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1、分子生物学试验技术第五章 分子生物学实验技术实验21 大鼠肝组织DNA的提取及其含量测定【原理】 DNA以核蛋白形式存在于细胞中，制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。DNA的提取方法较多，根据实验用途可简可繁。这里介绍一种经济简便不用蛋白酶K提取真核细胞DNA的方法。在DNA抽提缓冲液中，加入SDS可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离；加入EDTA可抑制DNase活性，减少DNA降解。分离出来的DNA用酚/氯仿抽提除去蛋白质，接着用氯仿抽提以除去DNA溶液中微量酚的污染，最后用无水乙醇沉淀DNA。260nm处DNA有最大吸收峰，利用该原理

2、测DNA的A260，可计算其浓度。【试剂】1生理盐水。2TE缓冲液(pH8.0) 含10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，1mmol/L EDTA-Na2(pH8.0)，以103.4Kpa高压蒸汽灭菌，4贮存。310% SDS 固体SDS 10g，加双蒸水70ml于42水浴溶解，用双蒸水定容至100ml。4Tris-HCl饱和重蒸酚(pH8.0) 将市售的苯酚置于65水浴中溶解，用空气冷凝管进行重蒸馏，当温度升高至183时开始收集于数个棕色瓶中(每瓶约200ml)，贮存于20可保存数年。使用前取一瓶重蒸酚于室温放置一段时间后，移至65水浴融化(冰箱取出后勿立即放入65水浴中，以防玻

3、璃炸裂)。融化后加8-羟基喹啉至终浓度为0.1%(w/v)，溶解混匀，此时溶液呈黄色，小心将酚倒入分液漏斗中。加入等体积的1mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，立即加盖，剧烈振荡并加入固体Tris摇匀(一般加1g固体Tris/100ml酚)。静置分层后从分液漏斗中放出下层黄色酚相，弃上层。将酚重新加至分液漏斗中，加入等体积的含0.2%-巯基乙醇的0.1mol/L Tris-HCl(pH8.0)，剧烈振荡，直至酚相pH7.8，将酚装入棕色试剂瓶中，加入0.1倍酚体积的含0.2%-巯基乙醇的0.1mol/L Tris-HCl(pH8.0)覆盖酚相，置4贮存备用。由于酚重蒸和平衡费时，操作

4、有一定危险，因此也可直接从试剂公司购买Tris-HCl饱和重蒸酚。5氯仿/异戊醇(24:1，v:v) 均为分析纯。610 mol/L 醋酸铵。7无水乙醇(AR)。810mg/ml RNase A 称取RNase A 10mg溶于10mmol/L Tris-HCl(pH7.5)、15mmol/L NaCl中，于100加热煮沸15min灭活DNase，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于20。如为Sigma公司产品，一般则不需加热煮沸。【操作步骤】1迅速处死大鼠，立即取出肝脏约1g，用冷生理盐水洗去附着的血液，滤纸吸干后放入玻璃匀浆器，加入5ml冷TE缓冲液制备匀浆。2取1ml匀浆液倒入小试管中，加入

5、10%SDS溶液0.1ml，颠倒混匀后，室温10min，溶液变粘稠。3取饱和酚0.5ml，氯仿：异戊醇(24：1)0.5ml，混合后加入上述溶液中，充分混匀，室温放置10min，其间不断摇动保持溶液呈乳状，3 000r/min离心10min。4小心取出上层水相至小试管中，加入等体积氯仿：异戊醇(24：1)，混匀，3 000r/min，离心5min。5小心取出上层水相转移到新试管，加入0.3倍水相体积的10mol/L 醋酸铵，2.5倍水相体积的无水乙醇充分混匀，纤维状DNA即从溶液中析出。6用吸管小心取出纤维状DNA，转移到1.5ml离心管，3 000r/min，离心5min，小心倒去溶液，用滤

