生物化学实验.docx

1、生物化学实验生物化学实验生物化学实验细则 为了保证生物化学实验的顺利进行， 培养同学们掌握良好、 规范的生物化学基本实验技能， 特制定以下实验细则，请同学们严格遵守。 1. 实验前应提前预习实验指导书并复习相关知识。 2. 严格按照生物化学实验分组，分批进入实验室，不得迟到。非本实验组的同学不准进入实验室。 3. 进入实验室必须穿实验服。各位同学进入各自实验小组实验台后，保持安静，不得大声喧哗和嬉戏，不得无故离开本实验台随便走动。绝对禁止用实验仪器或药物嬉耍。 4. 实验中应保持实验台的整洁，废液倒入废液桶中，用过的滤纸放入垃圾桶中，禁止直接倒入水槽中或随地乱丢。 5. 实验中要注意节约药品与

2、试剂，爱护仪器，使用前应了解使用方法，使用时要严格遵守操作规程，不得擅自移动实验仪器。否则，因非实验性损坏，由损坏者赔还。 6. 使用水、火、电时，要做到人在使用，人走关水、断电、熄火。 7. 做完实验要清洗仪器、器皿，并放回原位，擦净桌面。 8. 实验后，要及时完成实验报告。实验记录和实验报告一、 实验记录实验课前应认真预习，将实验名称、目的和要求、原理、实验内容、操作方法和步骤等简单扼要地写在记录本上。实验中观察到的现象、结果和数据，应该及时地直接记在记录本上，绝对不可以用单片纸做记录或草稿。原始记录必须准确、简练、详尽、清楚。从实验课开始就应养成这种良好的习惯。记录时，应做到正确记录实验

3、结果、切忌夹杂主观因素，这是十分重要的。在实验条件下观察到的现象，应如实仔细地记录下来。在定量实验中观测的数据，如称量物的重量、滴定管的读数、光电比色计或分光光度计的读数等，都应设计一定的表格准确记下正确的读数，并根据仪器的精确度准确记录有效数字。例如，光密度值为0.050不应写成0.05。每一个结果最少要重复观测两次以上，当符合实验要求并确知仪器工作正常后再写在记录本上。实验记录上的每一个数字，都是反映每一次实验的测量结果，所以，重复观测时即使数据完全相同也应如实记录下来。数据的计算也应该写在记录本的另一页上，一般写在正式记录左边的一页。总之，实验的每个结果都应正确无遗漏地做好记录。实验中使

4、用仪器的类型、编号以及试剂的规格、化学式、分子量、准确的浓度等，都应记录清楚，以便总结实验时进行核对和作为查找成败原因的参考依据。如果发现记录的结果有怀疑、遗漏、丢失等，都必须重做实验。因为，将不可靠的结果当作正确的记录，在实际工作中可能造成难于估计的损失。所以，在学习期间就应一丝不苟，努力培养严谨的科学作风。二、 实验报告实验结束后，应及时整理总结实验结果，写出实验报告。实验报告的书写应使用黑色或蓝色钢笔或圆珠笔，可使用铅笔作图或用Excel电脑打印制作标准曲线。 在实验报告中，目的和要求、原理以及操作方法部分应简单扼要的叙述，但是对于实验条件（试剂配制及仪器）和操作的关键环节必须写清楚。对

5、于实验结果部分，应根据实验课的要求将一定实验条件下获得的实验结果和数据进行整理、归纳、分析和对比，并尽量总结成各种图表，如原始数据及其处理的表格、标准曲线图以及比较实验组与对照组实验结果的图表等。另外，还应针对实验结果进行必要的说明和分析。讨论部分可以包括：思考题；实验的正常结果和异常现象；关于实验方法（或操作技术）和有关实验的一些问题；对于实验设计的认识、体会和建议；对实验课的改进意见等（要针对实验操作方面内容，对于应付写缺少仪器设备的不给分）。实验报告规范格式：一、实验目的：5分二、实验原理: 15分三、实验步骤: 20分四、实验结果: 20分五、讨论分析: 30分六、改进实验建议: 10

