补肾益气中药对小鼠围着床期子宫内膜形态结构及PR表达的影响.docx

1、补肾益气中药对小鼠围着床期子宫内膜形态结构及PR表达的影响补肾益气中药对小鼠围着床期子宫内膜形态结构及PR表达的影响（作者:_单位: _邮编: _） 作者：刘艳娟 黄光英 杨明炜 陆付耳 【摘要】 目的探讨补肾益气中药改善胚泡着床障碍小鼠着床期子宫内膜微环境的机制。方法于妊娠第4天9AM利用米非司酮建立胚泡着床障碍小鼠模型，予补肾益气中药进行干预，于妊娠第4天9PM处死小鼠，观察子宫内膜形态学变化，采用免疫组化技术及Western blot技术检测子宫PR的表达。结果与正常组相比，模型组子宫内膜发育不良，中药组子宫内膜的发育与正常组相似；中药组子宫内膜腺体、间质、腔上皮细胞PR表达范围和强度及

2、PR蛋白的表达均较模型组显著增高，子宫PR蛋白的表达较模型组显著增高，与正常组无显著差异；结论补肾益气中药通过改善子宫内膜发育,调节胚泡着床障碍小鼠子宫组织PR蛋白的表达，改善子宫内膜着床微环境，利于胚泡着床。 【关键词】 补肾益气中药；子宫内膜着床微环境；孕激素受体Abstract: Objective To explore effect of Bushen Yiqi Recipe（BSR）on endometrial micro environment in embryo implantation dysfunction mice(EID). Methods Mice model of E

3、ID induced by mifepristone at 9AM on day 4 of pregnancy (Pd4) were intervened with BSR, and sacrificed at 9PM on Pd4. The structure of endometrium was observed by light microscope. The endometrial PR expressions were assessed by immunnohistochemical SP method and western blot. Results Endometrial mo

4、rphology showed endometrial development retardation in model group ，while endometrial development in treatment group was significantly improved and nearly similar to control group. Levels of PR in the BSR treated group were significantly higher than those in the model group respectively, and showed

5、insignificant differences from those in the normal control group. Conclusion BSR could improve the embryo implantation by way of regulating development of endometrium and the levels of PR expression in mice with EID.Key words： Bushen Yiqi Recipe; endometrial implantation microenvironment; progestero

6、ne receptor不孕症的发生率约占育龄妇女的15%，尽管人工助孕技术（IVF ET）治疗不孕症已获得较大的成功，但其妊娠率仍较低。胚泡着床障碍是导致IVF ET临床妊娠率低的主要原因之一，子宫内膜着床微环境是影响胚泡着床的主要原因之一1。因此，改善子宫内膜着床微环境，提高着床率是提高人工助孕技术孕育成功率的关键。 补肾益气中药由桑寄生、黄芪、丹参等药组成，具有补肝肾、益气血之功效。前期研究已观察到，在妊娠早期，补肾益气中药能提高胚泡着床障碍小鼠的胚泡着床率2。其配合IVF ET治疗不孕症，可提高胚泡移植的成功率3。为探讨补肾益气中药促进胚泡着床的作用机制，本实验拟通过观察补肾益气中药对胚

7、泡着床障碍小鼠围着床期，子宫内膜形态结构、子宫孕激素受体（progesterone receptor，PR）的表达，进一步阐述补肾益气中药对围着床期子宫内膜着床微环境的影响。1 材料与方法1.1 实验动物清洁级性成熟期、雌性未孕昆明小鼠，体重3035g，雄性小鼠40g左右，由湖北省卫生防疫站实验动物中心提供，合格证号：医动字第19-082号。1.2 实验药物及试剂补肾益气中药由同济医院中西医结合研究所中药制剂室提供，由桑寄生、黄芪、丹参等组成，采用水煎醇沉工艺制成144%无菌煎济，分装于无菌小瓶中，-20冰箱保存。将米非司酮片剂（北京第三制药厂生产）研碎，溶解于丙二醇（国产分析纯）中，配制成0

8、.8mg/ml浓度。SP免疫组化试剂盒、ECL试剂盒为MBI公司产品；PR多克隆抗体为Santa Cruze 公司产品。1.3 动物分组及处理将雌(324g)、雄(404g)小鼠分笼适应性饲养3d后，于每日以雌雄2:1的比例合笼，次日8:00检查雌鼠阴道，发现阴栓计为妊娠第1天（pd1）。将孕鼠随机分为正常组、模型组和中药组，每组各6只。于妊娠第4天（Pd4）9：00皮下注射米非司酮0.03mg/kg体重建立胚泡着床障碍模型，正常组皮下注射等量丙二醇溶剂。于妊娠第4天21:00，颈椎脱臼法处死小鼠，迅速剖腹，取出子宫，用于光镜检测、免疫组化及Western blot分析。1.4 光镜观察小鼠子

