DGGE技术及其在环境微生物中的应用图文精.docx

1、DGGE技术及其在环境微生物中的应用图文精第33卷第10期2008年10月环境科学与管理ENV IRONM ENTAL SCIENCE AND M ANAG EM ENT Vol 133N o 110Oct .2008收稿日期:2008-06-21作者简介:李怀(1982-,男,硕士研究生,主要研究方向:水污染控制工程。通讯联系人:关卫省文章编号:1673-1212(200810-0093-04DGGE 技术及其在环境微生物中的应用李怀1,关卫省1,欧阳二明2,王晓慧2,张杰2(1.长安大学环境科学与工程学院,陕西西安710054;2.清华大学环境科学与工程系,北京100084摘 要:变性梯度

2、凝胶电泳(D GGE 具有可靠性强、重复性好、方便快捷等优点,已被广泛应用于环境科学和污染防治研究领域。介绍了变性梯度凝胶电泳(DGGE 的基本原理和技术路线,重点介绍和讨论了DGGE 技术在废水生物处理、废气生物处理和固废生物处理中的应用现状,并对该技术的应用前景进行了展望。关键词:DGGE ;微生物多样性;活性污泥中图分类号:X703.1文献标识码:ADGGE (Denat ured G radient G el E lectrophoresisand its App li catio ni n the R esearch of Enviro n m enta lM icrob i olo

3、gyL iH ua i 1,GuanW e i s heng 1,Ou Yanger m i n g 2,Wang X iaohui 2,Zhang Jie2(1.Depart m ent of Envir on m e n tal Science and E ng i neeri ng ,Chang p an U nivers ity ,X i p an 710054,Ch i na ;2.D e part m ent of Envir on m e n tal Science and Eng i neeri ng ,Ts i nghua Un i versity ,Beiji ng 100

4、084,Ch i naA b stract :Denaturi ng gradient gel el ectro phoresis(DGGEhas the a dvantages of h i gh reli abilit y ,good re petiti on and easy op 2erati on ,and been w i del y used i n e nviro n m e ntal scie nce a nd Poll utio n p r eventio n resear ch ar eas .I n th is paper ,it is briefly i ntro 2

5、duce d that DGGE(denaturing gr ad i ent gel el ectro phoresisis app li ed i nW aste water b i ological treat m en,t waste gas b i ological treat 2ment and solid waste b i ologi cal treat me nt a nd its p ri nci pa,l Techn ical r ou te ,as well as t he f utur e of t h is technol ogy was e xpecte d .K

6、 ey words :DGGE ;m i cr ob ial d i versity ;acti vated sludge变性梯度凝胶电泳(Denatur i n g grad ient gel elec 2trophoresis ,DGGE 技术是由F ischer 和Ler m an 于1979年最先提出的用于检测D NA 突变的一种电泳技术1。1993年Muzyer 等2首次将DGGE 技术应用于微生物生态学研究,并证实了这种技术在研究自然界微生物群落的遗传多样性和种群差异方面具有明显的优越性。活性污泥微生物种类极其丰富,优势种群及其微生物多样性在活性污泥生态系统中发挥着重要的作用。目前

7、在环境科学和污染防治研究领域,关于活性污泥中微生物多样性的研究越来越受到重视;而传统的纯培养分离技术研究活性污泥微生物多样性有很大的缺陷,不能获得未被培养的微生物的信息,只能分离出占活性污泥总数011%1%的微生物种类。而分子生物学技术如PCR-D GGE ,PCR-SSCP 和T-RFLP 等能够在分子水平上对活性污泥微生物多样性进行快速和精确的分子诊断,并可以监测未被培养的微生物种类。所以与传统方法相比DGGE 技术能够快速、准确地鉴定在自然生境或人工生境中的微生物种群,并进行复杂微生物群落结构演替规律、微生物种群动态、基因定位、表达调控的评价分析。由于DG GE 具有可靠性强、重现性高、

8、方便快捷等优点,短短的十年内,已经成为微生物群落遗传多样性和动态分析的强有力工具,并被广泛用于活性污泥、生物膜、土壤、底泥等环境样品中的微生物多样性检测和种群演替的研究。1 D GGE 的基本原理DGG E 技术主要原理如图1所示,在碱基序列存在差异的D NA 双链解链时需要不同的变性剂浓度,他们一旦解链,在聚丙烯酰胺凝胶中的电泳行为将发生很大的变化。因此,将PC R 扩增得到的等长DN A 片段在含有变性剂梯度的凝胶中进行电泳,序列不同的D NA 片段就会在各自相应的变性剂浓度下变性,发生空间构型的变化,导致电泳的速度急剧下降,以#93#至停留在相应变性剂梯度凝胶中,染色后在凝胶上呈现为分开