6、分1糖类的颜色反应目的：应用糖的颜色反应鉴别糖类内容：Molisch反应、Seliwanoff反应2总糖和还原糖含量的测定目的：掌握样品中还原糖和总糖的提取和测定方法内容：总糖和还原糖的测定3总氮量的测定（凯氏定氮法）目的：掌握总氮含量测定的原理和技术内容：凯氏定氮法测定总氮4.Bradford法测定蛋白质浓度目的：掌握蛋白质浓度测定的原理和方法内容：Bradford法测定蛋白质浓度5氨基酸的分离鉴定（纸层析法）目的：掌握氨基酸的性质，纸层析法的基本原理及操作方法内容:氨基酸的纸层析6蛋白质的沉淀反应和等电点的测定目的：了解蛋白质的两性解离性质内容：蛋白质沉淀，等电点测定7肝细胞核中核酸的分离

7、和测定目的：掌握核酸的分离和测定方法内容：从肝细胞中分离核酸（DNA和RNA），并测定其含量8维生素C的定量测定目的：掌握维生素C的测定原理和方法内容：2,4-二硝基苯肼法测定维生素C9血液中转氨酶活性分析分光光度法目的：了解转氨酶的性质及临床意义。掌握谷丙转氨酶活力的测定方法。内容：酶活力测定10脂肪酸的-氧化目的：掌握脂肪酸的-氧化的过程及产物内容：脂肪酸-氧化的检测方法11蛋白质相对分子质量的测定目的：学会独立设计实验策略、摸索和设计样品处理等操作细节，并通过独立思考分析结果。内容：学生自行设计实验，在给定实验目的的前提下，使学生能够自行设计实验，掌握一种测定未知蛋白质的分子量的方法；

8、实验一 糖类的颜色反应一、实验目的1了解糖类某些颜色反应的原理。2学习应用糖的颜色反应鉴别糖类的方法。二、实验原理1.-萘酚反应（Molisch反应）原理糖在浓无机酸（硫酸、盐酸）作用下，脱水生成糠醛及糠醛衍生物，后者能与-萘酚生成紫红色物质。因为糠醛及糠醛衍生物对此反应均呈阳性，故此反应不是糖类的特异反应。2.间苯二酚反应（Seliwanoff反应）原理在酸作用下，酮糖脱水生成羟甲基糠醛，后者再与间苯二酚作用生成红色物质。此反应是酮糖的特异反应。醛糖在同样条件下呈色反应缓慢，只有在糖浓度较高或煮沸时间较长时，才呈微弱的阳性反应。在实验条件下蔗糖有可能水解而呈阳性反应。三、器材1.试管及试管架

9、 2.滴管3.水浴锅四、试剂1.莫氏（Molisch）试剂： 5% -萘酚的酒精溶液，称取-萘酚5g，溶于95%酒精中，并用此酒精使总体积达100mL，贮于棕色瓶内。此试剂需新鲜配制。2.塞氏（Seliwanoff）试剂：称取间苯二酚0.05g溶于30 mL浓盐酸中，再用蒸馏水稀释至100 mL，此试剂需新鲜配制。3.1%葡萄糖溶液：称取葡萄糖1g，溶于100mL蒸馏水中。4.1%果糖溶液：称取果糖1g，溶于100mL蒸馏水中。5.1%蔗糖溶液：称取蔗糖1g，溶于100mL蒸馏水中。6.1%淀粉溶液：称取可溶性淀粉1g与少量冷蒸馏水混合成薄浆状物，然后缓缓倾入沸蒸馏水中，边加边搅，最后以沸蒸馏

