国家自然基金成功申请范本.docx

1、国家自然基金成功申请范本国家自然基金成功申请范本1(一)立项依据与研究内容 1项目的立项依据心肌纤维化是指在心肌的正常组织结构中胶原纤维过量积聚、心脏组织中胶原浓度显著升高或胶原成分发生改变。这种病理变化在多种心血管疾病中存在，现认为其与心律失常、心功能障碍甚至心脏性猝死密切相关。心肌纤维化是一种连续变化的过程，根据有无心肌细胞缺失、坏死和瘢痕形成可分为反应性纤维化和修复性纤维化，前者根据病变特点又分为间质纤维化和血管周围纤维化，引起心脏结构重塑（remodling），并由此引起舒张、收缩功能不全，最终导致心力衰竭；后者主要表现为心肌细胞坏死和瘢痕形成，并可有心脏功能的异常。基于心肌纤维化已成

2、为慢性心功能不全难以逆转的原因之一，常导致严重的后果，因此研究切实有效的防治措施受到高度关注。心肌纤维化是胶原合成代谢和降解代谢失衡的结果，如心衰时心肌细胞及心肌间质细胞的丢失、心肌成纤维细胞活化包括增殖及表型转变、心肌成纤维细胞合成和分泌的胶原蛋白成分改变引起的I型和III型胶原含量的比值变化等因素，均促进了心肌胶原的大量沉积，再加上促胶原蛋白降解的基质金属蛋白酶的表达和活性下降，共同作用导致胶原的合成大大增加而降解大大降低，导致心肌纤维化的发生。心肌纤维化的形成机制非常复杂，长期的压力过负荷、炎症反应、氧化应激等都参与了心肌纤维化的形成，而上述刺激因素均会引起内源性的心脏旁/自分泌系统的调

3、控紊乱，其中研究较清楚的包括内源性的肾素血管紧张素醛固酮系统（renin-angiotensin-aldosteron system, RAAS）、内皮素（endothelin，ET）一氧化氮（nitric oxide，NO）系统、血小板衍生的生长因子（platelet derived growth factor, PDGF）血栓素2（thromboxane, TxA2）系统等，心脏的这些旁/自分泌系统不仅诱导心肌损伤，也是心肌纤维化的促进因子，但至今为止内源性的抗心肌纤维化防御体系则研究甚少，作用尚不清楚，近年来引起了高度关注。近年来研究发现一种古老的多肽，松弛素，是迄今发现的最强的内源性抗

4、纤维化物质之一，是最具前景的内源性抗纤维化物质。松弛素（relaxin，RLX）是1926年，Hisaw从怀孕的猪黄体细胞中提取的妊娠相关激素，能松弛耻骨韧带、软化宫颈，促进分娩。Relaxin是胰岛素样生长因子超家族的一员，在人及其他一些高等灵长动物体内有3种类型，分别为H1，H2，H3，其中H2是组织储存及血液循环中存在的主要形式；在啮齿动物存在两种RLX类型，分别为RLX-1（相当于H2）和RLX-3（相当于H3）。后来研究发现，在非妊娠期的妇女及男性体内多种组织都有relaxin的表达，推测relaxin不仅是一种生殖激素，可能还具有多种生物学效应。但直至2000年，人们利用同源分析的

5、方法发现并克隆了孤儿受体LGR7（leucine rich repeat containing, G protein coupled receptors, LGR），随后证实RLX为其内源性配体，这一发现使relaxin的功能研究进入了一个崭新的阶段，就此2002年，Science杂志就曾发表社评文章，指出对relaxin功能的重新认识有着深远的影响。Relaxin是体内广泛分布的多功能活性多肽，不仅调节生殖系统功能，还参与神经垂体激素的分泌、大脑发育和心血管系统功能稳态等广泛生理过程的调节，在肿瘤的发展和转移及其心血管疾病发病中均具有重要的病理生理意义， 其中relaxin强大的抗纤维化效应