9、的条带,每个条带代表一个特定序列的D N A 片段。在不同泳道中停留在相同位置的条带,一般可视为具有相同的D N A 序列。该技术可以分辨具有相同大小片段的序列差异,可以用于检测单一碱基的变化,微生物群落遗传多样性以及PC R 扩增D NA 片段的多态性。 图1 D GGE 反应原理为了提高DGGE 的检测敏感性,通常在一侧引物的5c 端设计增加一段富含GC 的区域(GC -Cla mp ,其长度通常为3050个核苷酸,避免了D NA 的完全解链,从而提高了不同碱基的检出率,使相差一个碱基的序列也能分辨分离。2 技术步骤该技术主要操作过程(图2如下:(1样品总D NA 提取;(2样品16Sr

10、D NA 片段的PCR 扩增;(3D GGE 条件优化与分析;(4割胶测序等后续处理。 图2 微生物群落结构的16SrD NA 分析方法2.1 样品总D NA 提取沉淀物、活性污泥和生物膜等样品中细菌种类复杂且混杂有大量有毒物质,如何使所有细胞裂解、充分释放D NA 、有效去除杂质,建立高效、可靠的D N A 提取方法成为研究者关注的热点。当前主要使用超声波法、基于S DS 的裂解法、改进的化学裂解法、微波法、冻融+玻璃珠+溶菌酶+S DS 和土壤提取D N A 试剂盒法等6种活性污泥D NA 提取方法。2.2 样品16Sr D NA 片段的PCR 扩增PCR 扩增是PCR-D GGE 技术中

11、至关重要的步骤。PCR 全过程包括三个基本步骤,如图3所示:双链D NA (模板D NA 加热变性为单链(变性;在低温下引物与模板D NA 单链互补配对(退火;在适宜温度下TaqDNA 聚合酶催化引物沿着模板D NA 延伸(延伸。反复进行变性、复性和延伸的循环,从而使扩增D NA 产量呈指数上升,经2530个循环后,扩增倍数可达106倍。图3 PCR 反应原理通常采用16Sr D NA 中的保守区作为引物进行PCR 反应。这是由于16Sr D NA 具有以下几个特点:(116Sr D NA 约为1500个核苷酸长,序列长短适中,适合用作分类学上的研究;(2任何一种原核生物体都具有16Sr D

12、NA ;(316Sr D NA 非常保守;(416Sr D NA 不会在不同的个体间进行基因交换,各物种具自己的独特序列;(5目前已有相当完备的16Sr D NA 基因资料库,经过GenBank 和R i b oso ma l D atabase Project(RDP基因资料库作对比分析,并可进行亲源关系分析、鉴定等。Yu 等8研究了16Sr D NA 不同可变区V1、V3、V5、V6、V8及V1V3、V3V5、V6V8区的PCR 扩增产物及其DGGE 结果。结果表明扩增V3区及V3V5区的引物为最佳引物选择。V3区的PCR -DG GE 条带数最多、分离效果最好。如果需要较长的扩增产物,则

13、选择V3V5区。2.3 D GGE 条件的优化通常根据基因片段的大小来确定聚丙烯酰胺凝胶浓度,当片段大小在200bp 左右时,一般采用8%的凝胶,片段在500bp 时用6%的凝胶。为提高分辨效果,也可以采用梯度凝胶进行分离,对于200bp 的片段,可以采用6%12%的丙烯酰胺凝胶。变性剂的梯度范围要根据垂直DGGE 实验来确定,垂直实验曲线斜率较大的部分代表解链区域的T m (解链温度值,此时低温解链区的不同分子达到最佳分离状态。通常选择水平胶的的变性剂梯度范围为30%(相当于T m 范围10e 左右,对于不同的样品还需要进行调整。对大多数D NA 片段50e #94#65e是比较适合的,通常

14、电泳的温度要低于样品解链区域的T m值。电泳时间取决于样品的片段大小、凝胶浓度、变性剂梯度、电泳时的电压等因素,一个条件的改变都可能引起电泳时间的不同,可以用时间进程法来优化出最佳电泳时间。为了更好的显示D GGE条带,可以选择不同的染色方式(EB、S YBR Green I和银染。其中,S YBR Green染色的优点是背景色低,可以观察到尽可能多的条带;银染的灵敏度最高,但银染过后的条带不能用于杂交分析。2.4割胶测序对D GGE图谱上的优势条带进行割胶回收,将回收条带的PCR产物进行测序分析。3D GGE在环境微生物中的应用3.1在废水生物处理研究中的应用D GGE技术在废水生物处理研究