6、纸吸干。7加1ml蒸馏水和5l 浓度为10mg/ml的RNase A溶解DNA沉淀，室温放置20min。如DNA难于溶解，可置于56水浴2030min，并不断摇动，直至溶解。8DNA的含量测定：取0.5ml DNA样品和蒸馏水3.5ml至石英杯中，用蒸馏水调零，在752紫外分光光度计上测A260值和A280值。【计算】 1DNA浓度(g/ml)A260nm5040.5 2A260nm/A280nm比值【注意事项】1剧烈振荡可使DNA断裂，因此操作中不能用电动振荡器混匀。2如要得到高纯度DNA，可加入蛋白酶K降解蛋白质。3根据DNA在260nm处有一吸收峰，而蛋白质在280nm处有一吸收峰的原理

7、，可测定A260nm/A280nm比值检测DNA的纯度，该比值接近1.82.0表示蛋白质污染极少。4制备重蒸酚和平衡酚过程中应戴手套，防止灼烧皮肤。附：外周血细胞DNA的快速提取【原理】 从全血制备白细胞DNA可用非离子去污剂NP40和低盐缓冲液直接破裂血中红细胞和白细胞的细胞膜，释出血红蛋白及细胞核，通过离心获得白细胞的细胞核，向核悬液中加入SDS破裂核膜，并使DNA从核蛋白中解离，溶解在一定浓度的NaCl中，经乙醇沉淀即可得到DNA。缓冲液中Mg2+的浓度对于获得完整的高分子量DNA十分重要，本实验低盐缓冲液中Mg2+浓度是4mmol/L，如超过10mmol/L可导致DNA的降解。缓冲液中

8、的EDTA可抑制DNA的降解。【操作步骤】1取0.5ml外周血置于1.5ml Eppendorf(EP)管中，EDTA-Na2抗凝(每管预先加入0.3mol/L EDTA-Na2 30l)，3 000r/min离心5min，弃血浆，得沉淀部分。2加0.5ml低盐缓冲液(10mmol/L Tris-HCl，pH7.6，10mmol/L KCl，4mmol/L MgCl2，2mmol/L EDTA)，12.5l的20% NP40，振荡破碎红细胞，5 000r/min离心5min，弃上清。3用低盐缓冲液洗白细胞2次(每次5 000r/min离心5min)，弃上清。4加入250l低盐缓冲液，20l的1

9、0%SDS，混匀，50水浴温育10min。5加入100l饱和NaCl(称取4g氯化钠，溶于10ml蒸馏水中即成)，剧烈振荡2min，4，12 000r/min离心10min。6 吸上清于另一干净EP管中，加入1ml预冷的无水乙醇沉淀DNA，12 000r/min离心2min，弃上清。7加1ml预冷的70%乙醇洗涤DNA 2次，12 000r/min离心2min，弃上清，将EP管倒置于滤纸上，室温干燥。8加250l TE缓冲液溶解DNA，紫外定量，4冰箱保存备用。【评价】 本实验可在不到1h内快速提取高质量未降解的全血DNA。实验提取的全血DNA贮存在室温或37温育24h与冻存在70的DNA质量

10、一样，但DNA反复冻融4次以上可导致部分降解。本实验可用于提取少至10l全血样品(可获得340ng左右DNA)或干燥的血液样品，因此本实验适用范围较广。实验22 碱裂解法从大肠杆菌中制备质粒DNA从大肠杆菌细胞中分离质粒DNA的方法众多，其分离的依据可根据分子大小不同、碱基组成的差异以及质粒DNA的超螺旋共价闭合环状结构的特点进行。目前常用的有碱裂解法(又称碱变性抽提法)、羟基磷灰石柱层析法、质粒DNA释放法、酸酚法、两相法以及溴化乙锭-氯化铯密度梯度离心法。以上方法各有利弊。但总结多数实验室的实践经验，认为碱裂解法效果良好，经济且收率较高，是一种使用最广泛的制备质粒DNA的方法，也是当今分子

