出血与血检性疾病地实验的室诊断.docx

1、出血与血检性疾病地实验的室诊断出血与血检性疾病的实验室诊断Laboratory Diagnosis of Hemorrhagic and Thrombotic Disease血栓与止血（thrombosis and homostasis）是体内止凝血系统与抗凝血系统动态平衡失调的一种病理生理过程。由于止血活性增强或抗凝血活性减弱，便会导致高凝状态（hypercoagulable state）和血栓形成（thrombus）；相反，则会引起低凝状态（hypocoagulable state）和发生出血症状（hemorrphage）。血栓形成的条件目前公认是由Virchow提出的三个条件：（1）血管

2、内皮细胞损伤（2）血流状态的改变（3）血液凝固性增加：1；遗传性高凝状态，2：获得性高凝状态：手术、创伤、壬辰和分娩前后、DIC、抗磷脂抗体综合征常见疾病：心肌梗死(MI); 缺血性脑梗塞（CI）；外周血管病（PAD)；静脉血栓栓塞（VTE）序言正常血管内存在微量血液凝固，但此种凝固仅仅是纤维蛋白原转化为纤维蛋白，并未结合红细胞。这些微量的纤维蛋白贴附在血管内壁，使之更光滑，反而不易发生凝血。一、影响凝血因素血液成分、血管、血液状态二、名词1、血栓性疾病（Thrombotic Disease）：机体内某些因素自发形成血管内血栓，导致局部组织器官缺血的疾病。2、血栓前状态（Prethrombot

3、ic States/PTS）：患者体内血液凝固性增高，极易形成血栓的一种状态。其凝血因子、抗凝因子、纤溶系统、血管可能均有异常，血栓前状态是多种因素异常的综合表现。3、高凝状态（Hypercoagulable State/HCS）：特指凝血酶的活性升高或含量升高而引起的血液极易凝固的一种状态。高凝状态是血栓前状态中的一种。4、出血性疾病（Hemorrphagic Disease）：以自发性出血或轻微损伤后即出血不止为主要表现的一种疾病。发病机制：血管壁异常，血小板数量功能异常，凝血功能异常，纤溶功能异常 血管壁和纤溶系统有抗凝作用 血小板和凝血系统有促凝作用 正常人促凝和抗凝系统处于动态生理平

4、衡正常止血机制一、初期止血血管内皮与血小板在初期止血过程中共同作用。1、内皮细胞在血栓与止血中的机制。血管受到损伤后，内皮细胞暴露出带有负电荷的胶原分子，可黏附血小板。血管受到损伤后，血管收缩，也可导致血小板的聚集。1.1.促凝血作用一、血管壁的止血作用1.1.1. 血管反射性收缩，使损伤血管口径缩小。1.1.2. 激活血小板，使黏附的血小板聚集起来。1.1.3. 启动凝血因子，激活内源性凝血途径，促进血液凝固。1.1.4. 局部血粘度增高1.2. 抗凝血作用1.2.1. 合成前列环素，抑制血小板聚集。1.2.2. 合成组织纤溶酶原激活物（t-PA）促进纤溶系统活性。1.2.3. 血管内皮合成

5、肝素。1.2.4. 合成血栓调节素 （Thrombomodulin/TM）。1.2.5. 合成蛋白S2. 血小板在血栓与止血中的机制2.1 血小板的超微结构2.3血小板的正常生理功能：1.维护血管内皮的完整性：血小板参与血管内皮的再生和修复过程，增强血管壁的抵抗力，家底血管壁的通透性和脆性。2.止血功能： 粘附、聚集在血管破损处，形成白色血栓，2释放活性物资，促进PLT聚集，增强血管收缩3.促进凝血过程，4.血块收缩，形成稳固血栓。5.维持血管壁的完整性，毛细血管的通透性血小板聚集的条件：a. Thromboxane A2/TXA2：作用机制：. 促进血小板膜表现的GPIIb/IIIa 受体构