6、尤为受人关注。在relaxin基因敲除的小鼠及其受体LGR7基因敲除的小鼠全身各脏器均出现严重的纤维化，早期补充使用relaxin可阻止肺纤维化、肺泡实质化、支气管上皮肥厚等病理变化发生；在溴化乙胺诱导的小鼠出现肾脏间质纤维化、肾小球滤过率下降及蛋白尿，补充relaxin有效的抑制了间质纤维化，改善肾功能。在肝脏，relaxin同样减弱了I型胶原的合成。既往的研究认为在心肌细胞relaxin及其受体的表达很低，心肌局部旁/自分泌的relaxin在心肌纤维化中的作用不被关注。2005年，我们课题组首先在国外杂志上报道了relaxin对心血管疾病的保护作用：在亚急性异丙肾上腺素（isoproter

7、enol, ISO）(Peptides，2005 Sep；26：1632-1639)诱导的大鼠心肌坏死、纤维化的模型上，心脏内源性的relaxin表达、合成显著增加，外源性给予relaxin可以明显改善心功能，减轻心肌缺血损伤，抑制心肌纤维化，据此我们认为relaxin是一种内源性的心脏保护物质。我们的工作虽然发表时间不长，但已受到了学术届的高度关注，当年即被SCI文献引用。但relaxin的抗心肌纤维化的机制远未阐明。目前研究认为relaxin可能是通过下列途径发挥作用的：1、relaxin能显著的抑制纤维母细胞的增殖；2、relaxin抑制胶原的合成、分泌及在组织中的沉积；3、relaxi

8、n抑制纤维形成过程中其他基质成份的表达上调，如纤维结合蛋白、弹性蛋白纤维、原纤维蛋白2及氨基葡聚糖等；4、relaxin刺激多种基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMP）的表达和活性，抑制金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitors of metalloproteinase, TIMPs)的表达和活性。但在不同的种属、不同的组织器官、不同病因诱导的纤维化中，relaxin抗纤维化的作用及机制均不相同。与其他组织器官的纤维化的发病不同，心肌纤维化的发生与其自身的旁/自分泌活性物质AngII、醛固酮的功能紊乱关系更为密切，在多种因素诱导的心肌纤维化中都

9、伴随心肌AngII、醛固酮基因表达和活性的增强。Relaxin是一种心血管活性物质，心肌能合成和分泌relaxin1、relaxin3，并且在心室和心房均富含LGR7受体。有文献报道在中枢系统，relaxin抑制AngII的表达，参与中枢渗透压的调节，但内源性的relaxin对心肌旁/自分泌的AngII及醛固酮有何影响及相应的作用靶点尚未见报道。我们的假说是relaxin可能通过作用于心脏旁/自分泌的AngII及醛固酮系统，拮抗心肌纤维化，是机体抗纤维化的内源性防御体系。本项目拟于在体和离体大鼠心肌纤维化模型上，观察内源性relaxin1/3及其受体LGR7的表达和功能的变化；以纤维母细胞的增

10、殖与表型转变和心肌胶原代谢的MMPs/TIMPs系统的表达及活性变化为主要指标，观察relaxin处理对心肌纤维化发展的影响；观察relaxin对心肌内源性促纤维化系统血管紧张素/醛固酮系统的拮抗作用及其作用机制，以论证relaxin是机体抗纤维化的重要内源性防御因子的假说，探讨其抗心肌纤维化的细胞分子机制，以期探寻心肌纤维化发病的新机制和防治的新策略。 参考文献：1 Hisaw FL: Experimental relaxation of the pubic ligament of the guinea pig. Proc Soc Exp Biol Med 1926, 23:661-663.