11、生物学研究中的常规方法。制备的质粒DNA可用于酶切、连接、转化以及PCR等。【原理】 碱裂解分离质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。当细胞在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与染色体DNA发生变性，加入醋酸钾中和液，进行离心后，它们随细胞碎片沉淀下来，而变性的质粒DNA又恢复到原来的构型留在上清中，再经酚/氯仿抽提乙醇沉淀等步骤获得质粒DNA。质粒DNA的存在形式有3种：共价闭环DNA，常以超螺旋形式存在；开环DNA，此种质粒DNA两条链中有一条发生一处或多处断裂；线性DNA，因质粒DNA的两条链在同一处断裂而造成。在电泳时同一质粒DNA的3种形式泳动

12、速度：超螺旋线性开环。【试剂】1菌种 含pBR322或其他质粒DNA的大肠杆菌工程菌如HB101，DH5，JM109等，如实验后需直接酶切制备的质粒DNA，可选用科研工作中用EcoR非定向克隆构建的重组质粒DNA转化的大肠杆菌。2LB液体培养基 称取胰蛋白胨3.0g，酵母提取物1.5g，NaCl 3.0g，加双蒸水200ml溶解，用5mol/L NaOH调至pH7.4，定容至300ml，转移至三角烧瓶中，以103.4Kpa高压灭菌20min。310mg/ml氨苄青霉素(Amp)溶液 在无菌条件下配制，20贮存备用。4含Amp的LB固体培养基 每100ml LB培养液在临高压灭菌前加入1.5g琼

13、脂，以103.4KPa高压灭菌20min，溶液尚未完全冷却时，即应取出培养基，并轻轻摇动以使琼脂均匀分布于整个培养基中。必须小心，此时培养基溶液可能过热，旋动液体会发生暴沸。应使培养基降温至50(用手背碰一下瓶壁不致烫手)，方可加入Amp，按每100ml培养基加10mg/ml Amp溶液1ml，使其终浓度为100g/ml，然后在超净台上铺平板，90mm直径的培养皿约需25ml培养基。5Tris-HCl饱和酚(pH8.0)与TE缓冲液 同实验21。6溶液 含50mmol/L葡萄糖，10mmol/ EDTA-Na2，25mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，临用前加溶菌酶至2mg/ml。7

14、溶液 含200mmol/L NaOH，10g/L SDS，临用前用两种溶液的贮存液配制。8溶液 5mol/L醋酸钾溶液60ml(称取29.4g醋酸钾定容至60ml)，冰醋酸11.5ml和双蒸水28.5ml混合而成。910mg/ml RNase A 同实验21。1050TAE 电泳缓冲液 取Tris24.2g，冰醋酸5.7ml，0.25mol/L EDTA(pH8.0)20ml，加蒸馏水至100ml。1TAE为配制琼脂糖凝胶及其电泳的应用缓冲液。11溴酚蓝指示剂溶液(6上样缓冲液) 称取溴酚蓝100mg，加双蒸水5ml，在室温下过夜，待溶解后再称取蔗糖25g，加双蒸水溶解后移入溴酚蓝溶液中，摇匀

15、后定容至50ml，加入NaOH 1滴，调至蓝色。121 mg/ml 溴化乙锭(EB) 戴手套谨慎称取EB 20mg于棕色试剂瓶中，加20ml双蒸水，溶解后贮于4备用，配制琼脂糖凝胶时每100ml凝胶加50l EB。13DNA分子量标准 根据需要购买，一般浓度为0.5g/l。13其他试剂 氯仿、异丙醇、无水乙醇、琼脂糖、异戊醇。【操作步骤】1用接种环挑取1环冷冻保存的含质粒DNA大肠杆菌工程菌，划线接种于含有Amp的LB固体培养基平板上，37倒置培养约12h(过夜)。2用接种针或消毒牙签挑取单菌落于盛有2 ml LB液体培养基(含100g/ml Amp)的试管中，37摇荡培养过夜。3将菌液收集在

16、1.5ml的EP管中，10 000r/min离心2min，弃上清，将离心管倒置于一纸巾上，以使所有液体流出。4在沉淀中加入溶液 100l，涡旋混匀，静置5min。5加入新鲜配制的溶液 200l，颠倒数次，轻轻混匀，冰浴510min(溶液变透明，粘稠)。6加入溶液150l，颠倒混匀，冰浴510min(溶液出现白色沉淀)。712 000r/min离心2min，将上清转移至另一EP管中。8加等体积酚抽提1次，12 000r/min离心2min，取上层水相转移至另一EP管。9加等体积氯仿/异戊醇(24：1，v/v)抽提1次，12 000r/min离心2min，取上层水相转移至另一EP管。10加入2倍体

