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1、不同复合益生菌制剂对断奶仔猪生产性能及抗氧化能力的影响 博士学位论文新型猪用复合益生菌制剂的研制与开发陆克文指导教师 姜平 教授 专业学位 兽医博士 研究领域 预防兽医 答辩日期 二一一年十二月四日 DEVELOPMENT OF NEW COMBINED PROBIOTICS PRAEPARATUM USED IN SWINEByLU Ke-wen Supervisor: Prof. Jiang PingA DissertationSubmitted to Nanjing Agricultural University In Partial Fulfillment of the Require

2、mentsForDoctor of Professional Degree inVeterinary MedicineCompleted in October, 2011Commencement in December, 2011原 创 性 声 明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者（需亲笔）签名： 年 月 日学位论文版权使用授权书 本学位论文

3、作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权南京农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。保密，在 年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密。 （请在以上方框内打“”）学位论文作者（需亲笔）签名： 年 月 日导师（需亲笔）签名： 年 月 日目 录摘 要 IABSTRACT V符号及缩略语说明 VII前 言 VII第一篇 文献综述 7第一章 益生菌制剂概述 71 益生菌制剂的定义 72 益生菌制剂的种类 72.1 按制品剂型 7

4、2.2 按制品所含有效微生物种类多少的不同 72.3 按制品使用目的 72.4 按微生物的菌种类型 73 饲料用益生菌的种类 74 常用菌及其功能特点 74.1 乳酸菌 74.2 芽孢杆菌 74.3 酵母菌 7参考文献 7第二章 益生菌制剂的作用机制及生产工艺 71 益生菌制剂的作用机制 71.1 维持肠道微生态平衡（优势菌群学说） 71.2 生物夺氧 71.3 生物拮抗作用 71.4 增强机体的免疫功能 71.5合成消化酶，促进营养物质的消化吸收 71.6 改善肠道内环境，减少氨、胺等有害物质的产生 72 影响益生菌制剂作用效果的因素 72.1 菌种本身的特性是发挥其效能的关键因素 72.2

5、 宿主因素 72.3 生产条件及产品剂型 72.4 使用方法、使用剂量缺乏评价标准等因素 73 益生菌制剂的生产工艺及注意事项 73.1 益生菌制剂生产工艺研究 73.2 饲用复合益生菌制剂的生产工艺 73.3 益生菌制剂应用的注意事项 7参考文献 7第三章 益生菌制剂在养猪生产中的应用 71 胃肠道益生菌系统 72 益生菌制剂在养猪生产中的应用 72.1 益生菌制剂在仔猪生产中的应用 72.2 益生菌制剂在生长肥育猪中的应用 72.3 益生菌制剂在母猪生产中的应用 7参考文献 7第四章 饲用益生菌制剂的研究进展、问题及研究前景 71 国内外饲用益生菌制剂的研究进展 72 益生菌制剂在研究应用

6、过程中存在的问题 72.1 益生菌安全性问题10 72.2 菌型单一活菌含量低 72.3 水分含量偏高、对胃酸和高浓度的胆盐不稳定 72.4 不耐抗生素 73 益生菌制剂的应用前景 7参考文献 7第二篇 试验研究 7第五章 猪源益生乳酸菌的分离鉴定 71 材料与方法 71.1 样本采集 71.2 培养基 71.3 猪源益生菌的分离和纯化 71.4 分离菌的鉴定 72 结果与分析 72.1 猪源乳酸菌的分离与鉴定 72.2 分子鉴定结果 73 讨论 73.1 乳酸菌的分离 73.2 细菌的自动微生物检测 73.3 细菌的分子鉴定 7参考文献 7第六章 猪源乳酸菌耐酸、耐胆盐试验与体外抑制致病性大

7、肠杆菌作用研究 71 材料与方法 71.1 菌株 71.2 耐酸试验 71.3 耐胆盐试验 71.4 产酸试验 71.5 抑菌能力试验 71.6 抑菌机理试验 72 结果与分析 72.1 耐酸试验与耐胆盐试验 72.2 产酸试验 72.3 抑菌能力试验 72.4 菌液、发酵滤液和菌体的抑菌效果 72.5 用碱处理发酵滤液对抑菌效果的影响 72.6 用乳酸脱氢酶处理发酵滤液对抑菌效果的影响 73 讨论 73.1 乳酸菌对酸耐受性的影响 73.2 乳酸菌对胆盐耐受性的影响 73.3 乳酸菌抑制致病性大肠杆菌的效果 73.4 乳酸菌抑制致病性大肠杆菌的机理 7参考文献 7第七章 不同复合益生菌制剂对

