RTPCR实验步骤.docx

1、RTPCR实验步骤RT-PCR实验步骤RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。要求：1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。2. RT按要求做，一般不会出太大问题。3. PCR，按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须在RT时，引物设计有3种方法即a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和c：特异的下游引物。如果用a和b方法，是扩增的所有的cDNA（理论上）

2、，还要用此产物做PCR 的模板继续扩增。如果用c方法，那么要去那里查它的序列呢？http:/www.ncbi.nlm.nih.gov问题：在做RT-PCR遇到一怪现象，即对同一动物不同组织扩增同一段基因，结果从一种组织中可以扩出我的目的基因，条带非常的好，而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带，尝试其他条件同样无法得到满意的结果，百思不得其解！（注：已肯定该基因在两种组织中都表达，且内参照在两种组织都可扩增出来）从这两种组织中提取的RNA的量是不一样的，我测过吸光度，差异还很大，会不会和这有关呢？ 请高手指教！解答：1.RT-PCR有两种做法：条件具备的话可用kit进行一步法进行；若

3、条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。但后来发现两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我推测是体系更加单一比较利于PCR的进行，当然也可能是我买的kit不太好。（promega）。2.RT-PCR应具备的条件高质量的RNA（保留后可做5，3RACE）；引物的（最好产物短点）；若涉及粗略定量的话还应考虑RNA的浓度或是cDNA的浓度（如果由内标分子更好，但我发现其实很不容易将RNA的浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样）；体系的均一性等。3.RACE我做过RACE（3RACE是宝生物的Kit；5RACE是Gibico），但现在再进行另一个同源基因的3RACE时却怎么也P不出来，这

4、两个基因是由同一对引物扩增出来的，其中一个已经获得了全序列（RACE的方法），而另一个基因的3UTR却增么也扩不出来，我推测是不是该基因的3UTR太长的缘故，我都快绿了，有无RT-PCR的常用内标bactin 和GAPDH的使用有选择性吗？比如不同的细胞，不同的刺激。有关内参：RT-PCR内参照可以在一个管子里做（那样也是图好看一些），最好分开两管，把除了引物之外的mixture统一配，拍照后，算目的基因和内参的比值，这就是基因表达的相对浓度。问：我曾经作过同一管的PCR，内有actin 和目的基因引物。虽然可见到两条均一条带但图片质量不理想（而且酶量、Mg2+加倍）。请教mxbdna2003

5、 ，你是如何处理同一管的PCR的各成分的浓度？答： it should determined the amount of RNA. but it not for the quantitity of the PCR. it just was convienent to guess the amount ot the template(for RT and PCR) and bettrer for publication and editor if he don not know the preocedure much. but the amount just using accurate pip

6、tte is wrong. it shoud be remembered to do the inner control of housekeeping gene everytime.在同一管中做RT，其实没有什么问题，不需要taq魅加量，taq酶就像你用某一种东西的数量去概括，因该选那种多的东西，说一座房子是由2000块砖造成的，比说又29根梁更准确吧。更不要说没有看家基因不看家的缺点，因为他是服务于整个基因组表达谱什么的。PE有专门的用于实时PCR的内参试剂盒，就是用18s，不过我们看懂使用的那条序列，不知有没有人用过，告知其序列和genbank号。正好问一下，我查了一些序列，一直没有去合

7、成，主要是因为手上的actin的荧光探针还没有完，当初和成了一堆。有那位高手用过18s的内参，请问您的序列（我指的是模板的序列）？原位杂交最好用RNA做探针，效果好一些，反正你有钱卖roche的盒子，而且量也能保证，因为转录过程嘛，沿着一条线突突地跑就是了。正义反义也容易理清。我觉得做RT-PCR的方法和条件及应注意的事项就是那么几条,许多专业书都有详细的描述,但是许多人还是历经多次磨难，有时就是得不出结果。因此，我认为因为每个人所要克隆的片断不同，引物不同等，因此对不同的人来说还是有他自己的特殊性,我的以下经历说明：做实验时各人的情况不同,做不出时还是要好好动一下脑子。记得我开始我的PCR时