17、积无水乙醇振荡混匀，于室温放置2min沉淀DNA。12 000r/min，离心5min，弃乙醇。 11用70%乙醇洗涤沉淀，12 000r/min，离心5min，弃乙醇，室温下静置使乙醇挥发或真空干燥。 12用50l含RNase A的TE缓冲液溶解DNA沉淀，振荡，室温放置20min。 13制备琼脂糖凝胶 按照被分离DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量，见表5-1。表5-1 琼脂糖凝胶浓度与分辨DNA大小范围的关系凝胶中的琼脂糖含量%(w/v) 线性DNA分子的有效分离范围(kb) 0.3 560 0.6 120 0.7 0.810 0.9 0.57 1.2 0.46 1.5 0.23 2

18、.0 0.12称取0.8g琼脂糖倒入三角瓶中，加入1TAE缓冲液100ml，置微波炉或水浴加热至完全熔化，取出摇匀，稍冷却后加50l EB染色液，摇匀。14灌胶(1) 取洁净的电泳内槽(又称托盘)，用橡皮膏或透明胶带将内槽的两端边缘封好(一定要封严，不能留缝隙)。(2) 将内槽放置于一水平台面，并插好所需齿数和厚度的样品梳子。(3) 将冷却至60左右的琼脂糖凝胶液，缓慢倒入内槽，直至所需厚度，注意不要形成气泡，特别是梳子下，如有气泡可用牙签挑破。(4) 待胶凝固后，小心取出梳子，撕去橡皮膏或透明胶带，将带凝胶的内槽放入电泳槽中，注意凝胶点样端要靠近负极。(5) 加入1TAE缓冲液至电泳槽，缓冲

19、液刚没过凝胶表面即可。15加样 剪取适当大小的蜡膜(Parafilm膜)，取6上样缓冲液1l点于膜上数点，取5l质粒DNA和2l DNA分子标准(约1g)分别与上样缓冲液混匀，将其分别加入凝胶的点样孔(记录点样顺序及点样量)。16电泳 接通电源槽与电泳仪的电源(检查正负极，DNA片段是从负极向正极移动)。DNA的迁移率与电压成正比，电压不超过5V/cm凝胶长度。当溴酚蓝染料移动至凝胶前沿12cm处，切断电源，停止电泳。17观察结果 取出内槽，在紫外分析仪的玻璃平板上小心推出凝胶，通过防护屏或戴防护眼镜观察紫外灯透射的结果，DNA存在处应显出桔红色荧光条带，一般可观察到2种或3种质粒形式。【注意

20、事项】1应先在实验前2天划线接种细菌，实验前1天晚上进行单菌落液体培养，并注意无菌操作。2加入溶液时可用力振荡，而加入溶液5min后，如溶液不变粘稠(用移液嘴沾吸没有丝状物出现)，则应终止实验。检查使用的试剂是否正确，加量是否正确。3溶液中的溶菌酶宜临用前加入。溶液也应临用前用母液配制。4琼脂糖凝胶的配制可安排在真空干燥和RNase A处理的实验间隙，为便于电泳后直接可观察结果，EB可在琼脂糖加热熔化至灌胶前加入。因此整个电泳过程均应戴手套操作。5EB是DNA的诱变剂，亦是极强的致癌物，配制和使用过程中要小心，操作时一定要戴手套，用过的手套要及时把手套顺手翻过来，让污染有EB的面朝里，有EB的