8、断奶仔猪生产性能及抗氧化能力的影响 71 材料与方法 71.1 试验动物及其处理 71.2 饲养管理 71.3 采样 71.4 仔猪生长性能指标测定及腹泻频率的计算 71.5 仔猪抗氧化能力指标的测定 71.6 数据处理 72 结果 72.1 不同复合益生菌制剂对仔猪生长性能及腹泻率的影响 72.2 不同复合益生菌制剂对仔猪全血中GPX-PX活性的影响 72.3 不同复合益生菌制剂对仔猪血清中SOD活性的影响 72.4 不同复合益生菌制剂对仔猪血清MDA含量的影响 73 讨论 7参考文献 7第八章 不同复合益生菌制剂对断奶仔猪肠道菌群及免疫功能的影响 71 材料与方法 71.1 试验动物及其处

9、理 71.2 饲养管理 71.3 采样 71.4 仔猪肠道主要菌群的分布 71.5 MTT法测定ConA非特异性刺激T淋巴细胞增殖 71.6 血清细胞因子IL-2和TNF-含量的测定 71.7 数据处理 72 结果 72.1 仔猪粪便中大肠杆菌计数 72.2 仔猪粪便中乳酸杆菌计数 72.3 T淋巴细胞增殖试验结果 72.4 血清细胞因子IL-2含量测定 72.5 血清细胞因子TNF-含量测定 73 讨论 7参考文献 7第九章 复合益生菌制剂发酵条件的优化 71 材料与方法 71.1 材料 71.2 方法 71.3 数据统计分析 72 结果 72.1 共生实验 72.2 在不同种类培养基上复合

10、益生菌的生长状况 72.3 豆粉与面粉配比筛选 72.4 复合益生菌发酵工艺条件优化结果 73 讨论 7参考文献 7第十章 猪源复合益生菌制剂在江苏地区猪场使用的案例报告 7全文结论 7本文创新点 7攻读博士学位期间发表论文和专利 7致 谢 7新型猪用复合益生菌制剂的研制与开发摘 要益生菌制剂以其无毒、无耐药性、无残留以及效果显著、成本低、能有效补充消化道内的有益微生物等诸多优点，已成为了理想的抗生素替代品而被广泛应用。近来的研究表明，高活菌制剂的功效和安全性，其关键则是生产菌株的选择；另外多菌种混合剂型的研究也显得非常重要。本论文通过从猪的粪便中分离鉴定益生菌，进行乳酸菌耐酸、耐胆盐试验与体

11、外抑制致病性大肠杆菌试验，研究不同复合益生菌制剂对断奶仔猪生产性能、抗氧化能力、肠道菌群以及免疫功能等的影响，最后研究复合益生菌制剂的发酵工艺，对为实现其产品的产业化，推动饲料添加剂产品向高效、无公害的方向发展，实现畜产品的绿色化具有重要的应用意义。各试验的研究内容如下：试验1 猪源益生乳酸菌的分离鉴定从健康猪的20份新鲜粪便中分离到一定范围的乳酸菌共37株。应用常规形态学、生化鉴定（自动细菌检测仪）和分子鉴定方法进行鉴定。结果表明：分离到的37株乳酸菌包括3株嗜酸乳杆菌（L. acidophilus）、5株罗伊氏乳杆菌（L. reuteri）、5株动物乳杆菌（L. animalis）、4株鼠

12、李糖乳杆菌（L. rhamnosus)、3株肠膜样明串珠菌（L. mesenteroides）、3株格氏乳球菌（L. garvieae）、3株乳酸乳球菌乳酸亚种（L. subsp. lactis）、2株嗜热链球菌（S. thermophilus）、5株屎肠球菌（E. faecim）和4株粪肠球菌（E. faecalis）。这一结果为新型猪用复合微生态制剂的研制与开发提供了基础条件。试验2 猪源乳酸菌耐酸、耐胆盐试验与体外抑制致病性大肠杆菌作用研究对从健康仔猪新鲜粪便分离的12株乳酸菌菌株进行耐酸试验和耐胆盐试验，筛选出4株有效菌株。分别将这4株乳酸菌单独、混合与K88共培养；取4种乳酸菌单独和

