分子细胞的生物的学实验的技术.docx

1、分子细胞的生物的学实验的技术实验一 细胞传代一、实验目的学习细胞传代方法，扩增细胞，建立细胞系。二、实验原理培养细胞传代根据不同细胞采取不同的方法。贴壁生长的细胞用消化法传代；部分贴壁生长的细胞用直接吹打可传代；悬浮生长的细胞可以采用直接吹打或离心分离后传代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打传代。三、实验材料（一）仪器：净化工作台、离心机、冰箱（4、-20）、倒置相差显微镜、培养箱、细胞计数仪、（二）玻璃器皿：吸管（弯头、直头）、玻璃瓶（250ml、100ml）、培养瓶、试管（三）塑料器皿：枪头（10ul、100ul、1ml）、胶塞、15ml离心管、EP管（四）其他物品：微量加样枪、废液缸（五

2、）试剂：PBS缓冲液、小牛血清、DMEM、双抗（青霉素、链霉素）、胰蛋白酶（0.25%+EDTA）四、实验步骤1. 洗手进入超净工作室，显微镜下观察细胞状态，密度。2. 点燃超净台内酒精灯，打开所需试剂瓶，准备试管、吸管备用。3. 打开培养瓶，吸除瓶内旧培养液。4. PBS缓冲液洗2次。5. 向瓶内加入消化液10滴，轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面，室温进行消化5分钟。6. 5分钟后把培养瓶放置显微镜下进行观察，发现胞质回缩，细胞间隙增大，部分细胞开始脱落，立即加入2mL培养基终止消化。7. 用吸管，吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，使细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液。8. 将细胞悬液转移至

3、15mL离心管中，1000rpm/min，离心10min。弃上清，加入新鲜培养基2mL，重悬细胞。9. 计数，按1：2的比例分装到两个培养瓶中。五、实验结果 上图为A549传代后细胞100六、讨论1.传代前，用适量培养基重悬细胞，计数，按照合适的比例分装细胞，避免细胞数量过多，而出现上图中24小时后即出现密度抑制，并有死细胞。2离心转速要合适，转速过低，不能有效分离细胞，离心速度过大，时间过长，会挤压细胞造成损伤甚至死亡。实验二 细胞冻存和复苏一、实验目的学习细胞冻存和复苏的方法，掌握长期保存体外培养细胞的技术。二、实验原理细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传

4、代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。因此及时进行细胞冻存。细胞冷冻储存在-70冰箱中可以保存一年之久；细胞储存在液氮中，温度达-196，理论上储存时间是无限的。细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。三、实验材料（一）仪器：净化工作台、

5、离心机、冰箱（4、-20、-70）、倒置相差显微镜、培养箱、细胞计数仪、恒温水浴箱（二）玻璃器皿：吸管（弯头、直头）、玻璃瓶（250ml、100ml）、培养瓶、试管（三）塑料器皿：枪头（10ul、100ul、1ml）、胶塞、15ml离心管、EP管（四）其他物品：微量加样枪、废液缸（五）试剂：PBS缓冲液、小牛血清、DMEM、双抗、胰蛋白酶（0.25%+EDTA）、DMSO四、实验步骤（一）细胞冻存1. 洗手进入超净工作室，显微镜下观察细胞状态，密度。2. 点燃超净台内酒精灯，打开所需试剂瓶，准备试管、吸管备用。3. 打开培养瓶，吸除瓶内旧培养液。4. PBS液洗2次。5. 向瓶内加入消化液10

6、滴，轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面，室温进行消化5分钟。6. 5分钟后把培养瓶放置显微镜下进行观察，发现胞质回缩，细胞间隙增大，部分细胞开始脱落，立即终止消化。7. 用弯头吸管，吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，使细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液。8. 将细胞悬液转移至15mL离心管中，1000rpm/min，离心10分钟。弃上清，加入新鲜培养基2mL，重悬细胞。9. 计数，按1：2的比例，1mL分装到培养瓶中，继续培养；另1ml分装入已加入100ulDMSO的冻存管中。10. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；11. 冻存：430min, -2030min, -7030min,

7、移入液氮容器内。（二）细胞复苏1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37温水中，并不时摇动令其尽快融化。2. 从37水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；3. 离心， 1000rpm，10min；4. 弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37培养箱静置培养；5. 次日更换一次培养液，继续培养。五、实验结果上图为细胞复苏24h后状态 100六、讨论由实验一可见，本实验选取的冻存细胞出现密度抑制，状态不及对数生长期的细胞，冻存过程中操作不熟练，所以复苏后死细胞很多。冻存前，未进行细胞计数，冻存的细胞数量未

