黄曲霉毒素的检测方法研究方案进展综述.docx

1、黄曲霉毒素的检测方法研究方案进展综述黄曲霉毒素的检测方法研究进展(综述)刘作新 ，高军侠(1中国科学院沈阳应用生态研究所，沈阳110016；2中国科学院研究生院，北京100039)摘要：黄曲霉毒素(aflatoxin，AFT)是一类有毒致癌化合物，污染粮食及其制品，给人类健康造成严重威胁。本文对目前用于黄曲霉毒素的检测方法进行了综述。在对薄层层析法、高效液相色谱法、微柱法及酶联免疫吸附法等检测方法综合分析的基础上，评述了上述方法的优劣和适用条件。关键词：黄曲霉毒素；检测方法；进展黄曲霉毒素(aflatoxin，AFT )主要是由黄曲霉和寄生曲霉等真菌产生的一类有毒次生代谢物。在世界不同地区都发

2、现了这些真菌大量存在于供人类食用的食品中，黄曲霉毒素污染已导致严重的食品安全问题1,2 。自20世纪60年代以来，有关黄曲霉毒素的危害被大量报道，以致黄曲霉毒素已成为最受人们关注的一种真菌毒素 3。因此，寻求准确、快速、简便的检测方法，对黄曲霉毒素进行高效的定性定量分析，是黄曲霉毒素研究的一个重要方面。1.黄曲霉毒素研究概况迄今为止，已经发现的黄曲霉毒素至少包含黄曲霉毒素B1、B 2、G1、G2 、M1、M2 等l7种结构相似且特征已知的化合物，其结构特征为都含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮。黄曲霉毒素的理化性质比较稳定，如B1 在高温200、紫外线照射下，都不能使之破坏，加热到B1的熔点(2

3、68269C)才开始分解；在酸性溶液中，B1也很稳定，在pH 13的强酸性溶液中则稍有分解【2】 。黄曲霉毒素的毒性为氰化钾的l0倍，砒霜的68倍，能引起人急性中毒死亡，与人的肝癌有密切关系，能使家畜、家禽及多种实验动物诱发癌症，其中B1、B2 、G1、G2 是最主要的毒素物质，而B1是自然发生潜力最大的一种毒素【4,5】 。2 黄曲霉毒素的检测方法黄曲霉毒素的检测方法从最初以薄层层析法为主，发展到高效液相色谱法、微柱法、酶联免疫吸附法等多种方法普遍应用，其进展与新的化学检测手段和新仪器的出现密不可分。这些新方法、新手段的快速应用，为黄曲霉毒素的检测提供了更广泛的选择余地，适应了不同的检测目的

4、和要求6.21 薄层层析法(TLC)薄层层析法是测定黄曲霉毒素的经典方法，其原理是将样品经过提取、柱层析、洗脱、浓缩、薄层分离后，在波长365 nm紫外光下产生蓝紫色或黄绿色荧光，并根据其在薄层上显示的最低检出量来确定其含量。聂孝同等【7】 应用薄层层析法采用以下步骤对饲料中的黄曲霉毒素进行了检测。首先是黄曲霉毒素的提取：把粉碎过20目筛的样品放人具塞三角瓶中，加入甲醇(55：45)溶液，再加入石油醚盖严，静置片刻后，用慢速定量滤纸过滤于分液漏斗中，通人三氯甲烷，再过滤并将滤液在65水浴上通风挥干，冷却后加入苯一乙腈(98：2)充分混合，然后吸取上清液待用。对杂质少的样品，采取直板定性。依次点

5、板、展开、观察；其中预展展开剂为无水乙醚，正展展开剂为丙酮一三氯甲烷(1：9)，且展开剂要事先加入到展开槽内；通过观察，无荧光出现为阴性出现荧光则为阳性，需作直板确证，若继续有荧光出现，则进一步作定量确证；样品的某一点荧光强度与标样点的荧光强度相一致，则取此点为样本的黄曲霉毒素含量值，否则作稀释定量检测；但是对于杂质多的样品，须采取横板定性；同样经过点板、展开、观察，有荧光者为阳性检出，进一步作横向确证，经再次检测观察呈阳性，则需要定量确证黄曲霉毒素含量。为了提高薄层层析法的精度，建立薄层扫描法来测定黄曲霉毒素，它是薄层层析法的仪器化，样品的处理和层析条件与薄层层析法相同，只是在标准品的设定和

