miRNA156基因家族进化与功能分析.docx

1、miRNA156基因家族进化与功能分析本 科 毕 业 论 文miRNA-156基因家族进化及功能分析 姓名*院系生命科学学院专业生物技术年级2011级学号2011*指导教师王艳芳 讲师2015年5月20日独 创 声 明本人郑重声明：所呈交的毕业论文(设计)，是本人在指导老师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，成果不存在知识产权争议。尽我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文（设计）不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确方式标明。此声明的法律后果由本人承担。作者签名: 二一 年 月 日毕业论文（设计）使用授权声明本人完全了解鲁

2、东大学关于收集、保存、使用毕业论文（设计）的规定。本人愿意按照学校要求提交论文（设计）的印刷本和电子版，同意学校保存论文（设计）的印刷本和电子版，或采用影印、数字化或其它复制手段保存论文（设计）；同意学校在不以营利为目的的前提下，建立目录检索与阅览服务系统，公布论文（设计）的部分或全部内容，允许他人依法合理使用。（保密论文在解密后遵守此规定）作者签名: 二一 年 月 日毕业论文开题报告姓名*性别男学院生命科学学院年级生技本1101学号2011*题 目miRNA-156基因家族进化及功能分析课题来源教师推荐课题类别理论研究MiRNA-156基因家族进化及功能分析，是系统的对miRNA-156基因

3、家族进行对比预测及研究，由此推测该家族的基因可能以不同的方式和速度进化的，并且通过靶基因预测看与转录因子结合情况,分析参与多种胁迫应答反应情况，本文可为全面深人研究miRNA的作用机制奠定基础也可为全面剖析miRNA调控机理提供新的思路。主要参考文献目录：1.Dennis C. The brave new world of RNA. Nature 2002; 418(6894):122-4.2.Zhang BH,PanXP,CannonCH,etal.Conservation and divergence of plant mieroRNA genes J Plant J,2006,46(2)

4、:243一259.3.Reinhart B J,Weinstein E G,Rhoades M W,et al.Miero RNAs in plantsJ. Genes Dev, 2002,16 616一16264.丁艳菲,王光钺,傅亚萍,朱诚。miR398在植物逆境胁迫应答中的作用DOI:10.3724/SP.J.1005.2010.00129本次研究通过对在所有植物miRNA-156基因家族成员的成熟序列进行多重序列对比，构建系统进化树分析，然后选取代表性的三个物种的miR398基因进行靶基因预测。从而确定相对保守的碱基的位置，通过得到的系统进化树图进行分析，此而得到miRNA-156前体

5、在序列上的多样性,也从侧面反映了植物的RNA前体的复杂性，由此推测该家族的基因可能以不同的方式和速度进化而来。通过靶基因预测了解其在生命活动中的作用.本研究可为系统挖掘miRNA-156的抗逆反应机制奠定基础,也可为全面剖析miRNA调控机理提供新的思路。首先从数据库miRBase 中下载全部植物的miRNA-156基因家族所有成员的基因前体序列和成熟序列。通过相应软件对已搜索的植物物种的miRNA-156的成熟及前体序列进行多重序列比对，分析其进化的特征，然后在这个基础上利用软件进行分析分析对成熟序列构建系统进化树。并通过靶基因预测软件对选的三个物种的靶基因进行预测及分析。 可能遇到的问题是

6、软件不会用，有的靶基因预测没有结果。 研究过程中，有的软件不会使用，通过老师同学的帮助学会使用，没有预测结果的就看情况舍弃。miRNA-156基因家族进化及功能分析主要利用生物信息学手段来分析及预测miRNA398。为全面深人研究miRNA的作用机制奠定基础也为全面剖析miRNA调控机理提供新的思路。该生能够根据课题要求，独立自主地去完成课题。采用生物信息学方法来预测并分析植物miRNA-156基因家族进化及功能，对本次的研究原理、方法、目的、意义都掌握的比较深，并且积极查阅文献，对课题有深入了解，善于思考。该同学在查阅相关文献的基础上，制定出了miRNA-156基因家族进化及功能分析的研究方

7、案。研究思路正确，方案可行，有望达到预期的效果。因此，同意开题实施。 签名： 年 月 日院（系）毕业论文（设计）领导小组意见：同 意 开 题 （签章） 年 月 日毕业论文结题报告姓名*性别男学院生命科学学院年级2011级学号2011*题 目miRNA-156基因家族进化及功能分析课题来源教师推荐课题类别理论研究通过研究miRNA-156基因家族进化及功能分析，先在数据库中查取数据，通过Clustal W2在线软件对已搜索的植物物种的miRNA-156的成熟及前体序列进行多重序列比对，分析其进化的特征，然后在这个基础上利用MEGA6.0软件采用基于参数的邻近法自展分析1000次，对成熟序列构建系