6、相改变，使血小板聚集 . 作用于血小板，使内源性ADP释放。b. ADP： .外源性ADP由红细胞破坏后释放，可促进血小板聚集（I相聚集）。 . 内源性ADP，源于血小板内部致密颗粒。此ADP可促进血小板进一步聚集，形成白色血栓，称为II相聚集。c. Ca2+：Ca2+是血小板聚集的依赖性条件2.2 血小板在血栓与止血中的作用。 2.2.1. 黏附作用：血小板粘附于内皮下暴露的胶原纤维上与血小板糖蛋白（GP）I有关， 而VWF因子是它们中间的桥梁2.2.2. 聚集功能（血小板之间的黏附）需Ca2-、纤维蛋白原、GPIIb-IIa/CD61共同作用。指血小板之间相互的粘附作用，血小板的聚集主要通

7、过：ADP途径；前列腺素环过氧化物及TXA2途径；PAF途径。血小板膜糖蛋白（GP）b/a对聚集起重要作用。GPb/a能形成钙离子复合物，在血小板膜上组成纤维蛋白受体。 2.2.3. 释放功能 a-颗粒中PF4-TG为具有标志作用的蛋白，致密颗粒中可释放 ADP。2.2.4. 促凝血功能 提供PF3，血小板激活后磷脂膜发生翻转，将负电荷暴露在表面，使凝血因子易于附着。2.2.5. 血块收缩功能 血小板释放血栓收缩蛋白，使血块进一步收缩、稳定。二 血液凝固及其调节机理1. 凝血因子目前已知的凝血因子有12种，按照每个因子发现的先后，国际上统一用罗马数字命名。因子I：即纤维蛋白原，由肝脏合成的糖蛋

8、白，分子量3.4万道尔顿，正常血浆含量为200400mg/dl，在凝血酶的催化作用下，可转变成纤维蛋白，这是血液凝固的基础。因子：即凝血酶原，亦系肝脏合成的糖蛋白，维生素K是合成的必须原料，因子在凝血活酶的催化作用下，可转变为凝血酶。凝血酶原的正常含量为10-11mg/ml，如含量不足，则出血不易停止，具有自发性出血倾向。因子：又称组织凝血活酶，为含磷脂蛋白，可由各种组织细胞合成，其中脑，肺，胎盘和子宫内含量最多，是激活外源凝血系统的因子。因子：即Ca2+，由饮食而来，正常含量为9-11mg/ml，在凝血过程中的许多环节发挥作用。除去Ca2+，血液便不能凝固。因子：又名前加速素，易变因子，是由

9、肝脏合成的糖蛋白，正常血浆含量为5-10mg/ml，它是在凝血活酶形成的最后阶段起作用的因子。因子：也叫前转变素或稳定因子。是一种糖蛋白，主要在肝脏合成，血浆含量为0.3-0.4mg/ml。是外源性凝血系统所需之因子。因子：又名抗血友病球蛋白或抗血友病因子。由网状内皮细胞和肝脏组织合成，正常血浆含量为15-20mg/ml，若含量偏低或缺乏，则血液不易凝固，即是临床所见的血友病。因子：又名血浆活素成份，由肝脏合成的一种糖蛋白，也是依赖维生素K的因子，正常血浆含量为3-5mg/ml，属内源系统凝血因子。因子：又称司托-普鲁文氏因子，由肝脏合成的糖蛋白。合成时需维生素K作原料，正常含量为5-10mg

10、/ml，是内源系统和外源系统凝血活酶形成共同需要之蛋白酶。因子：别名血浆凝血活素前质。化学本质为糖蛋白，可能由网状内皮系统细胞产生，正常含量0.5-0.9mg/ml，是内源性凝血系统所需之蛋白酶。因子：又名海格曼氏因子，接触因子。可能由网状内皮细胞合成，化学本质为糖蛋白。正常含量0.1-0.5mg/ml，为内源系统凝血之启动因子。它与粗糙面或胶原纤维接触后便被激活，从而引起血浆内原来无活性的凝血因子系列相继被激活，促使血液凝固。因子：又名纤维蛋白稳定因子，或血浆转谷氨酰胺酶，可能来自血小板或肝脏，也是一种糖蛋白。正常血浆含量为2mg/ml，它的主要作用是促使纤维蛋白单体形成氨基桥键多聚体，而增