9、宫内膜形态结构子宫标本用100ml/L福尔马林固定，石蜡包埋切片，HE染色，制作组织切片，光镜观察子宫内膜腺上皮细胞、间质细胞的变化；选用同批染色切片，每张切片在光镜下（40）随机取5个不同的视野，以每张切片染色的背景作对照，经HPIAS 1000病理图文分析系统（同济医学院千屏音像公司）分析，分别测定并计算子宫内膜腺体面积、腺腔面积、腺上皮细胞面积及宫腔上皮厚度。1.5 小鼠子宫PR免疫组化分析将子宫标本制作石蜡切片，采用过氧化物酶标记的链霉卵白素免疫组化法（SP法）染色，检测子宫内膜PR的表达。按照试剂提供的实验步骤进行操作。免疫组化分析结果判断：PR的阳性表达为细胞质呈棕黄色，主要位于子

10、宫内膜腺体、间质细胞内。选用同批染色切片，每张切片在光镜下（40）随机取5个不同的视野，以每张切片染色的背景作对照，经HPIAS 1000病理图文分析系统分析，分别测定并计算子宫内膜腺体、间质、腔上皮细胞的阳性信号所占的各自面积比和平均光度，表示阳性信号的表达范围和表达强度。以PBS代替抗做阴性对照。1.6 小鼠子宫组织PR蛋白含量检测采用Western blot法。将子宫组织用细胞裂解液裂解细胞，离心后取上清，用Lowry法测定蛋白浓度。各取50g蛋白经SDS PAGE电泳后转移至PVDF膜，浸入封闭液过夜,再分别进行抗原抗体反应。用ECL显色后，利用VDS图像分析系统扫描定量，得出光密度值

11、，计算每克子宫组织蛋白的相对含量。 1.7 统计方法实验数据用xs表示，经SPSS 11.0软件处理，组间比较采用F检验和q检验。2 结果2.1 补肾益气中药对小鼠子宫内膜组织形态结构的影响光镜下观察：与正常组相比，模型组宫腔上皮厚度变薄，基质和腺体发育不同步，腺体以增殖期改变为主，腺体小而直，数目少，呈单层立方上皮，可见核下空泡，但大部分腺上皮分泌活动不明显；间质以分泌期样改变为主，疏松、水肿，部分间质致密。腺体和间质的改变提示着床前两者的发育不同步。中药组子宫内膜发育较模型组有明显改善，接近或达到正常组子宫内膜的发育水平，表现为子宫内膜蜕膜化，或腺体与间质发育同步：腺腔扩张，分泌物多，可见

12、核下空泡，间质蜕膜样变，间质细胞核分裂相多见(见图1)。 图像分析结果见表1，可见模型组内膜腺上皮、腺体、腺腔面积均减少，子宫内膜变薄，提示模型组子宫内膜发育不良。而中药组内膜腺上皮、腺体、腺腔面积均较模型组有明显增强，提示中药组子宫内膜发育改善。表1 补肾益气中药对小鼠子宫内膜组织形态结构的影响（略） 2.2 补肾益气中药对小鼠子宫内膜PR表达的影响PR免疫反应为棕黄色颗粒，主要位于细胞胞核内。各组子宫内膜腺上皮细胞、间质细胞、腔上皮细胞的细胞核内均可见棕黄色颗粒，阴性对照片细胞核内未见棕黄色颗粒。中药组腺体、间质及腔上皮细胞PR阳性信号的表达范围和表达强度均显著高于模型组（P0.05），与

13、正常组无显著性差异（P0.05），而模型组PR阳性信号的表达范围和表达强度均显著低于正常组（见图2），图象分析结果见表2。表2 补肾益气中药对小鼠子宫内膜PR表达的影响（略） 2.3 补肾益气中药对小鼠子宫PR蛋白表达的影响膜显色后出现单一清晰的条带，分子量为81KD，表明子宫组织中有PR表达。模型组PR蛋白含量显著低于正常组和中药组（P0.05），而中药组的PR蛋白含量与正常组无显著性差异（P0.05）。其分析结果见表3。表3 补肾益气中药对小鼠子宫PR蛋白表达的影响（略）3 讨论 胚泡着床是子宫内膜与胚泡相互作用的过程,子宫内膜只在特定的时期才接受发育良好的胚泡着床，此时，子宫内膜在雌孕激