8、统进化树。通过三款靶基因预测软件对选的三个物种的靶基因进行预测及分析。结果显示miRNA-156具有相对的保守性，并且在生物胁迫应答响应中发挥了作用，也在生命活动中起调控作用，影响植物的生长、发育等生理活动。为全面深人研究miRNA的作用机制奠定基础也可为全面剖析miRNA调控机理提供新的思路。指导教师评语： 该生根据目前miRNA-156的相关研究资料和利用miRNA数据库miRBase，采用生物信息学的方法，对miRNA-156基因家族进化及功能分析进行了相关的研究。，通过查阅文献和学习数据库的使用，选对得到的研究结果进行了系统的分析，数据可靠，具有良好的研究前景。该论文内容丰富，结构比较

9、合理，层次分明，工作量较大，结论可靠，有比较好的理论与应用参考价值， 符合规范化要求，是一篇比较不错的论文。 经审阅该论文是一篇较好的学士学位论文。 签名： 年 月 日院（系）毕业论文（设计）领导小组意见：同 意 结 题（公章） 年 月 日指导教师评定成绩毕业论文成绩评定表学院（公章）： 生命科学学院 学号：20112513606姓 名*总成绩：良题 目miRNA-156基因家族进化及功能分析评阅人评语该论文利用植物学中已知的miRNA-156基因家族进行了进化及系统分析，能够很好的掌握生物资源数据库的使用，对生物信息学技术有了一定的了解，并能够应用到研究中去，用生物信息学的方法来预测分析植物

10、miRNA-156基因家族的进化及功能分析具有很好的应用前景，具有良好的实际应用与理论价值。论文选题有一定的新意，论文的工作量较大，论文的设计合理，内容丰富，数据真实可靠。经审阅，该论文是一篇较好的学士学位论文。评定成绩： 签名： 年 月 日答辩小组评语该论文利用miRNA数据库miRBase，在所有植物中选取查出了288条miRNA398的成熟及前体序列进行研究。应用生物信息学的方法，对miRNA-156基因家族进行了相关的研究。研究中采用了Clutal W2、MEGA6.0、psRNATarget等软件完成了对miRNA-156基因家族及功能分析。该生在答辩的过程中，条理的讲述了研究的背景

11、及miRNA基因家族的的进化及功能分析，实验的大体流程，详细的讲述了论文的结果，并对所的结果未来的可能性作了说明。经答辩委员会评议，该论文是一篇较好的学士学位论文。答辩成绩： 组长签名： 年 月 日注：总成绩=指导教师评定成绩（50%）+评阅人评定成绩（20%）+答辩成绩（30%），将总成绩由百分制转换为五级制，填入本表相应位置。 3.2 miR-156家族的进化 43.3 miRNA-156靶基因的预测及其功能分析 8miRNA-156基因家族进化及功能分析王国辉（生命科学学院，生物技术，生技本1101，20112513606）摘要：miRNA（MicroRNAs）是真核生物中广泛的一类对基

12、因表达调控具有重要影响的非编码小分子RNA，其大小长约2025个核苷酸。通过与靶基因互补配对的原则在转录后水平上调控基因表达，表现出高度保守的特点。本文通过对miRBase收录中的基因进行搜索发现，44个物种中共搜索到288条miRNA-156基因序列，表明miNA-156基因在不同的物种之间广泛的存在，具有很高的保守特性。本文通过研究miRNA-156基因家族的进化机对了解和揭示植物miRNA基因的进化机制具有重要的参考和科研价值。通过植物信息学的分析，miRNA-156在植物中具有很高的保守性，可推测是在远古较早的植物中保留下来的基因序列；靶基因的预测及其功能分析miRNA-156基因家族

13、在植物的生长中起到了重要的调控作用；通过对上游的启动子研究得知，miRNA-156基因的上游序列中含有与植物胁迫生长、光的传导、温度的感知及调节、激素的分泌及传导相关的顺式作用元件。本文通过对miRNA-156基因的研究，对miRNA基因家族在植物中的进化、功能和各种生理功能应用奠定基础。关键词：MicroRNAs; miRN-156;进化;功能分析;靶基因;启动子Evolution and Function Analysis of miRNA-156 Gene FamilyWang Guohui(School of life Science and Biotechnology, LuDong

14、University, Biologicaltechnology, classof2606Abstract: miRNA (MicroRNAs) are eukaryotes widely used class of small non-coding RNA molecules having a significant impact on the regulation of gene expression, the size of about 20 to 25 nucleotides. By pairing the principle of the target gene regulation

