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1、生物分析中溶血对检测的影响及其对策生物分析中溶血对检测的影响及其对策 摘要液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术灵敏度高，选择性强，是目前体内药物分析的首选方法，但LC-MS/MS生物分析中仍面临着溶血样品测定失败的难题。溶血导致的样品测定数据不准确，将直接影响药物的药动学研究，如何进行溶血样品的测定已成为各国监管机构与全球生物分析行业探讨的重点。本文从溶血样品产生的原因进行分析，将溶血对检测的影响与作用方式以及溶血效应的考察方法进行了概述，最后对溶血样品的测定方法与策略进行探讨。关键词溶血；生物分析；串联质谱；色谱法，高压液相液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术是将分离能力强的液相

2、色谱与能够提供结构信息的串联质谱结合在一起，具有灵敏度高、选择性强的特点。LC-MS/MS技术的应用，可获得丰富、有效的化合物结构信息，建立快速、高效的分析研究体系，目前已成为体内药物分析的首选方法。体内药物分析的样品一般为人血浆或血清样品，涉及被测样品少，样品复杂及干扰物质多等问题，在实际测定工作中，采集的血浆或血清样品常出现溶血的现象。一项针对欧洲分析协会的调查显示溶血为方法学验证失败的原因之一，目前也有不少文献报道了溶血样品测定失败的案例，溶血样品测定过程中面临着溶血样品响应低、样品稳定性差以及基质效应等问题，导致阿托伐他汀、去氧肾上腺素、氟伏沙明等药物的检测失败。可见，溶血对测定的影响

3、成为体内药物分析领域中亟待解决的难题，同时也受到了各国监管机构的广泛关注。中国药典2015版生物样品定量分析指导原则指出“除正常基质外，还应关注其他样品的基质效应，例如溶血或高血脂的血浆样品等”。欧洲药品管理局（EMA）同样要求考察溶血样品的基质效应。而巴西国家卫生监督局（ANVISA）的要求则更加明确，基质效应需分析八个不同来源的样品，包括4个正常血浆样品、2个脂血样品以及2个溶血样品。与此同时，美国政府在近年的白皮书中也多次讨论溶血样品的测定问题。然而各国监管机构的要求都相对模糊，缺乏明确的做法与标准，因此溶血样品的检测仍面临着严峻的挑战，广大研究者应引起重视。本文结合溶血样品测定现状，对

4、溶血样品测定失败问题进行全面分析与总结，并探讨了溶血测定失败的解决方案，从而保证生物分析结果的准确性。溶血样品的产生溶血是指红细胞破裂，血红蛋白逸出释放到血浆或血清中。一项针对18项临床生物等效性（bioequivalency，BE）试验的10640个样品的调查显示，溶血样品为211个，占样品总量的1.98%。溶血会造成血浆或血清颜色与密度的改变，溶血血浆根据溶血程度不同颜色呈粉红色或红色；溶血的血浆中血红蛋白、胆红素、磷脂等生理成分增加，血浆的密度发生改变。据报道，溶血的血浆中血红蛋白的含量大于200gmL-1，远大于非溶血血浆中血红蛋白的量。溶血可发生在体内与体外，造成溶血的因素也十分复杂

5、。溶血的发生可能是患者疾病状态、生理状况等体内因素导致的；也可能是抽血所用针头太小、抽血速度过快、过度震荡以及离心时转速过快等体外因素导致的；转运、储存过程不当也会造成溶血。其中，体外因素是造成溶血的主要原因。临床试验的血浆或血清样品一般是在不同时间点采集的，涉及周期长，影响因素多，溶血样品的产生很难避免，因此研究人员需提前做好人员培训，密切关注血样采集的全过程，减少采集、离心、冻存及转移任一环节可能发生的溶血。溶血对测定的影响溶血血浆或血清中许多生理成分明显增加，如血红蛋白、胆红素、磷脂等，这些成分可能会影响溶血样品中药物的检测。目前，许多文献就溶血样品检测失败的问题进行了相关报道。HUGH