14、素的作用下，发生一系列与胚泡发育同步的有利于胚泡着床的形态结构变化，构成良好的着床微环境，使胚泡顺利着床。这些变化包括：内膜增厚，腺体分泌旺盛，间质细胞蜕膜化，血液供应丰富4。当子宫内膜发育阶段与相应的形态学变化一致时，胚泡可顺利着床；若子宫内膜发育落后于相应的形态学变化，则不适和于胚泡着床而致不孕。 孕激素受体（PR）是一种核受体，多在子宫内膜腺上皮细胞和内膜间质细胞核内表达，在月经周期中呈周期性变化，在增生晚期最高，分泌晚期最低。PR在胚泡着床过程中起着重要的作用。PR敲除小鼠子宫内膜间质细胞不能蜕膜化，胚泡着床障碍；若将野生型小鼠的胚泡移入PR敲除假孕鼠的子宫，胚泡也不能着床5。PR可通

15、过影响降钙素、双调蛋白、Hoxa 10等一系列着床必须因子的适时分泌，最终引起内膜一系列形态结构变化，使围着床期子宫内膜微环境适合于胚泡着床6 7。临床研究也发现子宫内膜PR低下者子宫内膜发育不良，胚泡着床受阻，导致不孕8。本研究所见，模型组子宫内膜腺上皮细胞、间质细胞中PR含量降低，内膜不能及时对孕激素的变化做出相应的反应，导致子宫内膜发育滞后，继而影响子宫内膜着床微环境，使胚泡难以着床，这与临床所见是一致的。 中医理论认为不孕症乃肾、天癸、冲任、子宫的功能失调所致。肾虚，失于温煦气化，则天癸不充，冲任二脉失养，胞脉不利，气机失统，血行淤滞于胞宫而胎元不固。补肾益气中药由桑寄生、丹参、黄芪等

16、组成，补肝肾益气血，可改善子宫内膜的发育，有利于着床微环境。前期实验研究表明，补肾益气中药能提高胚泡着床障碍小鼠的胚泡着床率2；能显著改善孕鼠血液流变学及红细胞的生物物理特性，影响子宫微循环9；配合IVF ET治疗不孕症，可提高不孕妇女胚泡移植的成功率3。本实验进一步证实补肾益气中药能显著促进子宫内膜的发育，提高胚泡着床障碍小鼠子宫组织PR的表达，这可能是补肾益气中药改善子宫内膜着床微环境，促进着床的机制之一，这也为中西医结合治疗不孕症提供了实验依据。【参考文献】 1张明扬，李国光，蔡鸿德，等.不孕症及生殖内分泌学M.第二版.北京:北京大学医学出版社,2005:123. 2刘艳娟，黄光英，陆付

17、耳，等.健胎液对胚泡着床障碍小鼠胚泡着床作用的研究J.上海中医药杂志，2004，38(4):46 48. 3张明敏，黄光英，陆付耳，等.补肾益气活血汤对多次助孕技术失败患者结局的影响J.微循环学杂志，2002，12（2）：10 13. 4史小林.人类生殖学M.北京：科学出版社，2002：62. 5Conneely OM, Mulac Jericevic B, Lydon JP, et al. Reproductive functions of the progesterone receptor isoforms: lessons from knock out miceJ. Molecular

18、and Cellular Endocrinology. 2001，179(1 2)：97 103. 6霍立军，杨增明.孕酮调节的胚胎着床相关分子及其作用J.中华妇产科杂志，2002，37（8）：505 507. 7戴林，沈浣，虞有智，等.不孕患者子宫内膜孕激素受体研究J.中华病理学杂志，2000, 29 (3):184 186. 8Lim H, Ma L, Ma WG, et al. Hoxa 10 regulates uterine stromal cell responsiveness to progesterone during implantation and decidualization in the mouseJ. Mol Endocrinol,1999, 13(6):1005 17. 9黄光英，韩庆红，徐珉，等.健胎液对IUGR孕鼠红细胞膜Na+,K+ATPase, Ca2+,Mg2+ATPase作用的研究J.中国中西医结合杂志，1998,18(特集):346 348. 基金项目：国家自然科学基金资助（No：30171193），湖北省卫生厅基金资助（No：JX2B11）