6、结果判定上有所不同。杨焱等【8】 把粉碎过筛的样品加水湿润后通人氯仿过滤，取滤液在65水浴上挥干，再用苯一乙脯溶液转移；通过点板，用乙醚预展后，再用氯仿一丙酮(92：8)展开，在365 nm紫外光下观察，根据AFB1、AFB2 、AFG1和AFG2分别显示的蓝紫色、蓝紫色、绿色和绿色荧光，在扫描仪上绘制AFT扫描图谱，并由此分辨出黄曲霉毒素种类；最后作定量分析：以斑点面积积分值为纵坐标，标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线，建立回归方程，得到样品的黄曲霉毒素浓度。22 高效液相色谱法(HPLC)用高效液相色谱法测定黄曲霉毒素，一般分提取、净化、衍生和测定几个步骤。提取通常是黄曲霉毒素分析的第一步，

7、所用的仪器和溶剂有很多种 2,9韩红岩等 10对于受黄曲霉毒素污染不同程度的玉米用60甲醇、80丙酮、90 乙腈提取，均得到较高的回收率，其中，80丙酮的毒性与乙腈、甲醇相比较小，操作较为安全，是提取黄曲霉毒素的最佳选择；王光建等 11给样品中加入甲醇(6：4)溶液，高速捣碎，将提取物于离心管离心510 min后，给上清液中加入氢氧化铁悬浮液搅匀，再加人Tris一盐酸缓冲液，离心后待用；李佐卿等12 首先加人氯化钠，再加人甲醇(1：9)超声震荡，经045 m滤膜过滤即可，而加人氯化钠的目的是作为抗原与抗体的稀释液，调节抗原与抗体反应时的pH值、电解质等，提高提取效果。文镜13 把经粉碎过20目

8、筛的样品放人具塞锥形瓶内，用重蒸水湿润，通人氯仿振摇，然后加人无水硫酸钠经快速滤纸过滤备用。专用于黄曲霉毒素净化分离的固相萃取方法主要有2类：一类是免疫亲和柱(IAC)，另一类是多功能净化柱(MFC)。免疫亲和柱是根据单克隆抗体与载体蛋白偶联后将其填柱形成IAC，并与黄曲霉毒素抗原产生一一对应的特异性吸附关系制作的。随着抗体抗原一一对应的特异性吸附关系，IAC只能高选择性地吸附黄曲霉毒素，而让其他杂质通过柱子，同时这种吸附又可被极性有机溶剂洗脱，供定量检测。王光建等11用免疫亲和柱分离黄曲霉毒素，先加人DDH2O搅匀，以2 3 mL/min 速度通过免疫亲和柱，用10 甲醇溶液洗涤烧杯、针筒等

9、。将洗涤液过柱，再用水洗涤，抽气除去柱中水滴，最后用甲醇洗脱，收集洗脱液。李佐卿等12 用免疫亲和柱净化黄曲霉毒素，先以25 mL/min 左右的流速过柱，再以4.0mL/min 左右的流速用水洗柱，弃去流出液，最后用甲醇以每秒1滴的速度洗脱，收集洗脱液；他认为样品过柱时的流速对回收率影响最大，建议用水洗柱时流速以40 mL/min 为佳，而以甲醇洗脱时应自然滴下，直至空气进人柱内，并且当甲醇的含量小于20时，黄曲霉毒素B属的结果不受影响，而G属以甲醇(1：9)为佳。即使如此，G属的回收率也没有B属回收率高，这可能是因为B1的毒性最大，为了保证B1的回收率，在设计柱体时牺牲部分G属的回收率，使

10、条件尽量对B1不十分苛刻。多功能净化柱(MFC)以极性、非极性及离子交换等几类基团组成填充剂，可选择性地吸附样液中的脂类、蛋白质等杂质，黄曲霉毒素不被吸附而直接通过，这样样品不需要进行活化、淋洗和洗脱操作，10 s内即可完成整个净化过程，净化效果理想。柳洁等14 利用该种方法，使提取液通过固定相进入套管，再将套管中的纯化液移至试管。除了上述方法外，宋欢 15应用佛罗里硅土层析柱，用氯仿一甲醇(9：1)淋洗，弃去流出液，最后用丙酮(99：1)溶液洗脱。文镜13 利用硅镁吸附柱，依次加人氯仿一乙烷(1：1)、氯仿一甲醇(9：1)，以2 mL/min 流速淋洗除去杂质，再用丙酮(99：1)溶液将混合