21、废液和器皿要分别处理好。附：一步法提取质粒DNA小规模快速制备质粒DNA是筛选大批重组质粒的阳性克隆的一个不可缺少的步骤，常规经典的方法是碱裂解法。通过该方法制备出来的质粒DNA 既可进行琼脂糖凝胶电泳，也可进行限制性酶切分析。但该方法在一次筛选数十个克隆时就显得操作步骤烦琐，费时较多。这里介绍一种经本人改良的简便快速的质粒DNA制备方法见：刘新光，刘文，梁念慈. 一种快速可靠的小量制备质粒DNA的方法. 基础医学与临床，1998，18(5)：396，可作为今后科研中大量筛选时使用。本方法较经典的碱裂解法省去了碱裂解和乙醇沉淀与洗涤步骤，直接用酚/氯仿一步抽提，十分简单实用。【操作步骤】1收获

22、1.5ml过夜培养菌液于1.5ml EP管中，在12 000r/min离心10s。2弃去培养液并尽量吸干(使用微量台式真空泵较方便)，加入50l TE缓冲液(pH8.0)，用涡旋混合器振荡以悬浮细胞。3用1ml玻璃刻量吸量管吸取酚/氯仿(1:1)混合液1ml，每个EP管加入50l，在涡旋混合器上振荡10s后，以12 000r/min 离心5min。4小心取出40l上清至另一个1.5ml EP管中，加入RNase A至终浓度50g/ml，室温放置5min。5取5l质粒溶液(与1l 6上样缓冲液混合)进行0.6%1%琼脂糖凝胶电泳，并以空载体DNA作对照，根据电泳结果即可判断有无外源DNA插入。6

23、取适当量可能含重组载体的质粒溶液进行限制性酶切分析。实验23 PCR扩增目的DNA【原理】 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)类似于DNA的天然复制过程，是一种体外扩增特异性DNA的技术。PCR是在模板DNA、两条寡核苷酸引物和4种脱氧核苷三磷酸(dNTP)存在的条件下，耐热的Taq DNA聚合酶催化的酶促反应。PCR反应的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。反应分3步：变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA。退火：当温度突然降低时，由于模板分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物和其

24、互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA双链之间互补的机会较少。延伸：Taq DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应，以上3步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，数小时之后，介于两个引物之间的特异性DNA片段可大量复制，数量可达21067拷贝。本实验不设计特定引物，各实验室可充分利用科研用不完的引物开展本实验。一旦一对引物序列确定，PCR扩增长度也就确定。【试剂】1Taq DNA聚合酶 国产或进口酶，浓度为5 U/l，均配有相应的缓冲液和MgCl2。210扩增缓冲液 含500mmol/L KCl，100mmol/L Tris-HCl(pH9.0于室温)，1% Trit

25、on X-100。325mmol/L MgCl2 此为应用液浓度的10倍，配套供应。4dNTP 为4种脱氧核苷三磷酸的混合液，有商品出售，一般浓度为各2.5或10mmol/L。5上游引物或下游引物 引物的正确设计是PCR反应成功扩增的一个关键条件，必须遵循一定的原则，最好在引物设计时有计算机辅助分析。设计好后国内有关公司可代理合成，按要求用灭菌三蒸水或去离子水溶解配制成25mol/L，分装，20冻存备用。6DNA模板 实验21提取的大鼠组织DNA或人白细胞基因组DNA(配成约1g/l浓度)；或纯化的重组质粒DNA(配成2ng/l)。7灭菌轻矿物油或石蜡油：视PCR仪器的型号决定是否需要。8琼脂

26、糖凝胶电泳所需试剂(琼脂糖、电泳缓冲液和上样缓冲液)：见实验22。9DNA分子量标准：国产或进口产品，可根据扩增带的大小选择。【操作步骤】1 按以下顺序，用微量移液器将各成分分别加入在0.2ml或0.5ml灭菌薄壁离心管中。试剂加样量最终浓度10扩增缓冲液5l1扩增缓冲液25mmol/LMgCl25l2.5mmol/L2.5或10mmol/LdNTP4或1l0.2mmol/LdNTP25mol/L上游引物1l25pmol(0.5mol/L)25mol/L下游引物1l25pmol(0.5mol/L)基因组DNA或质粒DNA5l5g或10ngTaq DNA聚合酶0.2l1U灭菌三蒸水29l或32l