11、加纤维蛋白的稳定性。以上12个因子排成13个号，其中缺少。原因是后来发现命名的因子即活化因子V，不是独立因子，故取消此名。但其他因此名号不变。十分重要的血小板磷脂（血小板因子PF3）以及后来发现的激肽释放酶原PK（一种单链糖蛋白，参与内源性凝血途径的激活）和高分子量激肽原HMWK（也是一种单链糖蛋白，参与内源性凝血途径激，XIIa对XI的激活有促进作用）也是凝血因子，但都没有编号。2.凝血过程 三个阶段：第一阶段：凝血酶活酶的形成 第二阶段：凝血酶形成 第三阶段：纤维蛋白形成 a-2-antiplasmin/a-2-Apl/a2-抗纤溶酶 Protein C/PC/蛋白CTissue Fact

12、or/TF/组织因子 Antithrombin /AT/抗凝血酶Protein S/PS/蛋白S Thrombomodulin/TM/血栓调节蛋白Dermatan Sulfate/Ds/硫酸皮肤素 Platelet factor3/PF3/血小板因子3Heparin Cofactor II/HC II/肝素辅因子II Streptokinase/SK/链激酶Plasminogen/PLG/纤溶酶原 Activated Protein C/APC/活化蛋白CHigh molecular weight kininogern/HMWK Urokinase/UK/尿激酶Plasmin/PL/纤溶酶 H

13、eparin/HEP/肝素Tissue Plasminogen Activator/TPA/组织凝血酶原激活物Plasminogen activator inhibitors/PAI/纤溶酶原激活物抑制物Fibrinogen Degradation Products/FDP纤维蛋白原降解产物Thrombin Sensitive Protein/TSP:凝血酶敏感蛋白Fragment 1+2/F1+2/凝血酶碎片1+2三、抗凝机制1.细胞抗凝机制2.体液抗凝机制a. 肝素（Heparin）肝素可促进AT-构型发生变化，暴露出与活化因子结合的地点，灭活Xa、IIa。b. 低分子量肝素（Low Mo

14、lecular Weight Heparin/LMWH）整体抗凝效果不如肝素，但抗Xa要强于肝素。c. 抗凝血酶（Antithrombin,AT-）AT-又称肝素辅因子Heparin Cofactor I/HCI 占体内抗凝作用60-70%，先天性AT-缺乏的患者可以形成大量深静脉血栓及反复形成血栓。d. 肝素辅因子与DS（硫酸皮肤素）作用后形成复合物主要灭活IIa。e. 蛋白C系统 蛋白C激活后可形成APC（活化的蛋白C）f. 纤维蛋白 一旦形成将IIa吸附于表面，即使有的也很快被AT-和HC灭活，局部AT-浓度很低，有利于凝血过程。四、纤溶系统及其作用机制纤溶系统是纤维蛋白溶解系统（fib

15、rinolytic system）的简称，本系统主要的生理作用是溶解纤维蛋白，从而防止和清除血管内由于纤维蛋白沉着而引起的阻塞现象。正常血管内不断有少量纤维蛋白形成，同时有正常的纤维蛋白溶解。纤溶活性亢进特征：1.皮肤大片状瘀斑或伴有内脏出血2.创口以渗血为特征，难于止血，尤其是损伤部位3.血凝块易溶解，对抗纤溶药物有效4.多为获得性（组织创伤或手术、挤压等）常用筛查实验：1.优球蛋白溶解时间（ELT) 2.纤维蛋白原降解产物测定（FDPs） 3.D-二聚体测定（D-D)1. 参加纤溶作用的成分（1）纤溶酶原（Plasminogen PLG）：可能是由肝脏和粒细胞合成的一种多肽链糖蛋白。正常血

16、浆浓度为15-20%，分子量92,000，被激活物激活后转化为纤溶酶，使纤维蛋白（原）降解。（2）纤溶酶（Plasmin PL）：是纤溶酶原分子中精氨酸颉氨酸肽链被切断后形成的双多肽链分子。是一种活性极强的丝氨酸蛋白水解酶，可直接水解纤维蛋白原，交联和非交纤维蛋白。（3）组织纤溶酶原激活物（Tissue Plasminogen Activator tPA）能够直接催化纤溶酶原转变为纤溶酶的一种糖蛋白，在纤维蛋白存在下能迅速激活纤溶酶原。（4）纤溶酶原激活物抑制物（Plasminogen Activator Inhibitor PAI）：PAI主要有两种，即PAI-1和PAI-2，以PAI-1最