11、液洗脱。衍生方法可分为柱前衍生法和柱后衍生法16 。对黄曲霉毒素衍生的目的主要是为了增加测定时的荧光强度，柱前衍生法主要有三氟乙酸和稀盐酸法，柱后衍生法主要有溴法和碘法。柱后衍生需增加泵、校后反应器和控温箱等装量。在实践中以柱前衍生较多，因柱前衍生法容易推广，且大多采用三氟乙酸衍生，并在衍生前后分别用氮气或直接吹气挥干 14,15。还可用其他溶剂衍生，如李佐卿12 利用己烷和三氟乙酸，文镜13 利用正己烷和三氟乙酸进行衍生等，亦取得了理想效果。高效液相色谱法测定黄曲霉毒素，选用的激发波长为365 nm，发射波长为450 nm，以保留时间定性，峰面积定量，这些基本参数大致相同，但在流动相的选用上

12、却差异较大。宋欢15采用30 甲醇溶液作为流动相，流速为12 ml/min：王光建等11采用水一甲醇一四氢呋喃(575：420：5)作为流动相，流速为1 ml/min；文镜 13采用磷酸二氢钾一甲醇(1：1)作为流动相，流速为15 ml/min；李佐卿等12 采用水一异丙醇一乙腈(80：12：8)作为流动相，流速为07 ml/min；柳洁等14 采用甲醇一乙腈一水(15：13：72)作为流动相。此外，高效液相色谱法测定黄曲霉毒素还有许多其他的流动相组合，例如水一乙脂一乙酸(45：53：2)、乙腈一水(3：7)、水一乙腈一甲醇(60：30：10)等17 。23 微柱法微柱法测定黄曲霉毒素，是利用

13、微柱管内的硅镁型吸附剂吸附黄曲霉毒素并在365 nm紫外光下显示荧光，其强度与一定浓度的黄曲霉毒素含量成正比关系，由此可简略定量黄曲霉毒素。陈达民18 通过微柱法采用以下步骤测定黄曲霉毒素：先把粉碎过20目筛的样品放在碘价瓶中，加入石油醚和甲醇溶液，给瓶塞上涂一层水，盖严防漏，放在振荡器上振荡；等静置分层后，用快速定性滤纸过滤，用移液管吸取甲醇溶液并加人氯仿，再静置分层，将氯仿提取液经无水硫酸钠脱水过滤，加人制好的微柱管中，待加液流至顶层时，加人氯仿一丙酮(9：1)展开剂展开，流完后即可在365 nm紫外光下观察结果，有微黄色荧光出现，则样品不含黄曲霉毒素，若蓝紫色荧光出现，则为阳性检出，再根

14、据其荧光强度与事先已知含量的黄曲霉毒素标准管相比较确定其含量。24 酶联免疫吸附法(ELISA1酶联免疫吸附法是抗原(抗体)吸附剂和用酶标记的抗体(抗原)与标本中的待测物(抗原和抗体)起特异的免疫学反应，用测定酶活力的方法来增加测定的敏感度。大致采用两种方式检测黄曲霉毒素，一种是用双抗体夹心法，另一种是用竞争法。Holladay等19采取间接ELISA技术，检测了抗黄曲霉毒素M。一牛血清白蛋白(AFM 一BSA)免疫原的特异性AFM，抗体。为了使用方便，利用酶联免疫原理研制出黄曲霉毒素快速测试盒，能简便地定量测定黄曲霉毒素含量。赵晓联等20应用这种快速测试盒测定黄曲霉毒素含量，先用三氯甲烷提取

15、样品，过滤，收集并水浴挥干提取液，再以甲醇(5：5)溶解，最后用专用黄曲霉毒素试剂盒测定。25 其他方法超光谱(HS)方法是基于反射能基础上的一种非侵入无破坏的映像技术，用于农产品检测中，能够快速地提供该产品的有关化学和其他方面的内部细节21 。David Casasent等 22 尝试性地用它来检测玉米中黄曲霉毒素含量，但它似乎能更好地用于霉菌识别。进一步地开发利用还有待于解决HS特征选择的最优化问题。另据研究报道23 ，培训黄蜂可用于黄曲霉毒素检测。由于黄曲霉毒素主要是由黄曲霉产生的，寄生黄蜂通过培训能把黄曲霉的气味和糖水联系起来，并对这些气味产生有区别的行为反应，借此来识别目标气味的存在