15、中的应用使人们对废水处理过程中微生物群落的变化产生了新的认识。Lapara等3研究了升高温度对废水好氧生物处理过程中细菌群落结构和功能的影响,DG GE分析细菌群落的结果表示不同温度下有不同的细菌群落。Santegoeds等4用DGGE研究了来自污水处理厂的生物膜中S RB种群的变化和硫酸还原的优化。在生物膜的生长过程中,微生物群落的遗传多样性增多。用专一性寡核苷酸探针对DG GE条带进行杂交分析,在所有的生物膜和活性污泥样品中,D esulf obu l b us和Desulf-ovi b rio是主要的S RB,在好氧层内部的厌氧区存在一种隶属于Desu lf-one m a的丝状SRB。

16、但是,在第6周和第8周,可以发现不同种类的Desu lf obulbus和Desul-f ovi b rio。刘新春等5应用DG GE方法,对在相同的操作条件下分别用低温菌和常温菌接种的两套活性污泥系统中的微生物群落结构的动态变化进行了追踪。由于工艺相同,使得接种的低温菌群和常温菌群在相同的操作条件下,产生了相似的微生物群落结构。随着运行时间的增加,其菌群结构相似程度也越来越高。硝化作用是废水处理系统中实现氨氮去除的关键步骤。而氨氧化细菌在硝化作用过程中负责将氨氧化为亚硝酸盐,实现亚硝化作用,是硝化过程中必不可少的步骤。由于氨氧化细菌的生长速率相当低,生物量很少,采用传统的细菌分离培养分析法研

17、究氨氧化细菌相当费时、繁琐。Avraha m i等6研究了温度对水处理反应器中AOB(氨化细菌菌种群结构的直接或间接影响。许玫英等7采用PCR扩增16Sr D NA、扩增功能基因、随机克隆测序等技术,分析处理含高浓度氨氮废水处理系统不同驯化时期的4个活性污泥样品氨氧化细菌的种类和氨单加氧酶的活性,并在国内首次采用PC R-DGGE相结合的技术对样品中总的细菌类群的差异进行研究。结果表明采用PCR-DG GE技术有利于更全面地了解氨氧化细菌的类群和功能,进而改善废水处理系统的处理效果。许春红8等对处理抗生素废水的厌氧复合床中的微生物种群多样性进行研究。结果显示,厌氧复合床反应器中微生物种群丰富,

18、距底部3m以下种群最多且相似性较高,3m以上的填料层部位微生物种群明显减少,除产甲烷菌为主外,污泥床层与填料层中分别有不同的优势菌种与产甲烷菌协同作用。王峰等9应用PCR-DG GE技术对城市污水化学-生物絮凝强化一级处理工艺与传统的完全混合式处理工艺反应池活性污泥样品微生物种群结构进行了对比研究,对同一反应器不同位置微生物分布以及不同工况下的微生物种群结构进行了初步探讨。结果表明两种城市污水处理工艺中微生物种群多样性都相当丰富,但是种群结构相差很大,说明化学生物絮凝处理工艺的微生物作用与成分相近的城市污水处理工艺中微生物作用机理可能存在相当大的差别。Rowan等10采用生物滴滤反应器和生物滤

19、池处理同种废水,运用PCR-DGGE考察了不同反应器中的氨氧化细菌菌群的组成。虽然不同形式反应器或是同一反应器的不同位置中的氨氧化细菌菌群组成不同,但是主要种群是不依赖反应器的形式或是在反应器中所处的位置不同而改变的,也正是这些主要种群在整个处理过程中发挥着重要的作用。Curtis等11采用PCR-DGGE比较了不同污水处理厂的活性污泥中总微生物群落的多样性。裘湛等12采用PC R-DGGE技术对处理采油废水的水解酸化-缺氧法不同生物反应器中污泥样品进行研究,确定了微生物的优势菌种,并进行了多样性分析,结果显示了在不同环境条件下微生物群落结构的连续动态变化过程。3.2在废气生物处理研究中的应用