6、ES等采用LC-MS/MS技术测定血浆中卡维地洛及其代谢物的浓度，原型药物卡维地洛可准确测定，而代谢物4-羟基卡维地洛与5-羟基卡维地洛测得的浓度显著降低，只有理论浓度的0.2%；测定奥氮平时，溶血样品较正常血浆样品出现明显的离子抑制现象，奥氮平与内标奥氮平-d3的响应降低约500倍，导致奥氮平与内标均无法测定；而阿托伐他汀的溶血样品内标附近会出现明显的干扰峰，影响阿托伐他汀低浓度样品的定量。BERUBE等的研究表明，溶血样品中的血红蛋白会造成吗啡的氧化与降解。文献中CARTER等在进行沙丁胺醇方法验证时，发现可准确定量1%与2%溶血的血浆样品，无法准确定量5%溶血的血浆样品（1%溶血指血浆样

7、品中破碎的红细胞的比率为1%，V/V）。可见溶血对药物测定的影响是广泛存在的，研究表明溶血还会影响血浆中肾上腺素、氟伏沙明、水杨酸、阿塞那平等药物的LC-MS/MS分析。通过以上研究发现，溶血可使目标分析物的响应下降，实测浓度偏低，溶血对药物测定的影响程度根据药物的性质及溶血程度的差异而不同，而溶血影响检测的作用方式也会根据药物性质的差异而不同。以下总结了几种溶血影响药物的LC-MS/MS分析的常见方式：（1）影响药物的稳定性，红细胞破裂释放的酶可能造成药物在溶血血浆中不稳定，研究表明激素、维生素、吗啡等在溶血血浆中稳定性受到影响；（2）影响与红细胞有高亲与力的药物，使测定浓度比实际浓度偏高，

8、药物浓度可高数百倍，如轻微的溶血现象可使甲醋唑胺的浓度显著提高；（3）影响血浆结合率高的药物，细胞内液造成药物稀释，测定浓度比实际浓度偏低；（4）溶血使细胞生理成分增加，造成离子抑制或增强，基质效应显著，影响目标分析物的测定。因此，我们将基质中所含破碎红细胞对分析物定量的影响，统称为溶血效应。红细胞破碎导致的基质效应是溶血效应最主要的表现方式，也是基质效应的一种特殊形式。同时，溶血效应也可表现在影响药物稳定性与响应等方面。溶血效应可能使药物检测的准确度、精密度不符合要求，最终导致研究数据被拒绝。特别是对于cmax与末端点，可能造成的浓度偏移或药物浓度-时间曲线点的缺失，均会严重影响药物药动学研

9、究的数据计算，导致临床研究结果不完整。因此，LC-MS/MS生物分析中应特别关注溶血样品的测定，在方法验证中应考察溶血效应。溶血效应的考察在方法验证过程中，应进行溶血试验，考察溶血效应。一般可分为三步，首先考察目标分析物在溶血基质中是否稳定，是否需要更低的存储温度或添加稳定剂；其次进行溶血样品基质效应的考察，确定基质效应的大小；最后进行溶血试验，考察溶血质控样品的精密度、准确度与重现性。药物在溶血基质中是否稳定，应首先进行考察。若药物在溶血基质中不能保持稳定，则检测得到的数据不能反映试验中药物的真实浓度。研究者应考虑造成药物不稳定的因素，若为红细胞破裂释放的酶造成药物的不稳定的情况，可考虑添加

10、酶抑制剂或其他稳定剂；若为溶血基质储存温度不当，也可考虑降低储存温度，从-20降到-80。该研究情况也应及时告知临床研究中心与生物分析实验室，保证样品采集与存储过程中的稳定性。其次，研究者应关注溶血导致的基质效应。溶血样品的基质效应可能是红细胞破碎释放的内源性的物质如盐、脂质、磷脂等引起的。如何进行溶血样品基质效应的考察成为探讨的重点。通常通过向血浆中添加不同比例的红细胞破裂的全血来模拟溶血基质，溶血基质的制备方法因实验室而异。有的实验室通过反复冻融破裂红细胞；有的通过机械震荡的方式破碎红细胞；还有通过在-20或-70冷冻数小时的方式破碎全血中的红细胞。然后将目标分析物在溶血基质中的响应与非溶