10、水稀释至100mL。7.0.1%糠醛溶液：称取糠醛0.1g，溶于100mL蒸馏水中。8.浓硫酸 500mL五、操作1.-萘酚反应（Molisch反应）取5支试管，分别加入1%葡萄糖溶液、1%果糖溶液、1%蔗糖溶液、1%淀粉溶液、0.1%糠醛溶液各1.5mL。再向5支试管中各加入2滴莫氏试剂，充分混合。斜执试管，沿管壁慢慢加入浓硫酸约1mL，慢慢立起试管，切勿摇动。浓硫酸在试液下形成两层。在二液分界处有紫红色环出现。观察、记录各管颜色。试剂现象解释现象1%葡萄糖溶液1%果糖溶液1%蔗糖溶液1%淀粉溶液0.1%糠醛溶液2.间苯二酚反应（Seliwanoff反应）取3支试管，分别加入1%葡萄糖溶液、

11、1%果糖溶液、1%蔗糖溶液各5mL。再向各管分别加入塞氏试剂2mL，混匀。将3支试管同时放入沸水浴中，注意观察、记录各管颜色的变化及变化时间。六、思考题1可用何种颜色反应鉴别酮糖的存在？2-萘酚反应的原理是什么？实验二 还原糖和总糖的测定3,5-二硝基水杨酸比色法一、目的与要求掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。二、实验原理还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，如乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对

12、没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540 nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。三、实验材料、主要仪器和试剂1实验材料 小麦面粉(1000 g) 2主要仪器（1）具塞玻璃刻度试管：20 mL

13、11 （2） 滤纸 （3）烧杯：100 mL2 （4）三角瓶：100 mL1 （5）容量瓶：100 mL3 （6）刻度吸管：1mL1；2 mL2；10 mL1 （7）恒温水浴锅 （8）煤气炉 （9）漏斗 （10）天平 （11）分光光度计3 试剂（1）1mg/mL葡萄糖标准液准确称取80 烘至恒重的分析纯葡萄糖100 mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100 mL，混匀，4冰箱中保存备用。 （2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂3,5二硝基水杨酸（DNS）试剂：称取6.5 g DNS溶于少量热蒸馏水中，溶解后移入1000 mL容量瓶中，加入2 m

14、ol/L氢氧化钠溶液325 mL，再加入45 g丙三醇，摇匀，冷却后定容至1000 mL。 （3）碘-碘化钾溶液：称取5 g碘和10 g碘化钾，溶于100 mL蒸馏水中。（4）酚酞指示剂：称取0.1 g酚酞，溶于250 mL 70%乙醇中。（5） 6 M HCl和6 M NaOH各100 mL。（分别取59.19 mL 37%浓盐酸和24克NaOH定容至100mL） 四、操作步骤1. 制作葡萄糖标准曲线取7支20 mL具塞刻度试管编号，按表1分别加入浓度为1 mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。表1 葡萄糖标准曲线制作管 号1mg/

15、mL葡萄糖标准液（mL）蒸馏水（mL）DNS（mL）葡萄糖含量（mg）光密度值 （OD540nm）0021.5010.21.81.50.220.41.61.50.430.61.41.50.640.81.21.50.851.01.01.51.061.20.81.51.2将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5 min，取出，用冷水迅速冷却至室温，用蒸馏水定容至20 mL，加塞后颠倒混匀。调分光光度计波长至540 nm，用0号管调零点，等后面710号管准备好后，测出16号管的光密度值。以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量（mg）为横坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。 葡萄糖标准曲线葡萄糖含量（mg）2. 样品中还原

16、糖和总糖的测定（1）还原糖的提取准确称取3.00 g食用面粉，放入100 mL烧杯中，先用少量蒸馏水调成糊状，然后加入50 mL蒸馏水，搅匀，置于50 恒温水浴中保温20 min，不时搅拌，使还原糖浸出。过滤，将滤液全部收集在100 mL的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，即为还原糖提取液。（2）总糖的水解和提取准确称取1.00 g食用面粉，放入100 mL三角瓶中，加15 mL蒸馏水及10 mL 6 M HCl，置沸水浴中加热水解30 min, 取出12滴置于白瓷板上，加1滴I-KI溶液检查水解是否完全。如已水解完全，则不呈现蓝色。水解毕。冷却至室温后加入1滴酚酞指示剂，以6 mol/L NaO