8、，按常规方法，提取总后，首先用自己设计的下游引物进行逆转录，不断改变反应条件，进行了次均没有结果。后来考虑到本人的克隆的PCR的片断位于我们实验另一位同学克隆的片断当中，而该同学已经用RT-PCR克隆出她的片断（尽管她用这些产物做模版再进行时也没办法重复出她的产物），因此，我先用她的引物和条件扩增出她的片断，然后用她的产物作模板（有点改进，逆转录反应换用了mers随机引物），用我的引进物进行一般PCR，终于得到我的产物，测序结果完全正确。尽管我的这个经历别人很人遇到，但足可以说明实验可以有自己的模式，书本的知识和别人的经验很重要，但有时也不定要受到书本框框和别人经验的限制请问：1 引物的特异退

9、火温度怎样设定？可以根据gc 和at含量算出吗？可以用引物报告单上的Tm值吗？2 PCR时20微升体系中cDNA应加多少比较合适？MgCl2应加多少？各个成分的量有无确定标准？3 PCR结果跑电泳，actin有，但跑不出目的条带，有几种原因？与cDNA的量少有关吗？Mg离子太多是否会抑制Taqase的活性？一般来说引物报告单伤得是对的,也可以自己算,实际上重要的各条引物一致,剩下的可以摸的.20中是指体积还是量?只要不明显改变体系的离子强度,加1,2ul都可以的.mg要调的,但我总觉得没有书里讲的那么玄乎,我都是常年不变的.如果内参照有,目的没有,至少证明不是美丽惹的祸.原因书里应该都说了.在

10、所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。由于RNA酶广泛存在而稳定，一般反应不需要辅助因子。因而RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解，而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果，所以RNA的制备与分析操作难度极大。在实验中，一方面要严格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。在其它分子生物学实验中使用的RNA酶也会造成污染。这些外源性

11、的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。一、 防止RNA酶污染的措施1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180的高温下干烤6hr或更长时间。2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。3. 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。4. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用D

12、EPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22m滤膜过滤除菌。5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。6. 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。二、常用的RNA酶抑制剂1. 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。2. 异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。3. 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几

13、乎能完全抑制RNA酶的活性。4. RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。5. 其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。mRNA的分离与纯化真核细胞的mRNA分子最显著的结构特征是具有5端帽子结构（m7G）和3端的Poly(A)尾巴。绝大多数哺乳类动物细胞mRNA的3端存在20-30个腺苷酸组成的Poly（A）尾，通常用Poly（A+）表示。这种结构为真核mRNA的提取，提供了极为方便的选择性标志，寡聚（dT）纤维素或寡聚（U）琼脂糖亲合层析分离纯化mRNA的理论

14、基础就在于此。mRNA的分离方法较多，其中以寡聚（dT）-纤维素柱层析法最为有效，已成为常规方法。此法利用mRNA 3末端含有Poly（A+）的特点，在RNA流经寡聚（dT）纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被洗脱，经过两次寡聚（dT）纤维柱后，即可得到较高纯度的mRNA。寡聚(dT)纤维素柱纯化mRNA一、试剂准备13M醋酸钠（pH 5.2）20.1M NaOH31上样缓冲液：20mM Tris-HCl(pH 7.6)；0.5M NaCl；1M EDTA（pH 8.0）；0.1%SLS(十二烷基氨酸钠。配制

15、时可先配制Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA（pH 8.0）的母液，经高压消毒后按各成分确切含量，经混合后再高压消毒，冷却至65时，加入经65温育（30min）的10%SLS至终浓度为0.1%。4洗脱缓冲液：10mM Tris-HCl(pH 7.6)；1mM EDTA(pH 8.0)；0.05% SDS5无水乙醇、70%乙醇6DEPC二、操作步骤1将0.5-1.0g寡聚（dT）-纤维悬浮于0.1M的NaOH溶液中。2用DEPC处理的1ml注射器或适当的吸管，将寡聚（dT）-纤维素装柱0.5-1ml，用3倍柱床体积的DEPC H2O洗柱。3使用1上样缓冲液洗柱，直至洗出液pH值

