质粒的复制复制子.pptx

1、,第五章 质 粒(plasmid),质粒：是指存在于细菌、真菌等微生物细胞中、独立于染 色体外、能进行自我复制的遗传因子。a、可以整合到染色体上，又可以游离于染色体外（附加体）b、质粒通常是共价、闭合、环状双链DNA(covalent closedcircular DNA，简称cccDNA)c、分子大小范围从l kb左右到1000 kb。应用：以质粒为载体进行基因克隆以及在原核和真核生物中 表达外源蛋白。,第一节 质粒的发现和命名,一、质粒的发现,大肠杆菌的F因子是第一个被发现的细菌质粒(1946)。在以后的20多年中，陆续发现各种细菌携带质粒，且它 们的表型特征已远远超过了致育性和药物抗性的

2、范围。70年代末，随着遗传工程的崛起，质粒作为载体己被广 泛应用在遗传工程和分子生物学的研究中。,二、质粒的命名原则,质粒可以依据其表型效应、大小、复制特性、转移性或亲和,性差异划分为不同的类型。最初发现的质粒均由研究者根据表型、大小等特征自行命名：F因子(fertility factor，致育因子)R质粒(resistance factor，抗性质粒)Col质粒(colicin，大肠杆菌毒素质粒),质粒的名称一般由三个英文字母及编号组成。第一个字母一律用小写p表示；后两个字母应大写，可以采用发现者人名、实验室名 称、表型性状或其他特征的英文缩写；编号为阿拉伯数字，用于区分属于同一类型的不同质

3、 粒。pUC18和pUC19,命名原则（1976）：,第二节 质粒的遗传特征,一、质粒的大小和拷贝数质粒的大小：一般在1-200kb，最大的可达1400kb(如苜 蓿根瘤菌质粒pRm141a)。质粒的拷贝数：是指同一质粒在每个细胞中的数量，不同 的质粒在同一细胞中的拷贝数有差异。一般而言，质粒的拷贝数与其分子质量成反比关系，分子 质量大的拷贝数低，分子质量小的拷贝数高。,根据其拷贝数分为：严谨型质粒（Stringent plasmid）,松弛型质粒（Relaxed plasmid）严谨型质粒：质粒在细胞内复制时受到控制而与染色体复制 同步进行。其拷贝数也低，通常只有1-3个拷贝。如F质粒。松驰

4、型质粒：质粒的复制与染色体复制不同步。通常每个细 胞含有10-100个拷贝，属于高拷贝质粒。,质粒大小和类型,二、质粒的复制,复制子(replicon)是一个复制单位，细菌染色体是一个复 制子，每一个质粒也是一个复制子。大肠杆菌染色体的复 制起点称为oriC，质粒的复制起点叫做oriV。,质粒,复制子,拷 贝 数,几种常见质粒载体所携带的复制子,革兰氏阴性细菌中多数 质粒以型方式复制,1.质粒复制的方式,质粒型复制示意图,质粒滚环复制示意图,质粒只编码一种或 少数几种与复制有关的蛋白质，而复 制所需要的其他蛋 白都是利用寄主的 复制酶体系。,在革兰氏阳性细菌 中大多数质粒是以滚环方式复制。,2

5、.复制起点(ori)区的功能,ori区是质粒复制所必需的。ori区决定质粒的寄主范围。,分子克隆中常用的质粒载体构建方法：将ori区克隆到一个不能自主复制的环状双链 DNA分子上，并引入到原核细胞后，该重组DNA具 有自主复制能力。,在大多数质粒中，与复制有关的蛋白质基因位于ori 序列附近，因此ori位点周围的小范围DNA序列是复制 所必需的。,有些质粒如ColEl类型的质粒具有较窄的寄主范围，只在E.coli及一些亲缘关系较近的如沙门菌和克氏杆菌中复制。一些从G+细菌中分离的滚环复制的质粒属于广寄主范围质 粒，能编码与复制起始有关的所有蛋白，这样就不依赖于 寄主的功能。,质粒的寄主范围通常

6、是由ori区决定的。,质粒不相容性：是指亲缘关系相近的两种质粒，在非选择性条 件下常不能稳定地存在于同一个细胞中，经过若干代的培养，只含有同一种质粒的细胞越来越多，而含有两种质粒的细胞相 对减少。这种现象称为质粒的不相容性（incompatibility）。,一般来说，同一类型的质粒是不相容的，而不同类型 的质粒则是相容性的。,第三节 质粒的不相容性和质粒的类群,由于性状相近的质粒通常具有相同或相似的复制调控机 制，其阻遏物(抑制物或重复序列)亦相似，在调控时，它们 也能随机地与其中的任一质粒的复制区结合而阻遏了其复制 过程，并进而使之在子代细胞中丢失。,质粒不相容性机制：,因此，也可以根据复