17、H溶液中和至溶液呈微红色，并定容到100 mL，过滤取滤液10 mL于100 mL容量瓶中，定容至刻度，混匀，即为稀释1000倍的总糖水解液，用于总糖测定。（3）显色和比色取4支20 mL具塞刻度试管，编号，按表2所示分别加入待测液和显色剂，将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5 min，取出，冷水迅速冷却至室温，用蒸馏水定容至20 mL，加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。调波长540 nm，用0号管调零点，测出710号管的光密度值。表2 样品还原糖测定管 号还原糖待测液（mL）总糖待测液（mL）蒸馏水（mL）DNS（mL）光密度值（OD540nm）查曲线葡萄糖量（mg）平均值70.51.51

18、.580.51.51.59111.510111.5五、结果与计算计算出7、8号管光密度值的平均值和9、10管光密度值的平均值，在标准曲线上分别查出相应的葡萄糖毫克数，按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量(以葡萄糖计)。还原糖（%）=查曲线所得葡萄糖毫克数 提取液总体积测定时取用体积100 =样品毫克数总糖（%）=查曲线所得水解后葡萄糖毫克数稀释倍数0.9100 =样品毫克数六、注意1. 标准曲线制作与样品测定应同时进行显色，并使用同一空白调零点和比色。2. 面粉中还原糖含量较少，计算总糖时可将其合并入多糖一起考虑。七、思考题1.在样品的总糖提取时，为什么要用浓HCl处理？而在其测定前，又为

19、何要用NaOH中和？2.标准葡萄糖浓度梯度和样品含糖量的测定为什么应该同步进行？比色时设0号管有什么意义？3. 绘制标准曲线的目的是什么？实验三 动物组织中核酸的分离及定量核酸广泛的存在于一切生物细胞中，亦为病毒的主要成分。业已证实核酸在蛋白质的生物合成，病毒的传染、癌瘤的发生以及生物遗传等方面均有重要作用，引起科学界对核酸研究的重视。本实验通过生物材料中核酸的分离及定量使学生初步了解RNA和DNA的基本测定方法，对生物学及医学的研究具有一次意义。核酸基本组成单位是核苷酸类，即由有机含氮碱、戊糖及磷酸所构成，作为RNA核苷酸成分的特点是含有核糖，而DNA则含脱氧核糖，此外有机碱可有所不同，如R

20、NA含尿嘧啶，而DNA含胸腺嘧啶等。【实验目的】掌握核酸分离定量的原理和方法【实验原理】根据核酸与组织其它有机物质在溶剂中溶解性的不同，而逐步使之与脂类，蛋白质以及其它小分子物质分离。然后根据两种核酸所含戊糖的性质分别进行定量。（l）除去低分子物质： 用三氯乙酸将细胞中的高分子物质，如蛋白质及脂类（呈脂蛋白形式存在）沉淀下来，而使一些小分子物质溶于三氯乙酸中，离心进行分离。（2）除去脂类：用热乙醇提取沉淀中脂类。（3）提取核酸及定量。向沉淀（只含有核酸及蛋白质）中加三氯乙酸，并在90加热，使核酸水解为其组成成分而溶于酸，这时蛋白质不受影响，离心后将核酸的水解产物（在上清中）与蛋白质（沉淀部分）