20、生物过滤作为一种能够有效处理恶臭和挥发性有机废气的污染控制技术,由于其简单高效,得到了快速的发展。生物滤池和生物滤塔作为生物处理气体的典型。陈桐生13等采用PC R-DGG E技术研究除臭生物滤池中试装置中分别处于较强酸性和中性的两种不同运行环境下微生物种群的多样性和生物种群的结构变化。通过扩增细菌16Sr RNA基因的V3可变区,结合应用DG GE技术分析除臭生物滤池的生物种群的结构变化,并回收主要的D NA片段,结合PCR测序及T载体克隆测序,明确优势菌群的系统发育地位。结果表明,除臭生物滤池在不同的p H条件下,微生物的多样性及其丰度存在较大差别,强酸性对微生物具有较高的选择作用,与中性

21、条件相比,微生物种群多样性相对较低。同时在滤池的不同层次#95#上也表现出明显的空间分布多样性差异,序列比对结果显示硫氧化细菌在除臭过程中占有优势地位,为更好地处理恶臭气体提供可靠的科学依据,同时也为生物除臭的应用提供一定的理论基础。李建军等14利用D GGE技术对处理甲苯废气的生物滴滤池中微生物生态学进行了研究,在运行过程中,随着生物滴滤池对甲苯去除能力的不断增加,填料当中的微生物种群也发生了明显的变化。在甲苯的选择压力下,随时间的迁延,微生物种类减少,优势种群的相对丰度增加,处于不同层面填料上的微生物分布也趋向于一致。殷峻等15应用D GGE技术对处理含氨废气的生物滤塔中微生物多样性随时间

22、的变化进行了研究,通过比较反应器不同填料、不同时期微生物多样性得出结论:填料中微生物的多样性都随着反应器运行时间的延长而有所减少;与污泥填料和混合填料相比,堆肥填料的微生物多样性程度最高,反应器的去除能力也最好。3.3在固废生物处理研究中的应用在固废处理过程中,污泥的稳定化和餐厨垃圾的处理是当前要解决的重要问题。微生物的稳定化过程对于系统达到稳定状态具有更直接的指导意义。李竺等16利用DG GE对快速高效堆肥处理城市污泥中微生物进行了多样性研究,结果表明污泥中的微生物种群有显著的改变,同时对堆肥后污泥中的微生物进行了尝试性探讨。原泥中无明显亮带,而堆肥高温期物料(反应8d与回流物料和出料(均反

23、应16d有较为明显的亮带,这说明该堆肥工艺对污泥中微生物的种群构成有明显的作用,原泥中并无明显优势菌种,而经堆肥后泥样中有明显优势菌种出现,这可能是堆肥过程中起积极作用的微生物实现了污泥的减量化和稳定化。傅以钢等17用D GGE指纹图谱技术对污泥堆肥工艺中的细菌种群动态变化及多样性进行了研究。结果表明,生物法污泥堆肥周期小于8d。对污泥堆肥各工艺环节样品进行DG GE指纹图谱和相似性系数Cs值分析,发现随着反应的持续进行,微生态结构的Cs值越来越高,说明微生物种群结构愈趋稳定。证实污泥微生态能迅速进行优胜劣汰的筛选,调整内部细菌种群结构,从而达到适应环境的目的,在发酵过程中形成的优势细菌种群能

24、长时间保持稳定。刘有胜等18利用D GGE技术对城市餐厨垃圾堆肥过程中细菌种群结构随时间的变化进行了研究。D GGE图谱显示,不同时间堆肥样中细菌D GGE图谱有着明显的差异性;堆肥升温期细菌种群丰富,优势种群不明显;高温期细菌种群减少,优势种群明显;降温期细菌种群结构基本保持稳定。温度对堆肥过程中细菌种群具有明显的筛选作用。堆肥各阶段D GGE图谱相似性Cs值比较低,堆肥处理后细菌种群结构与堆肥原料之间存在明显差异。4不足与展望在短短十年内,DGGE技术已经成为微生物群落遗传多样性和动态分析的强有力工具,还存在着不足:实际微生物细胞壁的坚实度不同获得样品中所有种类微生物的r D N A难度加

25、大,容易导致提取DNA不完全;实际PCR扩增过程中不均等扩增(Bi2 as、有些微生物r D NA条数不同等都会造成PCR结果的代表性下降;理论上对于500bp以内含GC堆积r D NA,DGGE可以分离其所有点变异的95%,但实际上来自一种微生物的DN A量不到样品D NA量的1%时,肉眼难以检测其条带。因此,D GGE技术作为一项新兴的研究手段和工具,还需要在以下几个方面进行加强和改进:(1需要摸索适合具体样品的D NA提取方法和最佳PC R条件;(2优化DG GE条件和仔细分析具体结果。此外,还应该加强DG GE技术与其它技术的联用:D GGE方法可能采用双梯度D GGE/TG GE,如