15、 of gene expression in the post-transcriptional level, showing a highly conserved features. Based on a collection of genes miRBase search found 44 species CPC search to 288 gene sequences miRNA-156, showed miNA-156 genes among different species widespread presence of highly conserved features. miRNA

16、-156 members with only a small portion is contained within the sub-region, the rest are all located in intergenic regions. miRNA gene family on the mode of action of a target gene, mature miRNAs sequence length is made longer primary transcript through a series of shearing nuclease produced, it is t

17、hen placed into the RNA-induced silencing complex (RNA- induced silencing complex, RISC), the identification of target gene mRNA through complementary base pairing mode, and guide silencing complex target mRNA degradation or translation repression of target mRNA based on differences in the degree of

18、 complementary base pairing. If fully complementary pairing of target genes can cut a lot of cleavage, and thus a large number of miRNA gene expression, thereby reducing the richness of the target gene. This article has important reference and scientific value of understanding and reveal the evoluti

19、onary mechanisms of plant miRNA genes by studying miRNA-156 gene family evolution machine. By analyzing plant informatics, miRNA-156 has a highly conserved in plants, gene sequences can presumably preserved in ancient plants earlier; target gene prediction and functional analysis of miRNA-156 gene f

20、amily in the growth of plants plays an important role; by promoter upstream of that study, the upstream sequences of miRNA-156 gene contains plant stress growth and transmission of light, temperature sensing and regulation, hormone secretion and conduction associated cis-acting elements. Through the

21、 research of miRNA-156 gene family evolution of miRNA genes in plants, function and application of a variety of physiological functions of the foundation.Key words: MicroRNAs; miRN-156; Evolution; Functional analysis; Target gene; Promoter1.引言MicroRNAs(miRNAs)是一类生物体内普遍存在的、长度为20-28nt左右的内源性单链非编码小分子RNA

22、,通过与靶mRNA的互补在转录后水平介导mRNA降解或抑制其翻译来调控基因表达1，几乎在所有的生物学过程中都发挥着重要作用2-3。miRNA基因在于基因组中以单拷贝、多拷贝和基因簇等多种形式存存在。成簇基因之间有的具有同源性, 有的无同源性, 成簇的MicroRNA可能最终转录成为一种转录产物，其原因可能是它们来自于相同的原始转录本。其中串联基因簇(tandem cluster)中的MicroRNA一般呈现为协同表达4-5,暗示着miRNA基因存在复杂的调控机制。从第一次发现RNA这类小分子开始，miRNA变成了人们广泛研究和关注的对象。人们对这类物质进行了大量的、深入的研究和实验。尤其是在动

23、物miRNA方面更是如雨后春笋般的涌现了很多科研成果，一时间关于miRNA的科研论文和研究成果大量发表。但是在植物miRNA方面起步比较晚，没有受到人们的广泛关注。直至等到2002年才有关于植物miRNA的报道，是从拟南芥中克隆分离出来的。随后植物miRNA的研究又受到人们的广泛关注。之后的研究和实验也迅速发展起来。涌现出大量的有重要价值的科研成果。由于人们的大量研究，到目前为止，在数据库miRBase中一共收录了近三万条的关于miRNA的信息，其中有近一万条信息是关于植物miRNA的，总共来自于100多种常见和模式植物。 MicroRNAs（miRNAs）是目前为止在真核生物中发现的一类内源

24、性的非编码RNA，其具有特殊的具有调控功能的，其大小大约为长约20-25个核苷酸。成熟的miRNAs序列是由长度较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，然后被放置进 RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex,RISC）中，识别靶基因mRNA方式为通过碱基互补配对，并根据碱基互补配对程度的差异指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。从目前的研究成果分析来看，可得知植物miRNA家族序列与植物各个阶段的生理发育有很紧密的联系，比如植物叶的形成和生长、光信号的传到、根的生长和延长等，甚至和植物的环境胁迫生长也有一定的关系。在miRB

25、ase数据库中，共可得到miRNA-156数据共有288条，分布在44个物种中。一般我们认识，只要miRNA分布超过十个物种，就可以认为是保守的。由此可知，miRNA-156家族基因是高度保守的。保守的miRNA家族在不同的植物中发挥的调控控制作用是相同或者是相似的，。由这个保守特性我们可以较为方便的分析和探究不同植物或者物种中的miRNA家族。在植物中，MiRNA对靶基因RNA的调控过程作用原理，最主要的就是与靶基因的碱基互补配对，通过碱基互补配对程度来对靶基因进行剪切降解或者抑制。如果可以与靶基因完全互补配对的话，就会大量对靶基因进行剪切，表达出大量的miRNA,从而会减少靶基因的丰富程度