21、分开，取上清以二苯胺或地衣酚试剂呈色。可分别测定DNA及RNA的量。呈色的基本原理是当RNA中的核糖及DNA中的脱氧核糖在酸的存在下加热时则脱水生成醛类衍生物并分别同地衣酚（35一二羟基甲苯，或二本胺试剂反应产生呈色物质。 【实验操作】（1）取新鲜鼠肝 0.4g，用小剪刀剪碎，放匀浆管中，用吸管取 15三氯乙酸 8mL，先加约23mL于上述匀浆管中，用匀浆器研磨35分钟。然后移入一离心管中（注意在转移过程中避免损失），再以 15三氯醋酸2mL洗匀浆管，重复洗 23次，注意将匀浆管洗净，全部移入离心管中此时总量约8mL静止5分钟后离心10分钟（3000rpm）（2）倾弃上清（用玻璃轻棒管口，迅速

22、倾泄之）。（3）在离心管中加入8mL无水乙醇（醋酸钠饱和的）。用玻璃棒搅起沉淀。（4）准备好一沸腾水浴，将火关闭（注意：此项操作要严格遵守，否则可能造成事故），然后手持试管央夹将离心管放在水浴中，待乙醇沸腾后两分钟取出（注意；勿使乙醇在沸腾时冲出管外），离心2000转分，10分钟，弃上清（此上清中含有脂类）。（5）在离心管中加入 8mL5三氯醋酸，用玻璃棒搅起沉淀，在90水浴中加热 15分钟取出稍冷后离心 2000转分，10分钟，倾上清于10mL量杯中加水至 10mL（此液含有核酸，可用以定量）。将沉淀弃之。（6） RNA定量：取试管4支，按表加入试剂（加地衣酚试剂时可用滴管）试管H2O标准R

23、NA液检品（由操作所得上清）地衣酚123（标准）4（空白）1.8mL1.8mL2.0mL - -2.0mL-0.2mL0.2mL - -4.0mL 4.0mL4.0mL4.0mL 将各管内容物混匀后在沸水浴中加热25分钟后，用水道水冷却以后用665nm或红色滤光板比色。（7）DNA定量取试管4支，按下表加入试剂（加二苯胺试剂可用滴管）试管H2O标准DNA液样品（由操作5所得上清）二苯胺试剂123（标准管)4（空白管）-2.0mL-2.0mL-2.0mL2.0mL - -4.0mL4.0mL4.0mL4.0mL各管内容物混匀后在沸水浴中加热15分钟，冷却后比色，用595nrn或红色滤光板。（8）

24、计算：RNA含量： RNAg/100mg新鲜组织=Du/Ds80（g）10/0.2100/400=Du/Ds1000 DNA含量DNAg/100mg新鲜组织=Du/Ds200（g）10/2100/400=Du/Ds250 【注】（1）RNA及DNA定量比色时，注意勿使比色液外溅，以免损伤仪器及衣物。因地衣酚试剂及二苯胺试剂中含浓酸，比色完毕后废液倒入水道时，必须用大量水冲洗水道，否则试剂中浓酸会腐蚀水道，比色杯及时洗净空干。（2） 鼠肝的RNA含量约9001000g100mg组织；DNA含量约为220g100mg组织。实验四 微量凯氏定氮法目的1. 掌握微量凯氏定氮法测定样品总氮量和蛋白质的原

25、理和方法2. 学会使用凯氏定氮仪原理凯氏(Kjeldahl)定氮法常用于测定天然有机物(如蛋白质，核酸及氮基酸等)的含氮量。天然含氮有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢被分别氧化成CO2和H2O，而氮则变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵，是为“消化”。该反应进行得比较缓慢，通常需要加入硫酸钾/硫酸钠以提高反应的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂促进反应的进行。以甘氨酸为例，其消化过程可表示如下：NH2浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸汽将产生的氨蒸馏到一定量及一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后，氨与溶液中的氢离子结合，生成铵离子，使溶液中氢离子浓度降低。然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液