7、制子是否相同来划分质粒的不相容群。,携带有相同复制子的不同质粒属于同一不相容群，它们 不能共存于同一细菌中。带有不同复制子的质粒属于不同的不相容群，它们可以 共存于同一细菌中。,ColIb-P9,R144,R483,R64,R621a,R69,R46,R16,R466bR15,N3,pKM101 R723,RP1,RP4,R68,R751,R690,RK2,RSF1010,pKT212,pKT230,pGSS,革兰氏阳性细菌,R7K,R388,pSA747R6KpT181,pC221,pS194,pC223,pUB112,pE194,IncIIncMIncN IncO IncP IncQ In

8、cW IncXpT181pUB110pSN2,pBC110,pBC16 pSN2,pE12,pIM13,要使质粒能够保持稳定的遗传，至少需要满足下 面两个方面的条件：1、每个世代每个质粒平均都必须至少发生一次复制；2、当细胞分裂时，复制产生的质粒拷贝必须平均分配 到两个子细胞中去。在细胞分裂过程中，质粒分配到子细胞的途径可分为：主动分配(active distribution)随机分配(random distribution),第四节 质粒的稳定性(细胞分裂中的质粒分配),sopB,sopC,SopA,SopB,sopA和sopB反 式作用基因,sopC:顺式作用位点,12个43bp的正向重复

9、序列,SopB与sopC区结合，形成蛋 白-核酸复合物，该复合物参 与质粒的分配。在F质粒中，par区由sopA和sopB两个基因及sopC区组成,GGTCTGATTATTAGTCTGGGACCACGGTCCCACTCGTATCGTC CCAGACTAATAATCAGACCCTGGTGCCAGGGTGAGCATAGCAG有一对7bp的反向重复序列,1.主动分配(active distribution)机制,SopA蛋白与sopAB转录单位的启动子区的操纵基因结合，对其转录进行调控；,SopB蛋白虽不能与sopAB操纵子的启动子结合，但它能 促进SopA蛋白的结合能力。因此，SopB蛋白必须维持

10、在适当的浓度，才能保证F质 粒在细胞内的稳定性。,复制,质粒分配,细胞分裂,质粒,分配复合体,复制体,细菌质粒DNA的分配模型图,质粒DNA在位于细胞中央 的复制体(replisome)的 作用下进行复制。质粒复 制后，分配蛋白与sopC位 点结合形成分配复合物。,复制后的质粒均等地分配到 两个子细胞中，分配后的质粒可能在分配蛋白的作用下，定 位于细胞的特定区域。,随机分配：是指在细胞分裂过程中质粒拷贝数在两个子细 胞之间是随机分配的。,2.随机分配机制(random distribution),人工构建的质粒载体在构建过程中并不携带par区，因此它 们在细胞分裂过程中是被随机分配的。,尽管在

11、大肠杆菌培养物中出现无质粒细胞的可能性较低，但在一定的条件下，如培养基耗尽或是寄主细胞快速生长 分裂的过程中，仍有可能产生出无质粒的细胞。因此，人工构建的质粒载体，都必须具有选择性遗传标记 如：抗药性、营养缺陷型等，以保持选择压力。,IncP、IncN、IncQ、IncW组的质粒属于广寄主范围质 粒(broad host range plasmid)。广寄主范围质粒：指质粒能通过接合作用转移到很多 不同种甚至不同属的寄主内，并能稳定地存在于这些寄主 细胞内。,下面以IncP为例对这一类质粒进行介绍,第五节 IncP组质粒的特征和接合转移,1.IncP质粒的特征,IncP组的质粒的寄主较广，In

12、cP质粒自身或带动其他 质粒能从大肠杆菌转移到几乎所有的G-细菌中，有研究表 明IncP质粒还能接合转移到G+细菌、酵母、植物细胞中。大肠杆菌IncP组包括很多种天然质粒，大小在60-90kb，具有多种抗性基因，如：卡那霉素(Kan)、四环素(Tet)、氨苄青霉素(Amp)、链霉素(Str)、氯霉素(Cam)、庆大霉 素(Gen)等。,RP4质粒的酶切和遗传图谱,oriV：质粒的营 养复制区,tra基因和oriT位点：与接合转 移有关含有抗性基因,2.接合转移质粒的应用,从理论上讲，可移动质粒只要含有与自主转移质粒相同的oriT位点就能被转移。对自然界中不能自主转移的质粒，可人工加上oriT位点，然后诱动其转移。构建广寄主范围的质粒载体：根据自主转移质粒能自主转移及其能带动可移动质粒的 转移这两个特征而设计的。,第五章：质粒,1、试述质粒在现代生物学研究和应用中的作用和意义？2、何谓严谨型质粒、松弛型质粒？划分依据是什么？3、简述质粒不相容性的作用机理？4、质粒稳定性遗传，至少需要满足何种条件？5、在细胞分裂过程中，质粒分配到子细胞中去的途径有 哪些？,