26、6。除此之外，miRNA也可能存在其他的调控作用方式，在本文中就不加以赘述。在整个研究过程中，首先是要获得miRNA-156基因家族序列，然后对所获得的全部成熟基因进行序列对比，并且在对比的基础上进行系统进化分析，从而利用前体序列构建系统进化树。最后是对成熟序列的靶基因进行预测，从而推断出靶基因在染色体上的位置及其生物功能。通过研究发现，miRNA-156基因家族是植物界目前为止发现的较为庞大的miRNA基因家族，但未见到有对此基因家族进行系统分析和研究的报道。为了了解此基因家族的进化和功能分化情况，特做了此研究。本文通过系统的对miRNA-156家族的功能和分子进化情况的研究，以期对miRN

27、A基因家族在植物中的进化、功能和各种生理功能应用奠定基础。2.材料与方法2.1 miR-156序列获得对miRNA-156基因家族进行研究，就要取得其基因家族的序列7。全部序列的取得可从miRNA数据库 miRBase（ cgi-bin/browse.pl）中下载所有物种miRNA-156基因家族成员的所有前体序列和成熟序列。2.2 miR-156序列对比与系统进化分析采用Clustal W2在线软件对所有物种的miR-156基因的成熟序列及前体序列进行多重序列比对，分析进化特征，在此基础上运用MEGA5.1软件采用基于参数的邻近法对前体序列构建系统进化树8。2.3 miR-156靶基因的预测

28、以miR-156为研究对象，采用三款植物靶基因预测软件psPNATTarget（）,WMD3(),TAPIR()分别在Oryza sativa cDNAlibrary(.ensembl.org/info/data/)，Zea mays DFCI Gene Index(ZMGI), version 19(http:biocomp.dfci.harvard.edu/index.html)，Glycine max phytozome v8.0(http：/biocomp.dfci.harvard.edu/index.html)数据库中预测这些物种所有的miR-156成员的靶基因，在预测时所有参数使用

29、默认值。3.结果与分析3.1 miR-156家族的分布取得miRNA-156家族的全部基因序列，可在miRBase中进行搜索。经过搜索可获得288条mirRNA-156基因序列。这些基因序列分布在69种植物中，在植物miRNA中属于高度保守的一类9。在所有植物miRNA-156分布中，在花生（Arachis hypogaea）中发现了3个，在拟南芥（Arabidopsis lyrata）中发现了18个，在桐花树（Avicennia marina）中发现了8个，在无油樟（Amborella trichopoda）中发现了5个，在二穗短柄草（B. distachyon）中发现了10个，在木榄（Br

30、uguiera gymnorhiza）中发现了1个，在香瓜（Cucumis melo）中发现了10个，在黄豆（Glycine max）中发现了28个，在苹果（Malus domestica）中发现了31个，在水稻（O. sativa）中发现了12个，在山角叶杨（P. trichocarpa）中发现了12个，在高粱（Sorghum bicolor）中发现了9个，在马铃薯（Solanum tuberosum）中发现了11个，在葡萄（Vitis vinifera）中发现了11个，在玉米（Zea mays）中发现了12个。由此可得出，miRNA-156基因家族虽然广泛分布在各个植物中，但在各个植物中的

31、分布差异还是很明显的，说明miRNA基因家族在进化过程中，基因的扩张是经过了明显的重排和筛选的，由此导致的结果就是在各类植物的分布具有明显差异性。更加说明了miRNA-156家族在各个植物物种间的调控的复杂性，更加具有重要的科研价值。通过分析可获得，在分布上看，miRNA-156基因不只单单分布在双子叶植物和单子叶植物中，在裸子植物和被子植物，甚至蕨类植物中都有广泛的分布，可得知其高度保守的特性。在文本文档中将获得的288条成熟碱基序列由上至下一条一条罗列出来，（附图）。最后文本文档保存时属性改成.txt格式。将以.txt保存的植物miRNA基因组数据提交Clustal W2在线软件，经过BLAAT比对可获得通过分析可获得植物miRNA-156成熟序列比对结果10。通过对成熟序列分布对比表（见表3.1）分析，基因miRNA-156在物种基因成熟序列分布中具有高度保守性，特别是位于第1个碱基至第9个碱基上具有高度的重复性。表3.1 各物种miRNA-156基因数量物种名称包含miRNA-156数量物种名称包含miRNA-156数量Malus domestica苹果31Solanum tuberosum马铃薯