11、2 Samuel CS. Relaxin: antifibrotic properties and effects in models of disease. Clin Med Res. 2005 Nov;3(4):241-9.3 Samuel CS, Zhao C, Bathgate RA, Du XJ, Summers RJ, Amento EP, Walker LL, Mc Burnie M, Zhao L, Tregear GW. The relaxin gene-knockout mouse: a model of progressive fibrosis.Ann N Y Acad

12、Sci. 2005 May;1041:173-81.4 Sherwood OD. Relaxins physiological roles and other diverse actions. Endocr Rev. 2004 Apr;25(2):205-34.5 Bennett RG, Kharbanda KK, Tuma DJ. Inhibition of markers of hepatic stellate cell activation by the hormone relaxin. Biochem Pharmacol. 2003 Sep 1;66(5):867-74.6 Zhang

13、 J, Qi YF, Geng B, Pan CS, Zhao J, Chen L, Yang J, Chang JK, Tang CS. Effect of relaxin on myocardial ischemia injury induced by isoproterenol. Peptides. 2005 Sep; 26(9):1632-9.7. Lekgabe ED, Kiriazis H, Zhao C, Xu Q, Moore XL, Su Y, Bathgate RA, Du XJ, Samuel CS. Relaxin reverses cardiac and renal

14、fibrosis in spontaneously hypertensive rats.Hypertension. 2005 Aug;46(2):412-8.8. Mookerjee I, Tang ML, Solly N, Tregear GW, Samuel CS. Investigating the role of relaxin in the regulation of airway fibrosis in animal models of acute and chronic allergic airway disease. Ann N Y Acad Sci. 2005 May;104

15、1:194-6.9. Bennett RG, Mahan KJ, Gentry-Nielsen MJ, Tuma DJ. Relaxin receptor expression in hepatic stellate cells and in cirrhotic rat liver tissue. Ann N Y Acad Sci. 2005 May;1041:185-9.10. Richard Ivell. This hormone has been relaxin too long. Science 2002; 295: 637-638.2项目的研究内容、研究目标及拟解决的关键问题研究目标

16、：本项目拟于在体和离体大鼠心肌纤维化模型上，观察内源性relaxin1/3及其受体LGR7的表达和功能的变化；以纤维母细胞的增殖与表型转变和心肌胶原代谢的MMPs/TIMPs系统的表达及活性变化为主要指标，观察relaxin处理对心肌纤维化发展的影响；观察relaxin对心肌内源性促纤维化系统血管紧张素/醛固酮系统的拮抗作用及其作用机制，以论证relaxin是机体抗纤维化的重要内源性防御因子的假说，探讨其抗心肌纤维化的细胞分子机制，以期探寻心肌纤维化发病的新机制和防治的新策略。研究内容：1、以ISO诱导的大鼠亚急性心衰及腹主动脉结扎诱导的大鼠慢性心衰分别作为修复性心肌纤维化和反应性心肌纤维化的

17、模型，分别观察心脏内源性的relaxin1/3的mRNA表达和放免活性、LGR7的mRNA和蛋白表达及受体亲和力的变化；观察分别外源性的给予relaxin1或relaxin3后，对心肌血管紧张素II、醛固酮表达和活性、对它们的受体表达和亲和力的影响；及心肌羟脯氨酸含量、I型及III型胶原蛋白的mRNA及蛋白表达、基质成分如纤维结合蛋白、弹性蛋白纤维、原纤维蛋白2及氨基葡聚糖等的表达、心肌MMP-1、2、9、13、TIMPs-1的mRNA及蛋白表达及活性的变化，以确定relaxin的抗心肌纤维化作用，并筛选其作用的靶分子。2、在上述工作的基础上，分别以血管紧张素II、醛固酮处理原代培养的乳鼠心肌