16、小于8.0。4将RNA溶解于DEPC H2O中，在65中温育10min左右，冷却至室温后加入等体2上样缓冲液，混匀后上柱，立即收集流出液。当RNA上样液全部进入柱床后，再用1上样缓冲液洗柱，继续收集流出液。5将所有流出液于65加热5min，冷却至室温后再次上柱，收集流出液。6用5-10倍柱床体积的1上样缓冲液洗柱，每管1ml分部收集，OD260测定RNA含量。前部分收集管中流出液的OD260值很高，其内含物为无Poly(A)尾的RNA。后部分收集管中流出液的OD260值很低或无吸收。7用2-3倍柱容积的洗脱缓冲液洗脱Poly(A+)RNA，分部收集，每部分为1/3-1/2柱体积。8OD260测

17、定Poly(A+)RNA分布，合并含Poly(A+)RNA的收集管，加入1/10体积3M NaAc（pH5.2）、2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀，-20放置30min。94离心，10000g15min，小心吸弃上清。用70%乙醇洗涤沉淀。注意：此时Poly(A+)RNA的沉淀往往看不到。4离心，10000g5min，弃上清，室温晾干。10. 用适量的DEPC H2O溶解RNA。三、注意事项1整个实验过程必须防止Rnase的污染。2步骤（4）中将RNA溶液置65中温育然后冷却至室温再上样的目的有两个，一个是破坏RNA的二级结构，尤其是mRNA Poly(A+)尾处的二级结构，使Poly(A+)

18、尾充分暴露，从而提高Poly(A+)RNA的回收率；另一个目的是能解离mRNA与rRNA的结合，否则会导致rRNA的污染。所以此步骤不能省略。3十二烷基肌氨酸钠盐在18以下溶解度下降，会阻碍柱内液体流动，若室温低于18最好用LiCl替代NaCl。4寡聚（dT）-纤维素柱可在4贮存，反复使用。每次使用前应该依次用NaOH、灭菌 ddH2O、上样缓冲液洗柱。5一般而言，107哺乳动物培养细胞能提取1-5g Poly(A+)RNA，约相当于上柱总RNA量的1%-2%。RNA酶保护试验(RNase Protection Assay,RPA)是通过液相杂交的方式,用反义RNA探针与样品杂交，以检测RNA

19、表达的技术。与Northern杂交和RT-PCR比较，RPA有以下几个优点：1 检测灵敏度比Northern杂交高。由于Northern杂交步骤中转膜和洗膜都将造成样品和探针的损失，使灵敏度下降，而RPA将所有杂交体系进行电泳，故损失小，提高了灵敏度。2 由于PCR扩增过程中效率不均一和反应“平台”问题，基于PCR产物量进行分析所得数据的可靠性将下降，而RPA没有扩增过程，因此，分析的数据真实性较高。3 由于与反义RNA探针杂交的样品RNA仅为该RNA分子的部分片段，因此，部分降解的RNA样品仍可进行分析。4 步骤较少，耗时短。与Northern杂交相比，省去了转膜和洗膜的过程。5 RNA-R

20、NA杂交体稳定性高，无探针自身复性问题，无须封闭。6 一个杂交体系中可同时进行多个探针杂交，无竞争性问题。7 检测分子长度可以任意设置，灵活性大。RPA的缺点是需要同位素标记探针。一、试剂准备1 GACU POOL：取100mM ATP、CTP、GTP各2.78l、100mM UTP 0.06l，加DEPC H2O至100l。2. 杂交缓冲液 IPES 0.134g、0.5M EDTA（pH8.0）20l、5M NaCl 0.8ml、甲酰胺8ml，加DEPC H2O至10ml。3. RNase消化液：5M NaCl 120l、1M Tris-HCl(pH7.4) 20l、0.5M EDTA（p

