DNA定点突变实验.docx

1、DNA定点突变实验DNA定点突变实验 实验方法原理 定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。 单点突变的原理是从常规E.coli中经纯化试剂盒(Miniprep)或者氯化铯纯化抽提得到质粒。设计一对包含突变位点的引物（正、反向），和模版质粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循环延伸”，(所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5端终止，再经过反复加热褪火延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝。)正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的

2、开环质粒。DpnI酶切延伸产物，由于原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对DpnI敏感而被切碎（DpnI识别序列为甲基化的GATC，GATC在几乎各种质粒中都会出现，而且不止一次），而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。 多点突变的原理是准备多个带突变的引物（同方向，对同一单链模版），退火后全部突变引物（不超过5个）都结合在同一环状单链模版，PfuTurbo聚合酶延伸，碰到下一个引物就停止，各片断经连接成环，和单链模版组成杂和环，Dpn I消化双链模版，也消化杂和环中的模版，只留下新合成的带多个突变的

3、单链环（mutant ssDNA），得以转化E.coli，形成双链质粒。资料表明，引入3个定点突变的效率为60%，5个定点突变的效率为30%。得到的其他质粒是带有较少定点突变的质粒，以引入3个定点突变为例，就是有40% 左右的转化质粒是带有1-2个不同定点突变的质粒（因为存在1-2个引物结合模版延伸形成单链环的可能）。实验材料DNA 试剂、试剂盒pyrobest DNA聚合酶 DpnI 去离子水 BSA 大肠杆菌DH5a菌株 仪器、耗材PCR仪 离心管 移液枪 枪头 枪头盒 水浴锅 灭菌锅 培养箱 实验步骤 一、引物设计 每条引物都要携带有所需的突变位点，引物一般长2545 bp，设计的突变位

4、点需位于引物中部。 二、反应 1. 使用高保真的pyrobest DNA聚合酶，循环次数少，一般为12个循环。 2. 反应体系： （1）10x pyrobest Buffer： 5 ul （2）dNTP Mixture(10 mM) ：1 ul （3）模板DNA(550 ng) ：1ul （4）primer 1 (125 ng) ：1 ul （5）primer 2 (125 ng) ：1 ul （6）pyrobest DNA polymerase（TaKaRa）(5 U/ul)：0.25 ul （7）加无菌蒸馏水至50ul. 三、产物沉淀纯化 1. 加1/10 体积的醋酸钠，1倍体积的异丙醇，

5、混匀置冰上（或-20冰箱）5min，离心弃上清。 2. 7075%乙醇洗盐两次，烘干后溶于无菌水中（此步可省略，直接用 DpnI酶切）。 四、DpnI酶切 1. 酶切体系 （1）Buffer ：2 ul （2）BSA（100）：0.2 ul （3）DNA ：x ul （4）DpnI：0.5 ul （5）加无菌去离子水至 20 ul。 2. 30酶切 14 h。 3. 65水浴15min 终止反应。 五、转化 将酶切产物转化大肠杆菌DH5a菌株，利用抗生素筛选突变子。 六、测序验证 收起 注意事项 1. 引物和质粒都准备好后，当然就是做PCR喽，不过对于PCR的酶和buffer，不能用平时的，我

6、们做PCR把整个质粒扩出来，延伸长度达到几个K，所以要用那些GC buffer或扩增长片段的buffer，另外，要用保真性能较好的PFU酶来扩增，防止引进新的突变。 2. Quick change试剂盒分为几种不同的类型，QuikChange&reg、Site-Directed Mutagenesis Kit标准点突变试剂盒 、QuikChange&reg、 XL Site-Directed Mutagenesis Kit长模板单点突变试剂盒（>8kb）从原理上是一样的，只是PCR的酶和BUFFER不一样，后面用了比较适合长片段扩增的酶和BUFFER罢了，没什么特别的东西

7、。 3. DpnI处理的时间最好长一点，最少一个小时吧，最好能有两三个小时，因为如果模板处理得不干净，哪怕只有那么一点点，模板直接在平板上长出来，就会导致实验失败。 4. 实验板长出来的菌有两种可能，一种是质粒DPNI没处理干净长出来的（模板），一种是PCR产物转化出来的（突变体），不过这两种菌长得一模一样，即使提出质粒来也是一样（酶切和PCR都无法区分），除了测序，是分不出来的。 5. 做PCR时也最好做一个负对照（不加引物），实验管由于PCR时有引物，所以在DNPI处理前里面既含有模板又含有PCR产物，而对照管由于PCR时没放引物，所以在DPNI处理前里面只有模板。如果两者都拿去DNPI处

8、理，就能够证明模板已经被去除干净。若实验顺利的话应该是：正对照长菌负对照不长菌。如果出现正负对照都长菌，那么就是DpnI没处理好，如果正负对照都不长菌，那么有两种可能，一种是PCR阴性，也就是说PCR出问题了，另外一个可能就是转化出问题了。要搞清楚是哪个问题，跑胶说明不了问题，那就做个转化的对照，拿试剂盒的对照实验去试感受态，马上就能知道转化有没问题。 收起 其他一、经验分享 1. 实验的目的应该比较明确吧：就是要把自己的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。一般情况下我们会有几种可能使我们需要这样去做： 第一：我们吊出来的基因有点突变，相信这可能是大家经常会遇到的问题。基因好不容易吊出来，并装