18、成纤维细胞，观察心肌细胞relaxin1/3的mRNA表达和放免活性、LGR7的mRNA和蛋白表达及受体亲和力的变化；观察分别予以relaxin1或relaxin3预处理及心肌成纤维细胞转染表达relaxin的腺病毒，内源性的高表达relaxin后，心肌成纤维细胞的增殖及上述整体试验中初步确定的靶分子的表达和活性的变化，及血管紧张素II受体和醛固酮受体的表达和亲和力的改变，进一步确定relaxin的抗心肌纤维化作用及其作用的靶分子。3、为了进一步阐明relaxin为抗纤维化的内源性防御体系，在血管紧张素II处理原代培养的乳鼠心肌成纤维细胞，观察relaxin预处理后，AngII诱导心肌纤维化发

19、生的分子信号如MAPK/ERK、原癌基因C-fos、活素蛋白AP-1、转化生长因子TGF的mRNA和蛋白表达及活性的变化；在醛固酮处理原代培养的乳鼠心肌成纤维细胞，观察relaxin预处理后，醛固酮诱导心肌纤维化发生的分子信号如血管紧张素受体I（AT1）、AP-1、核转录因子NF-B、碱性成纤维细胞生长因子bFGF的mRNA和蛋白表达及活性的变化，确定relaxin抑制RAAS诱导心肌纤维化的分子靶点。4、在上述研究的基础上，进一步观察relaxin抑制心肌纤维化的细胞内信号转导机制。在原代培养的乳鼠心肌成纤维细胞，分别利用腺苷酸环化酶（adenyl cyclase,AC）、PKA、过酪氨酸激

20、酶（tyrosine kinase, TK）、磷酸二酯酶（phosphodiesterase, PDE）、Erk1/2及PI3K/Akt的激动剂和拮抗剂，以上述试验中确定的靶分子的表达和活性的变化为指标，确定relaxin抑制心肌纤维化的信号转导机制。拟解决的关键问题： 确证Relaxin为机体抗纤维化的内源性防御体系，探讨relaxin抗心肌纤维化的机制及分子信号转导通路。（1）在整体、离体的纤维化模型上，观察内源性relaxin及其受体的变化，及外源性补充relaxin的抗心肌纤维化效应。（2）确定relaxin抗心肌纤维化的作用靶点及相应的信号通路。（3）确定relaxin对心肌RAAS

21、系统的影响及其抑制RAAS作用的分子靶点。3拟采取的研究方案及可行性分析拟采取的研究方案1、确定relaxin的抗心肌纤维化作用，筛选其作用的靶分子。大鼠腹腔注射ISO诱导大鼠亚急性心衰，大鼠腹主动脉结扎诱导的大鼠慢性心衰，分别复制修复性心肌纤维化和反应性心肌纤维化的模型。通过组织切片、天狼星红染色观察心肌纤维化，利用生化方法测定心肌羟脯氨酸含量。采用Real-Time PCR或Northern Blot方法检测心肌relaxin及其受体LGR7的mRNA表达；采用放射免疫方法测定心肌组织relaxin的放免活性，用同位素标记的relaxin进行受体Binding实验，测定LGR7受体的亲和力

22、。利用免疫组化及Western Blotd 方法检测平滑肌actin（-SMA）的表达和组织分布；利用Real-Time PCR、Western Blot的方法测定I型及III型胶原蛋白的mRNA及蛋白表达、基质成分如纤维结合蛋白、弹性蛋白纤维、原纤维蛋白2及氨基葡聚糖等的表达、心肌MMP-1、2、9、13、TIMPs-1的mRNA及蛋白表达，利用放射性同位素109Cd测定MMPs酶的活性。采用Real-Time PCR或Northern Blot方法检测心肌AngII、醛固酮及其受体的mRNA表达；采用放射免疫方法测定心肌组织AngII、醛固酮的放免活性，用受体Binding实验，测定Ang