26、联合使用一个丙烯酰胺梯度或温度梯度以达到更好的分辨率;利用末端标记的荧光PCR产物、附加荧光内泳道标准化检测稀少群落组成和精确的样品对样品比较。使用功能型基因作为分子标记也能区别关系相近但生态差异的种群;DG GE与克隆文库等技术结合,可克服局限性,充分发挥分离的优势。目前的发展趋势是PC R-D GGE/TG GE与其他分子技术以及微生物学、地球化学方法联合使用,这样可以减少不同技术的弊端与局限性,综合各种技术的优势,从而更真实地揭示环境微生物群落结构和功能的本质。5结语DGGE技术作为一项新兴有力的研究工具,已成为环境微生物群落遗传多样性和动态分析的强有力工具,DGGE技术及其它分子生物学

27、技术的引入将为中国环境科学和污染防治研究领域的基础理论研究提供强有力的武器,同时也会促进工程实践的快速发展,对中国的环境污染控制作出贡献。参考文献:1Muyzer G,S m a lla K.App lica ti o n of denatur i ng gradient ge l electrophoresi s(D GGEand te m perature gradient ge l e l ectro2 phoresis(T GGEi n m i cro b ial ecol ogyJ.Antonie van Leeu wen2 hoek,1998,73:127-141.2Muyzer

28、G,W aa l EC,U itterli nden AG.Profili ng of co m2 plexm i crobial po pu l ati ons by denat ur i ng gradi ent gel electrophoresi s ana l ysis of pol y merase chain reacti on a mp lifi ed genes encodi ng for 16S r RNAJ.Appl Environ M icro b i o,l1993,59:695-700.3LaPara T M,Ko no pka A A,Nakastu C H,et

29、 a.l Eff ect s of elevated te mperat ure on bacterial co mmunity st ructure and func2 tio n i n b i oreactors t reati ng a synt heti c waste waterJ.M icro b i o.l Biotechno.l,2001,24(2:140-145.(下转第99页#96 #第33卷第10期2008年10月卓燕等#C AS T工艺在制革废水处理中的应用Vol133N o110Oct.2008表2制革废水处理效果m g/l月份进水C OD c r B OD5S2-

30、总Cr p H值出水C OD c r B OD5S2-总Cr pH值2225096030129.5235650.750.988.5 32780125058258.5265780.821.028.4 42650115052239.0263720.951.257.6 52350105040198.8242630.650.868.0 62730118062277.8273840.731.188.2 72580107548188.3255680.861.057.8 (注:以上指标均为当月多次测定的平均值。5主要经济技术指标该工程总投资为175万元,总占地面积为600 m2。该废水处理站总装机功率为45

31、15K W,使用功率为3918K W。运行成本为1.52元/,t其中人工费0105元/t、电费0182元/t、药剂费0155元/,t污泥外运费0110元/t。6结论(1通过分流和采用物化作为预处理工艺,取得较理想的COD和色度去除效果,对COD的去除率达到了50%以上,大大地降低了后续生物处理的负担,为达标排放提供保障。(2CAS T工艺保持了典型的完全混合特性,处理效果好,抗冲击能力强的特点,对COD cr、B OD5、S2-、总Cr的去除率均在90%以上,处理出水优于国家二级标准。(3CAS T设置生物选择器,促进絮凝型细菌的生长和繁殖,从而抑制了污泥膨胀的发生,高效地进行硝化反硝化,脱氮

32、除磷效果显著。(4应用物化-CAST工艺处理制革污水,工艺流程简单,采用矩形结构,节约工程基建投资,运行时,不需要大量的污泥回流,自动化程度高,实现自动控制,运行灵活,方便维护管理,降低处理费用,所以建设和运行费用低。参考文献:1卓燕,滕国,杨刚,等.南海皮厂有限公司污水处理工程竣工验收及报告R.睢宁县环境监测站,2004:6-8.2张自杰.排水工程(下册M.中国建筑工业出版社,1994:216-219.3刘立伟.制革工业废水治理技术现状分析.污染防治技术J.1992,6(3:21-22.4陶如钧.物化-水解酸化-CAST工艺处理制革废水.工业给排水J.2003,29(9:31-32.5李刚,杨立中,欧阳峰.中国制革工业废水处理技术评述.四川环境J.2001,6(4:5-7.6梁兵兵.铁碳+F enton氧化法应用于制革废水的工程实例.皮革化工