27、反应总体积50l加盖，用手指轻弹离心管底部，使溶液混匀，在台式离心机中离心2秒以集中溶液于管底，加灭菌轻矿物油或石蜡油50l封住溶液表面，防止溶液的蒸发(如是2400，9600或9700型PCR仪则不需加)。2视预实验的条件，按以下参数在PCR仪上进行扩增2535个循环。一般PCR反应的参数为：94变性1min; 55退火1min; 72延伸1min; 其中第1个循环94变性5min，最后一个循环72延伸10min。3取5l PCR产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察有否有预定大小的DNA片段。【注意事项】 由于PCR具有超敏感性的特点，极微量的污染便可导致假阳性结果。污染可能来自样品

28、污染、扩增试剂仪器污染和扩增产物交叉污染等。其主要预防措施有：1工作区隔离 分样品处理区和PCR扩增分析区。2试剂取样及分装 要用绝对安全无污染的器皿；对于大包装的试剂用前应分成小包装。3注意实验操作 操作时要戴手套，如有污染要及时更换；离心管每次开盖前要离心片刻，开盖要小心，防止液体溅出；常用预混试剂应先加试剂，后加DNA模板；吸每种试剂均要换移液嘴(tip)，在临床检测实验室中吸试剂用的移液器还要与吸DNA模板的移液器要分开。4在临床检测时每次PCR均同时设阳性对照、阴性对照和弱阳性对照。5污染处理 稀酸处理法：常用稀酸处理含有扩增产物的离心管，琼脂糖凝胶和电泳槽及电泳托盘等；紫外线照射P

29、CR工作室，特别是电泳槽、电泳托盘、离心机、冰盒、移液器等。实验24 DNA限制性图谱的绘制-DNA的限制性内切酶酶切分析【原理】 限制性内切酶(restriction endonuclease，RE)是由细菌自己产生的能识别双链DNA分子中的特定碱基顺序，并以内切方式水解核酸中的磷酸二酯键的核酸水解酶。它可分为三种类型：、和型，型酶就是通常所指的RE，能识别双链DNA的特异顺序，并在这个顺序内进行切割。它是基因工程中剪切DNA分子的常用工具酶，被誉为分子生物学家的手术刀。临床上某些遗传病是由于基因的缺失或插入或突变所致，可造成RE酶切位点的改变，故当用一定的RE切割时，其切开的片段(分子量)

30、大小与正常人发生差异，即DNA限制性图谱发生改变，据此可达到基因诊断的目的。本实验选用价格低廉、酶切效果好的EcoR(识别位点GAATTC)对DNA进行酶切，观察RE的特定切割作用及其限制性图谱，理论上可产生分子量分别为21 226bp，7 421bp，5 804bp，5 604bp，4 878bp和3 530bp片段。或选用实验22制备的EcoR非定向克隆构建的重组质粒DNA作为EcoR酶切底物，产生载体与插入片段2个片段。【试剂】1DNA、实验21制备的基因组DNA或实验22制备的EcoR非定向克隆构建的重组质粒DNA。2DNA分子量标准。3限制性内切酶EcoR及其缓冲液(只需购买国内试剂

31、公司的产品即可，每种RE均配有2种缓冲液，在配套的缓冲液中该RE均可获得100%酶切活性)。4电泳缓冲液、琼脂糖、溴酚蓝指示剂及EB同实验22。【操作步骤】1将下列试剂 缓冲液2l，DNA(5g)或基因组DNA(5g)或质粒DNA样品(1g)，EcoR510U加至0.5ml EP管中，加双蒸水至20l ，加盖，混匀后稍离心，37水浴反应1h。2取5l酶切后的样品，0.51g未酶切DNA或基因组DNA或质粒DNA，DNA分子量标准(均要与上样缓冲液混合)进行0.8%的琼脂糖凝胶电泳(EB已预先加入琼脂糖凝胶中)，在紫外检测仪上观察结果。3在镜头前加一块红色滤光片，使用100黑白胶卷，利用透射紫外光作光源，光圈2.8，曝光0.52s，调准焦距，可拍摄质量较好的凝胶照片。有条件则使用DNA一次成像仪。【注意事