11、血基质或工作液的响应进行比较，进行基质效应因子的计算。除关注溶血导致的基质效应，还应关注溶血导致的其他问题，如干扰药物测定的杂质峰的出现，影响药物响应等，研究者可以通过溶血试验进行考察。溶血试验即通过配制目标分析物溶血与非溶血质控（quality control，QC）样品，前处理后进样分析，比较其在溶血样品与非溶血样品中响应或浓度的差异，考察溶血效应。鉴于大于2%溶血的生物样品（即基质含破碎红细胞的量大于2%）是极少见的，建议溶血试验中考察2%溶血的样品即可。研究者可分别配制2%溶血与非溶血的低高浓度QC样品（n=6），前处理后进样分析，溶血试验的接受标准为每浓度组内的变异系数（coeffi

12、cient of variation，CV）在15%以内，且溶血样品与非溶血样品的平均响应或浓度差异在15%之内。若开发的方法无法通过溶血试验，可考虑溶血基质与目标分析物是否充分孵育；也可降低溶血程度后再次进行溶血试验；同时分析实际样品中溶血样品的数量及所处药物浓度-时间曲线的位置，评估重新开发方法的必要性或统计分析中不纳入受溶血影响的数据。溶血样品测定的建议1 溶血样品的判断建立一个对溶血不“敏感”的LC-MS/MS检测方法，完成方法学的验证是进行溶血样品检测的前提条件，而在实际样品的测定过程中，第一步需完成溶血样品的鉴别与判断。一项研究表明，有74%的研究者通过视觉直观判断，将溶血样品与非

13、溶血样品进行区分；20%通过比色卡进行判断，其余的通过临床仪器进行区分。然而，视觉分析具有一定的主观性且无法将2%及更高程度的溶血样品区分，比色卡尚未有统一的标准，仪器检测过于繁琐，溶血样品的判断面临着严峻的挑战。研究者可通过制备溶血样品，绘制本实验室的溶血比色卡，建立溶血样品判断的标准操作规程，使溶血样品的判断规范化与准确化，并根据样品的溶血程度进行下一步的检测。若测定过程中出现溶血程度远高于方法验证中考察的溶血水平，研究者可将溶血程度高的样品以正常血浆稀释后再进行测定，减少溶血效应。2 优化分析条件在检测过程中遇到溶血样品检测失败，还可通过优化LC-MS/MS方法，增加灵敏度，减少溶血效应

14、。根据药物的结构、解离常数与极性大小，选择合适的色谱条件与质谱条件。2.1 优化色谱条件通过改善色谱分离，避免待测物与基质成分一同出峰，常常可以有效地消除基质效应。在阿托伐他汀的检测中，HUGHES等通过调节流动相中有机相与水相的比例，将溶血样品中的干扰峰与内标物分开。改善色谱分析条件，适当地延长待测组分的保留时间，也有利于减少基质对测定的影响，MATUSZEWSKI等在分析人血浆中的非那雄胺时通过增加待测物的保留时间，从而成功地使待测物与基质分离开来。梯度洗脱是LC-MS/MS分析中最常用的洗脱方式，梯度洗脱通过逐渐改变流动相的洗脱强度，使各组分能很好地被先后洗脱出来。同时，不同的色谱柱分离

15、效果不同，对基质效应产生不同的影响，选择适合类型的色谱柱对样品分析至关重要。2.2 优化质谱条件研究者通过优化质谱调节，选择合适的离子源及质谱参数，有助于提高灵敏度，避免基质效应。LC-MS/MS常用的离子源包括大气压光喷雾电离源（APPI）、大气压化学电离源（APCI）、电喷雾电离源（ESI），不同的电离方式对基质效应的影响不同，这3种离子源克服基质效应的能力依次为：APPIAPCIESI，但并不意味者所有的样品都应选择基质效应小的离子源，卤米松、辛伐他汀等在ACPI模式下的响应则不如ESI。研究者应综合多方面的考虑因素，选择合适的离子源。同时，改变质谱裂解参数也有助于消除基质效应。2.3