17、为重要，PAI与tPA形成复合物而使其灭活。（5）2-抗纤溶酶（2-Antiplasmin,2-AP），由肝细胞合成的单链糖蛋白，是纤溶酶的主要抑制物。（6）尿激酶（UK）：是由肾髓质产生的一种球蛋白，性质稳定，可从尿中提取。UK是特异性很强的蛋白水解酶，能使纤溶酶原迅速水解成纤溶酶。所以临床上常用它作为溶栓剂。2. 纤溶系统作用机制纤维蛋白溶解也是经过一系列酶促作用降解为低分子量产物的过程，纤溶激活途径又分为内激活途径与外激活途径。2.1. 内激活途径这一途径主要是通过激活内源性凝血因子发挥作用，a使激肽释放酶原（PK）转变为激肽释放酶（K），K能激活纤溶酶原为纤溶酶。2.2外激活途径在这条

18、途径中，主要是组织型纤溶酶原激活物（t-PA）原激酶型纤溶酶原激活剂（uPA），使纤溶酶原激活为纤溶酶，t-PA和u-PA又受纤溶酶原激活物抑制物（PAI）-1及-2的抑制，他们之间的作用、激活和抑制、调节着纤溶活性，具有重要的生理病理意义。3. 纤溶作用的产物3.1. 纤维2蛋白降解产物(FDP)：纤维蛋白（原）经过纤溶酶原作用分解为A，B，C，D，x，y，E等肽段，这些物质统称为纤维蛋白降解产物。FDP增多，标志纤维蛋白或纤维蛋白原降解活性增强。3.2. D-二聚体/D-Dimer：是纤维蛋白单体经活化因子交联后再经纤溶酶水解所产生的一种特异降解产物。只有在外源性血栓形成后才会在血浆中增高

19、，是诊断血栓形成的重要分子标志物。止血与血栓实验室检查的标本采集一、采集标本采血时，首先应确认患者的姓名，并且将姓名和编号写在存血容器上。1、病人处于休息状态，早餐前采血。2、21G1.5/20G1.5型号针头采血，速度慢且均匀，避免产生泡沫。3、采用塑料试管存放全血、血浆，避免玻璃试管激活凝血过程。4、测定APTT和特殊因子的血浆室温放置不能超过2小时，其他血浆不超过4小时。5、血浆置于室温下，应加盖，防止因CO2散失导致PH值的改变。6、避免将血浆置于370C超过10分钟。7、3.2%（0.109mol/L）枸橼酸三钠与血浆1:9抗凝。1500转离心10分钟，取上层草黄色液体即为血浆，立即

20、试验。如不能在4小时内完成所有试验，可将血浆置于-200C条件下，试验前370C快速融化。二、抗凝剂109mmol/L（3.2%）枸橼酸钠做为抗凝剂，与待检测血液1:9体积混匀，避免用力震荡。原理：枸橼酸钠能与血液中的钙离子形成可溶性络合物，从而阻止血液凝固，主要用于血沉，凝血因子和血小板功能试验。止血血栓检测方法分类一、根据检测原理分为：1、凝固法：凝固法的原理是应用缺乏某种血液因子的基质血浆，加受检者血浆或正常血浆后，测定其血浆凝固或纤维蛋白溶解时间，判断受检者血浆中待测因子是否异常。反应结果常以时间（分或秒）或相对活动度（%）表示。如PT、APTT以及各种凝血因子检测均使用凝固法。但是这

21、种方法有一定局限性，不能测定其含量，更不能测定其抗原性。2、产色底物法：人工合成与天然凝血因子相似排列顺序的一段氨基酸，与能水解产色的化学基团相连。测定时由于凝血酶作用于人工合成的肽段底物，从而释放出产色基团。然后用分光光度计进行测定。产生的颜色深浅与凝血酶活性成一定比例关系，故可进行定量。目前最常用的是对硝基苯胺，黄色，波长405nm。a. 直接测定被检血浆中某种蛋白水解酶的活性，如凝血酶，Xa，尿激酶测定等。b. 先将被检血浆中的某种酶原加以激活，然后此活化的凝血酶对人工合成的底物进行水解而产色，如纤溶酶原，蛋白C测定等。c. 向被检血浆中加入过量的有关凝血酶试剂，以中和相应的抗凝物质，然