23、II、醛固酮受体的亲和力。上述测定方法本课题组均熟练掌握。2、确定relaxin的抗心肌纤维化作用及其作用的靶分子。分别以血管紧张素II、醛固酮处理的原代培养的乳鼠心肌成纤维细胞为心肌纤维化模型，采用3H-胸腺嘧啶（TdR）入测定心肌成纤维细胞的增殖，免疫组化及Western Blotd 方法检测平滑肌actin（-SMA）的表达和细胞定位说明成纤维细胞表型的改变，天狼星红染色观察心肌成纤维细胞胶原含量。采用Real-Time PCR或Northern Blot方法检测心肌relaxin及其受体LGR7的mRNA表达；采用放射免疫方法测定心肌组织relaxin的放免活性，用同位素标记的rela

24、xin进行受体Binding实验，测定LGR7受体的亲和力。构建relaxin表达质粒，进行重组腺病毒的包装、克隆化、扩增、纯化和滴定测定后，转染乳鼠心肌细胞，造成relaxin高表达。利用Real-Time PCR、Western Blot的方法测定以确定的靶分子mRNA及蛋白表达，利用放射性同位素109Cd测定酶的活性。采用Real-Time PCR或Northern Blot方法检测细胞AngII、醛固酮受体的mRNA表达，用受体Binding实验，测定AngII、醛固酮受体的亲和力。上述测定方法本课题组均熟练掌握。3、确定relaxin抑制RAAS诱导心肌纤维化的分子靶点。在AngII

25、诱导的心肌纤维化组，利用Real-Time PCR、Western Blot的方法测定MAPK/ERK、原癌基因C-fos、活素蛋白AP-1、转化生长因子TGF的mRNA和蛋白表达，以同位素32P标记的ATP，放免测定或磷酸化的MAPK抗体进行Western Blot测定MAPK的活性，观察relaxin作用的分子靶点；在醛固酮诱导的心肌纤维化组，利用Real-Time PCR、Western Blot的方法测定AT1、AP-1、NF-B、bFGF的mRNA和蛋白表达，并利用荧光染色共定位的方法测定NF-B的转位，观察relaxin作用的分子靶点。上述测定方法本课题组均熟练掌握。4、确定rel

26、axin抑制心肌纤维化的信号转导机制。根据以上研究，以relaxin作用的主要信号转导通路为切入点，如腺苷酸环化酶（adenyl cyclase,AC）、PKA、过酪氨酸激酶（tyrosine kinase, TK）、磷酸二酯酶（phosphodiesterase, PDE）、Erk1/2及PI3K/Akt，利用工具药（阻断剂和激动剂），并且直接采用酶学方法测定酶活性及Western Blot方法观察其表达、活化（磷酸化或去磷酸化），深入研究relaxin作用的信号转导机制。上述测定方法本课题组均熟练掌握。可行性分析Relaxin是迄今发现的最强的抗纤维化物质之一，对多种脏器如肝、肺、肾及皮肤

27、的纤维化均有强大的抑制作用。本课题组的前期工作提示relaxin具有较强的心肌保护及抑制心肌纤维化的作用，但relaxin抗心肌纤维化的作用尚不清楚。本项目对relaxin抗心肌纤维化的机制及信号转导通路进行研究，确定内源性relaxin为机体内源性抗纤维化的防御体系是前期工作的深入和延续。本项目中采用的动物模型和刺激因素皆为国际通用的经典模型和药物，本课题组已熟练掌握构建质粒、基因重组及转染、RT-PCR、Northern Blot及Western Blot的技术和方法，并熟悉项目所涉及的生化指标测定和生理功能测定的方法和技术。4本项目的特色与创新之处大量研究表明，Relaxin对皮肤、肝脏