13、混合培养的菌液、发酵滤液和菌体用牛津杯做K88抑制试验；分别将培养滤液经过乳酸脱氢酶和碱处理做K88抑制试验。结果表明：4种乳酸菌皆具有抑菌功能，但相互之间有差异；用乳酸脱氢酶或碱处理后抑菌能力明显下降，说明乳酸菌是通过产生有机酸尤其是乳酸对K88进行有效抑制。4种菌混合培养的抑菌能力强于单独培养。试验3 不同复合益生菌制剂对断奶仔猪生产性能及抗氧化能力的影响为了研究不同复合益生菌制剂对断奶仔猪生产性能及抗氧化能力的影响，选取4周龄健康杜长大三元杂交断奶仔猪60头，随机分成5组，每组3个重复，每个重复4头。A组为饲喂基础日粮的对照组，B组为饲喂基础日粮加市售的某公司生产的猪用益生菌制剂组，C、

14、D、E组为基础日粮分别加3种不同的自制复合益生菌产品试验组。试验结果表明，添加C组、D组、E组益生菌制剂能显著改善仔猪的生长性能，提高断奶仔猪的日增重和饲料转化效率，其中试验组C组仔猪日增重与对照组相比提高18.03% ( P0.05 )，料肉比下降了8.86%（P0.01），试验组D组仔猪日增重提高16.52% ( P0.05 )，料肉比下降了8.12%（P0.05），试验组E组仔猪日增重提高15.34% ( P0.05 )，料肉比下降了7.75%（P0.05）；添加C组、D组、E组益生菌制剂能显著改善仔猪全血中的GSH-PX的活性和血清中SOD的活性，显著降低血清中的MDA含量，说明提高了

15、断奶仔猪的抗氧化能力，其中C组、D组效果较好。试验4 不同复合益生菌制剂对断奶仔猪肠道菌群及免疫功能的影响为了研究益生菌对断奶仔猪肠道菌群及免疫功能的影响，选取4周龄健康杜长大三元杂交断奶仔猪60头，随机分成5组，每组3个重复，每个重复4头。A组为饲喂基础日粮的对照组，B组为饲喂基础日粮加市售的某公司生产的猪用益生菌制剂组，C、D、E组为基础日粮分别加3种不同的自制复合益生菌产品试验组。试验结果表明，添加益生菌的各试验组粪便中大肠杆菌的含量降低，乳酸菌的含量增加，显示了其对大肠杆菌等肠道致病菌有良好的抑制作用；在提高动物机体免疫力方面，C组、D组益生菌制剂能促进ConA非特异性刺激外周血液T淋

16、巴细胞的转化，C组、D组T淋巴细胞转化水平分别提高了20.4%和17.53%（p0.05），C组、D组、E组益生菌制剂还能有效提高仔猪血清中的细胞因子IL-2和TNF-水平。试验5复合益生菌制剂发酵条件的优化本实验通过将4株益生菌单独和混合培养，测定各株益生菌的活菌数来评价了4株益生菌的共生关系；比较了复合益生菌在YEPD、MRS、麦芽汁和豆面粉培养基上的生长状况，筛选出了可用于工业化生产复合益生菌制剂的培养基；并对该培养基中豆面粉比例作了优化，筛选出最佳搭配比例；同时通过单因子试验和正交试验对复合益生菌制剂工业化生产的工艺条件作了优化，确定了最优的生产条件。结果表明4株益生菌能较好的共生；豆

17、面粉培养基为工业化生产复合益生菌制剂较为适宜的培养基；该培养基中豆面粉最适比例为2%：8%；最佳的工业化生产条件为：发酵时间32h，接种量5%，发酵温度34，恒定pH 6.0，溶氧DO 40%。在上述最优培养条件下，4株益生菌活菌数均达到108CFU/mL以上。关键词：益生菌；乳酸菌；生产性能；抗氧化；免疫功能；断奶仔猪DEVELOPMENT OF NEW COMBINED PROBIOTICS PRAEPARATUM USED IN SWINEABSTRACTProbiotics praeparatum has become the ideal alternatives for antibi