22、后测定其残余的酶活性，如AT-活性测定，a2-抗纤溶酶测定，肝素测定。 3、免疫学检测法a. 免疫扩散法 b. 火箭电泳法c. 双相免疫电泳 d.ELISAe. 胶乳凝集法将抗体包被于乳胶颗粒上，然后与被检物结合，形成抗原抗体复合物的胶乳颗粒凝集，用仪器或肉眼进行定量或半定量分析。f. 免疫比浊法将被检物与其相应抗体混合形成免疫复合物，通过免疫透射比浊或散射比浊法进行测定。此法操作简便，准确性好，便于自动化。二、根据检测手段分为：1、手工法1.1. 表面皿挑丝法1.2. 试管倾斜法2、半自动仪器法2.1 电流法2.2. 黏度法（磁珠法）磁珠法目前分为水平磁珠法和摆磁珠法两类，具备精确度高，防止

23、黄疸血、高脂血的影响等优点，但磁珠法易受血浆黏度、反应杯材料等影响。而且在正常凝血过程中，相继形成的软硬血栓会影响水平法磁珠转动的半径，因而其产生的电脉冲不能真实反映生理血凝过程。2.3 光学法：光学法灵敏度高，重复性好，而且易于自动化，目前市场上销售的大部分凝血仪均采用此原理。2.3.1. 透射比浊法：利用样本吸光度的变化判断凝固终点，具体方法有两种。 吸光度增加为终点：样本凝固时，纤维蛋白原转化为纤维蛋白，溶液光密度由小变大。这一光密度的改变被视为凝固终点。此方法灵敏度高，但对于低纤维蛋白原血浆及低凝状态血浆，由于凝固时间延长或不凝，所以不易检出。 吸光度降低为终点：反应中加入具有一定浊度

24、的白陶土试剂和一粒磁珠。标本凝固后，纤维蛋白丝缠绕于磁珠上反而使液体变清，光密度下降，以此作为凝固终点。具备以上优点，而且对于低纤维蛋白原血浆及低凝状态血浆，虽然血浆无法凝固，但产生的微量纤维蛋白丝一样可以缠绕于磁珠上使液体变清，光密度下降。 2.3.2 散射比浊法：其检测原理与透射法基本相同，只是利用样本散射改变判断凝固终点，因此其信号接收系统设计与透射法不同，散射比浊法检测器的位置必须与光路成一定角度。3、全自动凝血仪：加样、加试剂、计算结果、并显示和打印报告。全部实现自动化，具有一定Work Away功能。目前市场上以德国BE公司的Rackrotor、Combi、Compact-X系列、

25、美国强生Electral 400C凝血仪、东亚CA6000等为代表。以德国BE公司为代表综合光学法与黏度法之长处，以光学动态速率比浊法做为检测原理基础，同时结合磁珠法优点，建立了光电磁这一新方法。因为在浊度变化的线性范围内进行检测，所以线性好。对于低纤维蛋白原及其他低凝血浆，虽然肉眼与凝固法均无法检测，但通过浊度的轻微变化，光电磁依然可以检测。同时因为使用动态速率光学法检测，所以不受黄疸等异常血影响。BE全自动凝血仪各项目检测原理表测定项目缩写凝固法产色底物法免疫法凝固酶原时间PT*活化部分凝血活酶时间APTT*凝血酶时间TT*纤维蛋白原FIB*外源性凝血因子，*内源性凝血因子，*活化蛋白C抵