21、H8.0）20l、RNase A(10mg/ml) 8l、RNase T1(250U/l) 1l，加DEPC H2O至2ml二、操作步骤1反义RNA可由含T7或SP6启动子的重组质粒为模板制备，也可以用含启动子的PCR产物为模板制备，本文介绍后者。（1）设计含T7启动子的PCR引物由于PCR产物将作为合成反义RNA的模板，所以一对引物中的下游引物5-端要含T7启动子序列:T7启动子序列为：5-TAATACGACTCACTATAGGG引物设计的其他要求与一般PCR引物的设计相同。PCR产物的长度决定了反义RNA探针的长度，具体设计时可考虑100-400bp长。最好采用巢式PCR，即先扩增出一较长

22、的片段，再以该片段为模板扩增出较短的片段，以保证探针的特异性，如下图所示：上游引物下游引物 T7 启动子序列下游引物（2）PCR先用上游引物和下游引物进行PCR，再以PCR 产物为模板,用上游引物和下游引物-T7进行二次PCR(具体操作参见PCR章节)。（3）探针合成标记与纯化在0.5ml 离心管中加入下列试剂：RNasin （40U/l） 0.5lGACU POOL GAC（含GTP、CTP、ATP各2.75 mM,UTP 61M） 2l-32PUTP(10Ci/l) 2.5lDTT (二硫苏糖醇，0.1M) 1l5转录 buffer 2l模板（50ng/l） 1lT7 RNA 聚合酶 (1

23、5U) 1l混合后，短暂离心，37OC保温1hr。加入DNase（10U/l）1l, 37OC 15min, 然后75 OC 10min以灭活DNAse和T7 RNA 聚合酶。加入：饱和酚 50l氯仿 50l酵母tRNA（2g/l） 4lDEPC H2O 100l室温下充分混匀，离心10000g2min。取上层液置另一0.5 ml离心管中，加入100l氯仿，混匀，离心10000g2min。将上层液转移至另一0.5ml 离心管中，再加入3M NaAc 10l、预冷无水乙醇250l，混匀后，-20OC静置30min。4OC离心13500g10min。弃上清液，沉淀用75%乙醇100l洗涤，4OC离

24、心13500g2min, 弃上清液。室温下挥发残留乙醇。加入50l杂交缓冲液溶解沉淀，4OC下保存待用。可用尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测探针质量。（参见本节电泳步骤）。2杂交（1） RNA提取后溶解在杂交缓冲液中，浓度为1g/l。（2）取8l RNA加入1-3l探针（根据探针检测结果调整）于0.5ml 离心管中。（2） 80OC保温2min，然后40-45OC下杂交12-18hr。3. 消化(1) 杂交管于37 OC保温15min，加入RNase消化液，37 OC保温30min。(2) 加入10%SDS 10l、10g/l蛋白酶K 20l，混匀，37 OC保温10min。(3) 加入65l饱和

25、酚和65l氯仿，混匀，室温离心，10000g2min。(4) 转移上层液到另一0.5离心管中，加入10l酵母tRNA和3M NaAc 15l，再加入200l异丙醇，混匀后，置-20OC 30min，4 OC离心,135000g10min。(5) 弃上清液，室温下挥发乙醇，加入5-8l上样缓冲液溶解沉淀。4、电泳与放射自显影（1）配制凝胶：(50ml)40%丙烯酰胺-亚甲双丙烯酰胺（19：1） 6.25ml5TBE 10ml尿素 24g加H2O至50ml溶解后加入25%过硫酸胺50l，TEMED 50l，混匀，注入电泳槽中，插入梳，待胶凝固。（2）预电泳以1TBE为上下槽电泳缓冲液，加上电压后进