8、到达107,冻存后活细胞数量很低。增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。根据不同的细胞，适量调整DMSO的浓度。如果胰酶中有EDTA，每次传代是要离心弃除，否则在细胞体内蓄积会产生毒性。这样的冻存细胞复苏后死亡率也很高。实验三 细胞生长曲线、四唑盐试验（MTT）比色试验一、实验目的学习四唑盐比色试验，检测细胞存活和生长情况。二、实验原理四唑盐是一种能接受氢原子的染料，简称MTT。活细胞的线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在490nm波长

9、处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。三、实验材料（一）仪器：净化工作台、离心机、冰箱（4）、倒置相差显微镜、CO2培养箱、细胞计数仪、恒温水浴箱、酶联免疫检测仪、移液枪、电磁力搅拌机、微孔滤器（二）玻璃器皿：吸管（弯头、直头）、玻璃瓶（250ml、100ml）、培养瓶、试管（三）塑料器皿：吸头、枪头（10ul、100ul、1ml）、胶塞、15ml离心管、EP管（四）其他物品：微量加样枪、废液缸（五）试剂：PBS缓冲液、小牛血清、DMEM、双抗、胰蛋白酶（0.25%+EDTA）、DMSO、MTT溶液（称取250mgMTT，放入小烧杯中，加

10、50ml培养液或平衡盐溶液在电磁力搅拌机上搅拌30min，用0.22um的微孔滤器除菌，分装，4保存备用，两周内有效。）四、实验步骤1. 洗手进入超净工作室，显微镜下观察细胞状态，密度。2. 点燃超净台内酒精灯，打开所需试剂瓶，准备试管、吸管备用。3. 打开培养瓶，吸除瓶内旧培养液。4. PBS液洗2次。5. 向瓶内加入消化液10滴，轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面，室温进行消化5分钟。6. 5分钟后把培养瓶放置显微镜下进行观察，发现胞质回缩，细胞间隙增大，部分细胞开始脱落，立即终止消化。7. 用弯头吸管，吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，使细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液。8. 将细胞悬液

11、转移至15mL离心管中，1000rpm/min，离心10min。弃上清，加入新鲜培养基2mL，重悬细胞，计数为1106 。9. 96孔板中接种细胞：每孔接种细胞的数量分别为2105、1.5105、1105，0. 5105、0.25105，每孔补充培养基至200ul。10. 培养细胞：将96孔板移入CO2孵箱中，在37、5% CO2及饱和湿度条件下培养24小时。11. 呈色：每孔加入MTT溶液（5mg/ml）20ul，37孵箱中继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加入150ul DMSO，振荡10min，使结晶物充分溶解。12. 比色：选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各

12、孔光吸收值，记录结果。以细胞数量为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线。五、实验结果实验组细胞数量（个）2000001500001000005000025000吸光度1.9921.731.3820.8790.569老师对照组细胞数量（个）200000100000500002500012500吸光度11.2380.8780.5660.3360.246吸光度21.1620.6750.4690.3260.218均值1.20.77650.51750.3310.232由上图细胞生长曲线可见，随着细胞密度增加，吸光度增加，细胞处于生长期。但是吸光度值没有随着细胞数量的倍数增加而倍增，推测细胞可能不是处于对

13、数生长期。由原始数据分析可能是进入对数生长后期，接近停滞期。实验组的斜率略高于老师对照组，说明实验组的细胞活力略高于老师对照组。六、讨论 1.绘制细胞生长曲线，每孔接种同样浓度的细胞，不同天数进行观察。应为吸光度、时间的S型曲线。选取对数生长期细胞，作为实验对象。本实验细胞活力有所下降的原因分析：细胞活力本身就有所下降，有实验一推理得出；接种的细胞密度过大，出现密度抑制。调整最适的细胞密度培养检测 2.选择适当的细胞接种浓度。在进行MTT试验前，对每一种细胞都应测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，然后确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间。 3.避免血清干扰，一般选小于10%