18、otic and been widely applied, with the series advantages of non-toxic, no tolerance, no residual, obvious effect, low cost, and which can offer a effective supplement of beneficial microorganism in digestive tract. Recent researches showed that the key for the efficacy and safety of highly active fu

19、ngus-preparationis was the selection of producing strain; In addition, the study of multi-strains mixture also appears very important. Based on the previous research, study on the isolation and identification of probiotics from pig manure, the acid and bile tolerance experiment and in vitro inhibiti

20、on for pathogenic escherichia coli, the influence of various complex-probiotic-preparation on the performance, antioxidant capacity, intestinal flora and immune function, and the fermentation technology of complex-probiotic-preparation, has practical significance for the industrialization of product

21、s, the development to high efficiency and non-pablic hazard bio-feed additives, and the green revolution of animal products. The contents of each experiment are as follows:Experiment 1 Isolation and identification of pig origin lactobacillus37 strains lactobacillus were isolated from 20 portion fres

22、h stool by healthy swine. Conventional morphology, biochemical identification and molecular identification were applied to characterize. Results: 37 strains separated lactobacillus contained 3 strains Lactobacillus acidophilus (L. acidophilus), 5 strains Lactobacillus reuteri(L. reuteri), 5 strains

23、Lactobacillus animalis (L. animalis), 4 strains Lactobacillus rhamnosus (L. rhamnosus), 3 strains Lactobacillus mesenteroides (L. mesenteroides), 3 strains Lactobacillus garvieae (L. garvieae), 3 strains Lactobacillus subsp. lactis (L. subsp. lactis), 2 strains Streptococcus thermophilus (S. thermop

24、hilus), 5 strains Enterococcus faecim (E. faecim) and 4 strains Enterococcus faecalis (E. faecalis), which provided a basic condition for the research and development of the combined microecology praeparatum on swine.Experiment 2 Study on the acid and bile tolerance experiment for pig origin lactoba

25、cillus and the effect of in vitro inhibition for pathogenic escherichia coli12 strains lactobacillus separated from healthy piglet intestine were applied for the acid and bile tolerance experiment, and 4 available bacterium strains were screened to culture together with K88 alone and in combination;

26、 bacterial liquid, fermentation filtrate and thallus from culture 4 strains lactobacillus together with K88 alone and mixed were applied for the K88 inhibition test by the method of Oxford Cup; culture filtrate were applied for the K88 inhibition test by the treatment of lactate dehydrogenase and al

27、kali. Results: all the 4 strains lactobacillus owned the antibacterial ability but still had a difference between them; the antibacterial ability decreased significantly when treated by lactate dehydrogenase and alkali, which indicated that lactobacillus owned the antibacterial ability through provi

28、ded organic acids especially lactic acid. The antibacterial ability for 4 strains lactobacillus would be enhanced when mixed culture rather than solitary culture.Experiment 3 Effects of probiotics on growth performance and anti-oxidation of weaned pigletsThis trial was conducted to study the effect

29、of probiotics on the intestinal flora and immunity of weaned piglets. 60 Duroc(LandraceLargewhite) weaned piglets (28 d) were randomly divided into 5 groups with 3 replications per treatment and 4 weaned piglets per replication, normal control group(A group) which fed with a basal diet, probiotics g

30、roup(B group) which fed with a basal diet added probiotic products from a company, and complex-probiotic groups(C, D, E groups) which fed with a basal diet added 3 different self-made complex-probiotic- preparation. Results indicated that group C, D, E could significantly improve the performance of

31、piglets and the average daily gain (ADG) and feed to gain ratio (F/G) of weaned piglets.ADG in group C appeared 18.03% ( P0.05 ) higher and F/G appeared 8.86%（P0.01）lower when compared with control group. ADG in group D appeared 16.52% ( P0.05 ) higher and F/G appeared 8.12%（P0.05）lower when compared with control group. ADG in group E appeared 15.34% ( P0.05 ) higher and F/G appeared 7.75%（P0.05）lower when compared with control group. Supplement of probiotic in group C, D, E could also significantly increase the activity of SOD in ser