16、优化样品前处理过程在检测过程中遇到溶血样品检测失败，可通过优化样品前处理过程，尽可能去除血浆中的生理性成分，减少溶血效应。可优先选择固相萃取（SPE）与液液萃取（LLE）进行前处理，获得更洁净的样品；对于使用蛋白沉淀方法处理的样品，灵敏度高可稀释后再进样分析；可直接减少前处理中基质的体积。文献中采用SPE处理卡维地洛后，无法准确定量溶血样品中卡维地洛代谢物，样品处理后萃取物颜色异常，提示血红蛋白或胆红素被一起提取出来，因此在SPE处理前先进行蛋白沉淀，尽可能去除溶血释放的血红蛋白等，并在SPE处理中多添加一步酸洗，去除残留的溶血成分。通过优化前处理过程，使溶血样品中的目标分析物卡维地洛可被准确

17、定量分析。2.4 使用同位素内标建议使用同位素标记的内标。文献中测定去氧肾上腺素时，采用结构类似物-（甲氨甲基）苯甲醇作为内标，去氧肾上腺素的溶血试验结果显示高低浓度的去氧肾上腺素溶血QC样品与非溶血QC样品间的差异均超过了15%，而更换为同位素内标去氧肾上腺素-d3后可满足测定要求。-（甲氨甲基）苯甲醇与去氧肾上腺素结构只有一个羟基的差异，但其作为内标与同位素内标的试验结果却截然不同，这种差异可能是目标分析物去氧肾上腺素与结果类似物内标-（甲氨甲基）苯甲醇在溶血基质中的回收率不一致导致的，这种现象提示研究者在分析过程中采用结构类似物作为内标是存在一定风险的。同时，WU等的研究也表明选用同位素

18、内标可获得更好的测定结果。由于同位素内标与目标分析物的结构性质一致，可修正分析物与内标因基质中回收率的差异而对结果带来的影响。同时，中国药典2015版生物样品定量分析指导原则也指出“当在生物分析方法中使用质谱检测时，推荐尽可能使用稳定同位素标记的内标”。2.5 溶血样品的试验样品再分析（incurred sample reanalysis，ISR）试验试验样品再分析是采用LC方法进行生物体内药物分析的重要环节，由于生物基质的复杂性，药用辅料的多样性与试验样本的特异性，ISR是评估分析方法固有缺陷的关键指标之一。目前，FDA、EMA及中国药典2015版生物样品定量分析指导原则均建议进行ISR试验

19、，因为在方法验证中使用的校正标样与QC样品可能无法模拟实际试验样品，例如，蛋白结合、已知与未知代谢物的回复转化、样品均一性或同服药物引起的差异。研究者可通过在不同时间后，用已验证的方法在另外一个分析批次中重新分析试验样品，并与第一次分析结果进行比较，来评价实际样品测定的准确度。而对于溶血样品，基质更为复杂，包含红细胞破碎释放的盐、脂质、磷脂与酶类，方法验证中的QC样品能否模拟实际样品更有待考察。因此建议研究者在ISR试验中，应选择一定比例的溶血样品，评价溶血样品分析的重现性，确保研究结果的真实可信。结语溶血对LC-MS/MS分析药物的影响程度与方式根据样品的溶血情况与药物的性质差异而不同，但溶血效应均会造成未知溶血样品测定结果的不准确，进而影响临床试验的质量。因此，建议研究者在方法验证阶段考察溶血效应，关注样品的溶血程度与药物的理化性质，采取必要的措施减少溶血效应。溶血对生物样品检测的影响虽受到各国监管机构以及生物检测分析组织的重视，但仍缺乏具体的做法与要求，溶血样品的判断及溶血样品的测定均面临着严峻的挑战，望各监管机构能够出台更明确的实验设计方案及接受标准，帮助广大研究者建立一个可靠的、符合法规的溶血样品测定方法，确保研究结果的准确性与合规性，促进生物分析行业的进步与发展。参考文献（略）