28、、肾脏及肺等多种组织器官具有显著的抗纤维化作用，我们前期工作也报道了relaxin改善ISO处理的大鼠心功能，抑制心肌纤维化，在国际杂志发表后引起了学术界的高度关注和评价，但有关relaxin抑制心肌纤维化的机制尚不清楚。与其他组织器官纤维化的发病不同，心肌纤维化与其自身的旁/自分泌活性物质AngII、醛固酮的功能紊乱关系更为密切，在多种因素诱导的心肌纤维化中都伴随心肌AngII、醛固酮基因表达和活性的增强，心脏内源性的relaxin系统是否通过对AngII、醛固酮的调节，实现抗心肌纤维化的作用，尚未见报道。通过此研究，我们将首次证实在心肌纤维化发展中，内源性relaxin系统的变化及rela

29、xin对RAAS系统的影响及作用靶点，确定relaxin是机体内源性抗纤维化的防御体系，并确定relaxin抗心肌纤维化的分子信号转导通路。5年度研究计划及预期研究结果2007.12007.8： 在ISO诱导的大鼠亚急性心衰及腹主动脉结扎诱导的大鼠慢性心衰模型上，观察心脏内源性的relaxin1/3、LGR7表达的变化；研究外源性给予relaxin1或relaxin3后，心肌纤维化个指标的变化，以确定relaxin的抗心肌纤维化作用，并筛选其作用的靶分子。2007.92008.12：在血管紧张素II、醛固酮诱导的原代培养的乳鼠心肌成纤维细胞纤维化的模型上，观察心脏内源性的relaxin1/3、

30、LGR7表达的变化；研究构建表达relaxin的腺病毒，转染心肌成纤维细胞引起内源性的高表达relaxin，及分别予以relaxin1或relaxin3预处理后，心肌成纤维细胞的增殖及上述整体试验中初步确定的靶分子的表达和活性的变化，进一步确定relaxin的抗心肌纤维化作用及其作用的靶分子。2009.12009.12：在原代培养的乳鼠心肌成纤维细胞，分别利用relaxin作用的激动剂和拮抗剂，以上述试验中确定的靶分子的表达和活性的变化为指标，确定relaxin抑制心肌纤维化的信号转导机制。研究relaxin预处理后，AngII及醛固酮诱导心肌纤维化发生的分子信号的mRNA和蛋白表达及活性的变

31、化，确定relaxin抑制RAAS诱导心肌纤维化的分子靶点。预期结果：通过上述研究，预计发表SCI 文章2-3篇，培养1-2名研究生。（二）研究基础与工作条件1. 工作基础本课题组一直致力于内源性的心血管活性物质的心血管效应及其机制研究，并首先报道了尾加压素II、肾上腺髓质素、ghrelin及apelin等多种心血管旁自分泌物质在心血管疾病中的作用及可能机制。2003年始，我们室即开始关注relaxin的抗纤维化效应，并跟踪报道了国际上有关relaxin的重大事件，同时2005年，我们实验室首先在国外杂志上报道了relaxin在亚急性异丙肾上腺素 (Peptides，2005；26：1632-

32、1639)诱导的大鼠心肌坏死、纤维化的模型上，心脏内源性的relaxin表达、合成增加，外源性给予relaxin可以明显改善心功能，减轻心肌缺血损伤，抑制心肌纤维化，据此我们认为relaxin是一种内源性的心脏保护物质。我们的工作虽然发表时间不长，但已受到了学术届的高度关注，当年即被SCI引用，但relaxin的作用机制还有待于进一步深入研究。已发表与relaxin相关的文章：1. Zhang J, Qi YF, Geng B, Pan CS, Zhao J, Chen L, Yang J, Chang JK, Tang CS. Effect of relaxin on myocardial ischemia injury induced by isoproterenol. Peptides. 2005 Sep; 26(9):1632-9.2. 张靓，唐朝枢。松弛素的心血管调节作用，国外医学生理病理科学与临床分册，2004.5。3. 张靓，唐朝枢。第四届国际松弛素及其相关肽会议在美召开，生理科学进展，2005.1。2工作条件申请者所在单位北京大学医学部生理与病理生理学系（国家重点学科）和北京大学心血管研究所（教育部分子生物学重点实验室）