26、中原来氢离子浓度为止，最后根据所用标准酸的当量数(相当于待测物中氨的当量数)计算出待测物中的氮量。(NH4)2SO4 + 2 NaOH Na2SO4 + 2 NH4OHNH4OH H2O + NH3NH3 + H3BO3 NH4H2BO3NH4H2BO3 + HCl NH4Cl + H3BO3滴定时用甲烯蓝和甲基红混合指示剂，其指示范围为pH5.25.6，将NH4H2BO3的蓝/绿色滴至原来H3BO3的蓝紫色即为终点。本法适用范围0.21.0mg氮，相对误差应小于2%。材料、试剂与器具材料卵清蛋白、面粉等含蛋白质样品试剂1. 浓硫酸(化学纯)2. 30%氢氧化钠(分析纯)溶液3. 0.9%Na

27、Cl溶液4. 硫酸钾-硫酸铜混合物：硫酸钾与硫酸铜以3:1 (W/W)配比混合研磨成粉末5. 2%硼酸6. 混合指示剂(田氏)：0.1%甲烯蓝乙醇溶液50ml与0.1%甲基红乙醇溶液200ml混合配成(贮于棕色瓶备用，这种指示剂酸性时为紫色，碱性时为绿色，变色范围窄且灵敏)7. 0.0500M HCl8. 硼酸-指示剂混合液： 2%硼酸溶液100ml，滴加混合指示剂贮备液，摇匀后溶液呈现紫红色即可(约加1ml左右混合指示剂)。9. 标准硫酸铵溶液(0.3mg N/ml)器具凯氏烧瓶 消化架 吸量管(1ml, 2ml) 量筒(10ml) 凯氏定氮蒸馏装置微量滴定管(3ml, 5ml, 可读至0.

28、02ml) 锥形瓶(50100ml) 容量瓶(50ml)操作步骤 样品的处理血清样品：取人血(或猪血)放于离心管中，于冰箱中放置过夜，次日离心除去凝血块，上层黄色透明清液即为血清。准确吸取血清1.0ml加入0.9%NaCl 4.0ml，仔细混匀备用。固体样品：在称量瓶中称入一定量的磨碎的样品，置105 (非游离的水不能在100以下烘干)烘箱内干燥4小时至恒重。 消化在50ml凯氏烧瓶内加2ml稀释血清溶液或0.10.5g干燥样品(直接加至烧瓶底部，切勿沾于瓶口或瓶颈上)。 向该烧瓶加入硫酸钾-硫酸铜混合物约0.2克，浓硫酸310ml，小瓷片两粒，摇匀。将烧瓶约60度角固定在铁架上，瓶口放一小漏

29、斗，在通风厨内的电炉上消化。在消化开始时，应控制火力，不要使液体冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出SO2白烟后，适当加强火力，继续消化，直至消化液呈透明蓝绿色为止。消化完毕，待烧瓶内容物冷却后，加蒸馏水10ml (注意慢加，边加边摇)。冷却后将瓶内容物转入50ml容量瓶，并用蒸馏水洗烧瓶数次，溶液一并倒入容量瓶，最后定容至刻度摇匀，做上记号备用。 蒸馏 1、仪器的洗涤：仪器应先经一般洗涤，再经水蒸气洗涤。 蒸馏器有几种，应用前需熟悉其使用方法。使用方法如下：开放自来水龙头，使水E进入G，从K管流出(水不宜开得过大以免水从G管溢出)。开放P3，使水进入A室，漏斗D中加蒸馏水约10ml入B室。用拇指将管口按紧，同时开放P1，则B室中的水先从Y型管口冲出，随后A室中水经K管流出，一般情况下如此重复洗涤两次即可。若蒸馏器内有氨存在，则应加入蒸馏水后，不加样品蒸馏一次方可使用(可用pH试纸检查)。A为蒸气发生室，P3为其开关，P1为出水开关，B为蒸馏室，与出气管M相接，M管插入盛有定量硼酸液的锥形瓶，B室内有Y型管，一端与A室相通，另一端经P4与漏斗D相连，可经此将样品及试剂加入B室，F为冷凝管，E为进水管，水经F、G、K而流出，蒸馏时依次在B室加入消化好的样品及NaOH, 二者反应产生氨，经M管进入锥形瓶由硼酸吸收。图1-1 凯