26、行预电泳，如果用测序电泳装置，电压应达2000v以上，功率设定为100w，温度设为50 OC。待胶板温度达50 OC时，暂停电泳，准备加样。（3）加样将已溶解在加样缓冲液中的样品80 OC加热2min，立即加样到胶孔中，电泳1-2hr。（电泳条件同预电泳）。（3） 电泳结束后，打开胶板，用滤纸取下胶，覆上一层保鲜膜，放置于暗盒中，暗室红光下，压上一张X片，盖上暗盒，-70OC曝光1-3天。暴光结束后，将X光片显影、定影、水洗、晾干。三、注意事项1本实验大部分为RNA操作，注意RNA酶的污染。2RNase消化液消化未杂交的单链RNA和探针RNA，当探针与样品之间有碱基错配时，错配位点也将被消化，

27、因此会产生片段较小的杂交片段。因此进行PCR时，采取尽量减少错配的措施。3、 同位素对RNA合成有一定影响，有时会产生非全长的探针。因此，标记时间不宜过长。4、 RNase消化液有时会产生过度消化而无检测信号，可以将消化液稀释10-100倍后使用。可能问题出在标本的保存：一般四小时之内就应处理，分离出细胞说的是套式PCR,可以在你的第一次PCR两个引物内,再设计一对引物进行第二次PCR就行了如果你的第一次PCR刚好包括目的片段,那只好设计个更长的了第二次的引物设计要求可以低一点以50l体系为例引物各1l第一次PCR产物5l二次PCR和巢式PCR，即设计两对引物进行扩增，不是一个概念，它是拿第一

28、次的PCR产物，稀释100-1000倍做模板，加入底物，从新进行扩增反应，以期增加产物的量我做RT-PCR时,提总RNA时,都是用灭菌DEPC水,按1:100稀释后测OD260和OD280,后根据公式:RNA浓度=OD260*稀释度/25(ug/ul),后用1mg total RNA分离mRNA.做逆转录及PCR,效果很好.luoyu10 wrote:各位大哥：我有一个问题请教，RT-PCR要求模板RNA的260nm/280nm的比值最低为多少，如果太低是不是会影响结果？最低到1.8，最好2.0，我感觉稍微低一点影响不算太大。问：我是的新手，想请教引物如何设计？好的引物所具有的令人满意的特点：

29、* 典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。* 选择GC含量为40到60或GC含量反映模板GC含量的引物。* 设计5端和中间区为G或C的引物。这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。* 避免引物对3末端存在互补序列，这会形成引物二聚体，抑制扩增。* 避免3末端富含GC。设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。* 避免3末端的错误配对。3端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。* 避免

30、存在可能会产生内部二级结构的序列，这会破坏引物退火稳定性。目的序列上并不存在的附加序列，如限制位点和启动子序列，可以加入到引物5端而不影响特异性。当计算引物Tm值时并不包括这些序列，但是应该对其进行互补性和内部二级结构的检测。有时候，仅有有限的序列信箱可供用于引物设计。比如，如果仅知道氨基酸序列，可以设计简并引物。简并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。为了增加特异性，可以参考密码子使用表，根据不同生物的碱基使用偏好，减少简并性。次黄嘌呤可以同所有的碱基配对，降低引物的退火温度。不要在引物的3端使用简并碱基，因为3端最后3个碱基的退火足以在错误位点起始PCR。使用较

31、高的引物浓度（1M到3M），因为许多简并混合物中的引物不是特异性针对目的模板。【经验】如何确认RNA的质量各位都知道，提取到质量良好的RNA（包括总RNA和mRNA，以下同）是非常困难，关于RNA的提取技术，我就不说了，为什么呢？或许各位非常关心呢，我是这样想的，我可以看到的资料或者是厂家的说明书，各位也同样可以看到的，内容当然都是一样的了，所以实验做的好不好，主要是心的投入多少的问题，所以希望大家自己多多思考啊！以下两种方法，相信大家都知道的：1）检测RNA溶液的吸光度280、320、230、260nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白等有机物的值。一般的，我们只看OD