26、抗性APC-R*肝素HEP*低分子量肝素LMWH*抗凝血酶IIIAT-III*蛋白SPS*蛋白CPC*血栓调节蛋白ThromborobulinTM*纤溶酶原PLG*a2-抗纤溶酶原a2-AP*补体1脂酶抑制物CI*组织纤溶酶原激活物tPA*组织纤溶酶原激活物抑制物PAI*纤维蛋白单体FM*纤维蛋白降解产物FDP*D-二聚体D-Dimer*纤维蛋白肽AFPA*凝血酶肽端1+2F1+2*假性血友病因子VWF*止血与血栓的实验室检查一、初期止血异常1. 出血时间（Bleeding Time/BT）【定义】：将皮肤毛细血管刺破后，血液自然流出至自然凝固所需时间称为出血时间。【临床意义】：出血时间与血管

27、、血小板均有关。出血时间的长短主要受血小板数量和功能的影响，其实是血管壁的完整性和收缩功能，而血浆凝固因子的影响较小。BT:a. 血小板明显减少，50*109/L如原发性或继发性血小板减少性紫癜；b. 血小板功能异常，如血小板无力症或药物影响（阿司匹林、潘生丁）；C. 严重缺乏血浆有关因子，如血管性假性血友病（VWD），DIC；d. 血管壁异常，如遗传性出血性毛细血管扩张症；e. 药物影响，如服用乙酰水杨酸等。BT意义不大，某些严重高凝状态或血栓性疾病。【局限性】：受皮肤厚度、温度、性别等影响较大。2.血小板分析（PLT、MPV）及血小板形态观察血小板平均容积（MPV）和血小板分布宽度（PDW

28、)测定MPV:7-11fL PDW:15-17%MPV增加：1.PLT破坏增加而骨髓代偿功能良好2.MPV增加是造血功能的首要表现MPV减低：1.骨髓造血功能不良，血小板生成减少mpv随血小板数持续下降，是骨髓造血功能衰竭的指标之一。2.有半数白血病患者MPV减低PDW增加： 1.表明PLT大小悬殊，见于AML、巨幼贫、CML.、脾切除、巨大PLT综合证、血栓性疾病PDW减低：PLT均一性高，一般无临床意义二、血液凝固异常的检查（凝血因子异常的检查）（一）筛选试验1. 凝血时间（Clotting Time/CT）【原理】静脉血放在玻璃试管中，观察自采血开始至凝血所需时间称为凝血时间。本试验是反

29、映自因子XII被激活后，至纤维蛋白形成，主要反映内源性凝血系统的综合性检查试验【临床意义】CT：1）因子VIII，IX，XI，减少，如甲，乙国，丙型血友病。2）凝血酶原高度减少，如严重肝损害，阻塞性黄疸，新生儿出血等。3）纤维蛋白原生成严重减少，如先天性纤维蛋白原减少症，严重肝损伤等。4）应用肝素，双香豆素等抗凝药物时。5）纤溶亢进使纤维蛋白原降至11.5g/L以下或生成大量FDP时。6）循环抗凝物质增加，SLE。2.血浆凝血酶原时间（Prothrombin Time/PT）【原理】在被检血浆中加Ca2+和组织因子测定其凝固所需要的时间即血浆凝血酶原时间。外源性凝血系统中因子I，II，V，VI

30、I，X质或量异常时此试验可延长。PT是外源性凝血试验的综合性试验。【参考值】1）凝血酶原时间11/13s。应有正常对照，病人结果超过正常对照3s以上有临床意义。2）凝血酶原时间比值（prothrombin time ratio,PTR）即被检血浆的PT（s）/正常血浆PT（S）的数值。正常为10.05。3）国际标准化比率（INR）即PTR ISI，参考值为10.05。ISI为国际敏感度指数，指数越小，表示组织凝血活酶的敏感度越佳。INR=（PPT/CPT）ISIWHO规定不同情况下抗凝治疗时合适的INR范围1.术前2周或口服抗凝药物INR1.5-3（2.25）2.原发性、继发性静脉血栓的预防INR2.3-3.0(2.5)3.活动性静脉血栓、反复静脉血栓、肺栓塞预防INR2.0-4.0（3.0）4.动脉血栓预防INR3.0-4.5(3.5)5.INR缩短：表示高凝状态INR不适用的三种情况： 不适用于测定口服抗凝药初期的病人血浆；不适用于肝病凝血因子缺陷病人的血浆；不 适用于非抗凝治疗而PT延长