14、胎牛血清的培养液进行试验。4.设空白对照，与实验平行设不加细胞只加培养液的空白对照孔。最后比色时，以空白孔调零。每个检测值设复孔最少2个，计算平均值，减少实验误差。实验四 核蛋白的免疫荧光定位一、实验目的学习间接法免疫荧光定位技术，定位细胞核PCNA蛋白。二、实验原理使用第一抗体作用于细胞的特定抗原，用PBS洗去未与抗原结合的第一抗体，再用荧光素标记的第二抗体作用于与抗原结合的第一抗体，形成抗原-第一抗体-第二抗体复合物，荧光部位即为抗原部位。三、实验材料荧光显微镜100%甲醇、24孔板、1% normal goat serum (NGS)、一抗：鼠抗人增殖细胞核抗原抗体（Proliferat

15、ive cell nuclear antigen antibody, PCNA）、二抗：FITC标记的羊抗鼠IgG。四、实验步骤1. 24孔板培养A549细胞。细胞应长到50%-70%汇合。2. 弃除每孔培养基，用冰冻100%甲醇固定细胞3分钟。3. 弃除甲醇，用PBS缓冲液洗三次，每次5分钟。4. 用NGS约500ul室温孵育10分钟。5. 加300u抗体工作液于待测孔和阳性对照孔，室温孵育30min。6. 用PBS缓冲液洗三次，每次5分钟。7. 加入稀释好的荧光标记二抗室温孵育30min。8. 用PBS洗5次，每次5分钟。9. 荧光显微镜下观察结果。五、实验结果1待测样品孔：可见不同亮度（

16、+，+）的绿色荧光，但是标有荧光的细胞数量不多。背景高2荧光抗体对照：细胞内未见明显的绿色荧光，但是背景高。3. 自发荧光对照：未见绿色荧光，无背景。4阳性对照：未做。因为本实验的检测蛋白即为其他实验的阳性对照。由此可以得出结论，待测样品细胞核中存在PCNA蛋白。六、讨论1.背景高的原因：封闭也为正常的山羊血清，第二抗体为FITC标记的羊抗鼠IgG，与封闭液具有同源性，所以背景高。孵育第二抗体后，冲洗不干净，也会造成背景高。2.待定性的核蛋白阳性率低的原因：背景高，直接导致很多信号不能确认是否为阳性；第一抗体的浓度低，与检测抗原的结合不够；第一抗体的孵育时间过短，4过夜，孵育效果更好。实验五

17、脂质体转染实验一、实验目的掌握将质粒等外源DNA导入真核细胞的方法二、实验原理外源核酸导入细胞的方法有病毒颗粒转导法、磷酸钙转染法、DEAE-葡聚糖转染法、DMSO（二甲基亚砜）转染法、脂质体介导法、显微注射（基因枪）、电穿孔等多种方法。其中最常用到的就是脂质体介导法。脂质体利用与细胞的脂质双层膜的结构类似，将夹带的外源DNA以胞吞的方式进入细胞质，甚至细胞核中。三、实验材料试剂：PBS缓冲液、DMEM、胰蛋白酶（0.25%+EDTA）、转染质粒、脂质体耗材：24孔细胞培养板、枪头（10ul、100ul、1000ul）、吸管四、实验步骤1.培养好的细胞接种细胞孔板，37的CO2培养箱培养，待细

18、胞密度为80%90%，约24h。2. 待转染质粒与脂质体混合物制备：A液：转染质粒0.8ug稀释至无血清DMEM培养基中50ul，混匀，室温放置5min；B液：脂质体2ul稀释至50ul无血清DMEM培养基中，混匀，室温放置5min；A、B液混匀，室温放置30min。3. 取出细胞孔板，弃培养液，用PBS液洗涤2次，待用。4. 到时间后，将混合物导入细胞中，加入1.5ml无血清DMEM培养基，37的CO2培养箱培养，6-8小时后可换10%胎牛血清DMEM培养液5.24小时后荧光显微镜观察荧光情况。6.拍照记录合适的细胞荧光结果。五、实验结果转染peGFP24小时后，观察结果（如图）：大部分A5

19、49细胞内表达了GFP绿色荧光蛋白，转染效率约达到60%。但是细胞状态不好，贴壁不牢。还有少量阳性细胞胞质回缩，可能死亡。上图为A549细胞转染进GFP 200六、讨论转染后细胞状态差，少量死亡的原因：1. 选取的待转染细胞，不是处于对数生长期，生长状况不佳。2. 脂质体的浓度过高，脂质体本身具有毒性，转进入细胞内的量多，产生了细胞毒性。3. 接种的细胞过密，转染后，细胞出现了密度移植，所以会有死细胞出现。影响转染效率的原因：1. 脂质体包裹质粒的作用时间不够，一般来说不少于30分钟。2. 包裹了质粒的脂质体在30min6h，都是稳定转染，在此时间内，转染时间越长，效率越高。6h后换有血清的培

