔肾、人胚肺、人胚肾细胞或地鼠肾细胞等。细胞被感染后很快发生病变。如细胞肿胀、变圆、出现嗜酸性核内包涵体。有两种血清型，HSV-1和HSV-2。2.微生物学检查（1）标本采集和处理；采集水疱液、唾液、尿液、血液、脑脊液、阴道或宫颈拭子标本应立即接种敏感细胞培养液，如果不能则将标本置于转运培养基，快速送检。（2）直接检查病毒：免疫电镜检查病毒颗粒或病

24、变细胞。姬姆萨染色，在光学显微镜下检查多核巨细胞和胞核内嗜酸性包涵体。直接免疫荧光法或酶免疫法进行病毒抗原检测。（3）分离及鉴定：病毒分离培养是HSV感染实验室诊断的最敏感的方法，HSV-1和HSV-2在细胞培养中均可出现明显的细胞病变。利用单克隆抗体进行确定HSV分离株的型别。（4）分子生物学诊断；核酸杂交技术或PCR技术可检测出HSV。（5）血清学诊断：ELISA或胶乳凝集试验可检测HSV抗体，但难以区分两型的感染。无助于早期诊断及指导抗病毒治疗。3.临床意义：通过直接密切接触和性接触传播，也可经飞沫及垂直传播。HSV-1感染常局限在口咽部，通过唾液或呼吸道分泌物传播，引起口咽部疱疹、疱疹

25、性角结膜炎、脑炎等。多见于半岁以后的婴幼儿，大多数呈隐性感染。HSV-2的原发感染多见于青春期以后的患者，主要通过生殖道途径传播，主要表现为生殖器疱疹。（二）水痘-带状疱疹病毒（VZV）1.生物学性状：与HSV相似，为线状双股DNA病毒。只有一个血清型。一般实验动物及鸡胚对VZV均不敏感。能在人胚二倍体肾细胞（HFDK）或人胚二倍体肺细胞（HFDL）培养中增殖。受感染的细胞出现嗜酸性核内包涵体和多核巨细胞。2.微生物学检查（1）直接检测病毒或抗原：直接或间接免疫荧光法检测病变细胞内的VZV抗原，有助于快速诊断。免疫电镜检查，可对VZV感染进行特异性诊断。核酸杂交或PCR技术亦可检出疱疹液中的V

26、ZV。（2）病毒分离：取水痘内容物（要求4天以内的内容物） 接种人胚肾或人胚肺细胞。多数情况下37天可出现细胞病变效应。（3）鉴定：根据典型细胞病变效应进行初步鉴定；利用标记的抗VZV的单克隆抗体进行直接荧光抗体染色，进行特异性鉴定。（4）血清学诊断：EIA已成为VZV血清学诊断的主要方法。3.临床意义：VZV可引起水痘和带状疱疹。水痘为原发感染引起，主要发生于儿童，儿童初次感染VZV大约有两周的潜伏期，然后皮肤出现斑疹、水疱疹，可进一步发展为脓疱疹并伴有发热。带状疱疹为复发感染所致，多发生于成人和老人。（三）巨细胞病毒1.生物学性状：形态与基因组结构与HSV极为相似。种属特异性高，即人CMV

27、（HCMV）只能感染人。只能在人成纤维细胞中才能增殖，增殖缓慢。细胞病变特点为肿胀、核变大形成巨大细胞，核内有致密的嗜碱性包涵体，形似猫头鹰眼特征。加热5630分钟，低pH、乙醚、紫外线、反复冻融均能使CMV灭活。2.微生物检验（1）标本采集：病毒分离可采取患者尿液、口腔拭子、外周血白细胞等。血清学诊断可采取患者血清。（2）直接检查病毒：HE等染色观察巨大细胞和细胞核内的包涵体。免疫荧光技术和酶免疫技术检查标本中的HCMV抗原。核酸杂交或PCR技术检测HCMV的核酸。3.临床意义通过多种途径传播。有先天性或获得性细胞免疫缺陷的儿童或成人，如艾滋病及器官移植患者，CMV感染很常见。（1）正常人感染：常呈隐性感染，少数出现传染性单核细胞增多症。（2）免疫功能缺损的个体的感染：致的间质性肺炎是骨髓移植受者的首位死因。AIDS患者HCMV感染以肺、中枢神经系统和胃肠道感染最为常见。（3）先天性和围生期感染1）先天感染：母体发生CMV感染，经胎盘传至胎儿引起宫内感染。2）产时感染：与产道中的病毒相接触被感染。3）产后感染：与排病毒的个体密切接触而获得。（四）EB病毒1.生物学性状病毒颗粒为球形。不能用常规的疱疹病毒培养方法进行培养。一般用人脐血淋巴细胞或从外周血分离的B淋巴细胞培养。根据