9、进了自己的载体，却发现有一两个碱基跟自己的预期序列或所有的公共数据库不匹配，然后暴昏。 大家实验室里面还是用Taq酶为主吧，Pfu这样的高保真酶大家应该用得不多吧，Taq酶的优点和缺点都很明显：优点就是扩增效能强，缺点就是保真性差，其错配机率是比较高的，相关数字忘了，大家可以去网上查那个数字，不过感觉如果是2000bp的基因，如果扩四五十个循环的话，很大机率会出现点突变，当然这也跟具体PCR体系里的Buffer有很大关系，详细情况这里就不讨论了。 第二：要研究基因的功能，在基因上自己选定位置更换碱基的保守序列，或者改造成不同的亚型，总之就是要人工改造碱基序列符合自己的实验需要，相信这也是那些研

10、究基因的人经常的一种思路吧。 对于第一种情况：我们首先要分析出现碱基不匹配的位置是不是重要的位置，如果不是很重要，大可不必管它，比如说是三联密码子的最后一位，碱基的改变并没有引起相应氨基酸的改变，那么一般情况下也可以不去理它。另外，在NCBI上人类的基因的版本一直在变化，也就是说同一个基因有不同的版本，或者称不同的亚型，其碱基序列有些许的差异，只要自己克隆出来的碱基序列与其中一个相匹配，一般也就可以不做定点突变了。如果有时间没钱，那干脆重新PCR然后再克隆进自己的载体了，不过最好换个保真性好一点的酶如PFU，或者PCR循环数低一点，不过这些东西有时候也得靠运气啦。实在不行的话再来做定点突变。

11、对于第二种情况：这种情况下一般也就只能做定点突变了。 接下来开始聊一聊定点突变的原理吧，那个Stratagene试剂盒！上面有一个说明书，说得好像很正规，不过上面好多都是什么专利啊什么注意之类的话，看都不看，我们简明扼要地只讲实验方面，通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了。 2. 大家马上就会想到几个问题了： 第一：引物怎么设计呢？ 第二：模板怎么去掉呢？ 第三：怎么拿到质粒呢？ 对于第一个问题：怎么设计引物？ 我只能讲一些原则，并举一些例子。 引物设计的原则其它贴

12、子上都有讲，这里就不重复了： 不过这种突变引物要加上一个原则： 一般都是以要突变的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为11-12base pair。 若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，大家应该都知道，引物至少要11-12个base pair才能与模板搭上，而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个base pair，并且合成多一条反向互补的引物。 这么说大家可能不是很清楚，那我就举个例子吧： X71661.1 TATCAGGAGGAATTTGAGCACTTTCAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAG 960 现有序列 T

13、ATCAGGAGGAATTTGAGCACTTTCAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAG 924 * * |->deletion X71661.1 AAGGGCCACCCCGACCTCCAAGGGCAGCCTGCGGAGGAAATATTTGAGAGTGTAGGAGAT 1020 现有序列 AAGGGCCACCCCGACCTCCAAGGGCAGCCTGCGGAGGAAATATTTGAGAGTGTAGGAGAT 984 * （上面为目的序列，下面为现有序列：我们发现有一个A碱基的缺失，其直接结果是在表达蛋白时后面的氨基酸全部错配） 我们以它为中心设计引物：两边各

14、至少12个碱基，左边由于含有较多的A造成引物GC%含量过低，故拉长引物使GC%含量不至过低，也使引物退火温度升高。 故合成引物CAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAGAAG 并合成反向互补引物CTTCTGGAATTCCTCTTTTTTTTTATCCAATTCTTGTTG 其实也不一定要反向互补序列，只要反向引物也是两边都有大于12个碱基，同时符合引物设计的原则就行了。 引物合成公司有很多家，大家可以去寻找，不同厂家的引物在价钱质量上有一些差别，不过价钱一般都是一块多一个碱基，合成时间约为一周。 这样的结果是PCR时把整个质粒都给扩出来了，得到的PCR产物是一条链

15、完整，另一链有缺刻的PCR产物 对于第二个问题： 怎么去掉模板呢？再简单的方法就是用DpnI酶，DpnI能够识别甲基化位点并将其酶切，我们用的模板一般都是双链超螺旋质粒，从大肠杆菌里提出来的质粒一般都被甲基化保护起来（除非你用的是甲基化缺陷型的菌株），而PCR产物都是没有甲基化的，所以DpnI酶能够特异性地切割模板（质粒）而不会影响PCR产物，从而去掉模板留下PCR产物，所以提质粒时那些菌株一定不能是甲基化缺陷株，不会那么凑巧吧，哈哈。 关于第三个问题： 直接把通过DpnI处理的PCR产物拿去做转化就行了，呵呵，然后再筛选出阳性克隆，并提出质粒，拿去测序（这个就不用我多说了吧），验证突变结果，一般都没问题的啦，我做了几十个突变了，到目前为止还没有做不出来的，呵呵，不要砸我啊。 下面讲一下具体的实验步骤以及一些实验中要注意的事情： 1、 根据现有基因设计引物； 2、 合成引物并准备好模板； 3、 PCR， 4、 DpnI处理酶切产物； 5、 转化酶切产物； 6、 筛选 阳性克隆； 7、 送测序并测全长。 收起