20、养基，减少脂质体的毒性作用，转染后的细胞状态更好，阳性率会提高。实验六 PI染色法测细胞周期一、实验目的学习通过核酸染料-PI（碘化丙锭）标记细胞DNA，由流式细胞仪采集后进行细胞周期分析的方法。二、实验原理正常人静止体细胞有46条染色体，相当于7.10-12 pg DNA/细胞核，我们称之为二倍体细胞，而正常增殖细胞则存在不同的DNA含量。在细胞周期(G0，G1，S，G2 ，M)的各个时期，DNA含量随各时相呈现出周期性的变化：在G1期，细胞开始RNA和蛋白质的合成，但DNA含量仍保持二倍体；进入S期后，DNA开始合成，这时细胞核内DNA的含量介于G1和G2期之间；当DNA复制结束成为4倍体

21、时，细胞进入G2期，G2期细胞继续合成RNA及蛋白质，直到进入M期，因此，单纯从DNA含量无法区分G2期和M期；一旦有丝分裂发生，细胞分裂成两个子细胞，这两个子细胞或者进入下一个细胞周期，或者进入静止期(G0期)，而G0期从DNA含量上同样无法与G1期区分。因此，整个复制周期可以描述为G0/G1，S，G2/M期。通过核酸染料标记DNA，并由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出G0/G1，S及G2/M的百分含量，了解细胞的增殖能力；结合DNA指数分析，还可进行凋亡、异倍体等检测。三、实验材料1、 试剂：PBS（PH为7.2-7.4）、80%乙醇、PI染液（含PI、Trito

22、n X-100等）。 2、 耗材：吸头（10ul、100ul、1ml）、与吸头配套的加样枪、流式试管等 3、 仪器设备：流式细胞仪（488nm激发）四、实验步骤1. 开培养瓶，吸除瓶内旧培养液。2. PBS缓冲液洗2次。3. 向瓶内加入消化液10滴，轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面，室温进行消化5分钟。4. 5分钟后把培养瓶放置显微镜下进行观察，发现胞质回缩，细胞间隙增大，部分细胞开始脱落，立即终止消化。5. 用弯头吸管，吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，使细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液。6. 将细胞悬液转移至15mL离心管中，1000rpm/min，离心10分钟。弃上清，加入新鲜培养基适

23、量，重悬细胞，计数。7. 1106个细胞悬液中，加入2.5ml 80%冰冻乙醇，混匀。将细胞置4乙醇中固定过夜。8. 加入3ml室温PBS，混匀，离心，去上清。将管内细胞用手弹散，加入3ml室温PBS，使细胞水化15min。9. 离心，去上清，将细胞弹散，加1ml细胞周期染液，室温孵育30min。10. 上机分析。五、实验结果由流失细胞仪分析得到如下结果，详见附图1.G1期细胞占47.05%，S期为52.3%，G2期为0.65%。CV%值为6.392.细胞碎片很多，S期增加，未见明显的G2期。细胞的变异系数偏高。六、讨论1. 处理样品时，选用8001000rpm的离心转速，时间不超过10min

24、，本实验加PI染料前离心超过20分钟，可能导致产生大量的细胞碎片，G2期数量减少。大量碎片的产生，导致S期细胞数量的异常，CV%的偏高。2. 从直方图来看，图形较复杂，应尽量多收集检测细胞。细胞计数至少达到1106个。3. 细胞标本处理中，加入Rnase，或延长固定时间，延长RNA讲解时间，去除RNA的干扰。染色时间过长，PI会使细胞聚集，上机前过400滤膜，防止上机时，标本中的碎片堵塞进样孔，分析时，碎片的干扰。4. PH：PI在7.27.6，保持荧光染料分子与溶剂间的电离平衡。温度：温度高于20时，即出现温度淬灭。荧光染料浓度：染料太少，结合不完全。染料过多，又会出现浓度淬灭现象。固定剂：醛类固定剂会干扰插入性染料与核酸分子的结合，造成荧光发射强度减弱。