16、。这种培训反应正在应用于储藏玉米、花生的黄曲霉毒素监控和检测实践当中，目前还未给出有关的结果评定。3 存在问题及展望薄层层析法对样品处理繁琐，实验过程复杂，所需时间多，易受杂质干扰，较适合于对黄曲霉毒素的定性检测，是研究黄曲霉毒素初期所使用的主要方法。今后，虽然薄层层析法在不断地改进，并在一般实验室均可完成操作，但由于它复杂的前处理过程致使在应用中仍然会受到一定程度的限制。高效液相色谱法测定黄曲霉毒素，技术水平要求较高，目前采用这种方法检测黄曲霉毒素较多，但具体一次实验所使用的化学药剂和处理途径差别很大，对实验结果的精度造成影响，这种方法还应在实践中进一步改进。但总体上说高效液相色谱法操作较为

17、简便，同时可检测多个黄曲霉毒素种类，适于大批量样品的分析。将免疫亲和柱与高效液相色谱法结合应用，是目前采用较多的一种方法，今后将被广泛应用。微柱法测定黄曲霉毒素，主要是用来检验黄曲霉毒素的存在与否以及快速筛选出超标样品，而要对黄曲霉毒素种类进行区分定量检验，则需要对不同黄曲霉毒素组分进行分离，再利用其他方法检测。因此微柱法并不能完成整个黄曲霉毒素检测过程，仅适用于定性检验。酶联免疫吸附法操作简便，使用较为安全，但由于酶本身的不稳定性，用此方法检验黄曲霉毒素有可能带来假阳、阴性结果，而且研制出的黄曲霉毒素快速测试盒多以测定最具毒性的种属为主，食品和饲料工业上利用它来界定食品或饲料中黄曲霉毒素的超

18、标问题。酶联免疫吸附法的检测精度还有待于提高。黄曲霉毒素特有的极大危害性和广泛分布，给环境安全部门提出了一系列尖锐问题。高效液相色谱法和酶联免疫吸附法在应用中仍需不断改进和完善。为分析黄曲霉毒素提供方便和快捷的手段，达到及早预防和去除黄曲霉毒素污染的目的，还应研制探索新的检测方法，显然，寻求快速、准确且经济可行的检测方法已成为黄曲霉毒素研究中亟需解决的任务之一。参考文献：1Brown R L，Bhatnagar D，Cleveland T E，et a1Recent advances in preharvest prevention of mycotoxin contaminationAKKS

19、inha(eds)Mycotoxins in Agriculture and Food SafetyCNew York：Marcel Dekker，19983513792Charles L，Wilson，Samir DrobyMicrobial Food ContaminationMNew York：CRC Press20012082293Bhatnsgar D，Yu J，Ehrlich K CToxins offilamentous fungiAIn：M Breitenbaeh(eds)Fungal Allergy and PathogenicityChem ImmunolCVol 81，B

20、asel，Karger，20021672064裘维蕃菌物学大全M北京：科学出版社，19987237355Yu JGenetics and biochemistry of mycotoxin synthesisAIn：D K Arora(ed)Handbook of Fungal BiotechnologyM2nd edNew York：Marcel Dekker20021672066Jane RobensNovel technologies for aflatoxin detectionopening remarksAProceedings of the 2nd Fungal Genomics

21、，3rdFumonisin Elimination and 15th Aflatoxin Elimination WorkshopsCTexas200254547聂孝同，卢大云饲料黄曲霉毒素的检测方法J贵州畜牧兽医，1993，17(1)：4l428杨焱，宓晓黎，成恒嵩等薄层扫描法测定饲料中黄曲霉毒素B，的含量J饲料工业，1996，17(10)：3637【9Edward J TImproved liquid chromatographic method for determination of aflatoxins in peanut butter and other commoditiesJJ

22、 AOAC，1984，67(3)：59760010韩红岩，汪军玉米中黄曲霉毒素提取方法的评价J山东农业大学学报，1999，30(3)：241244 11王光建，何才云，鲁长豪等用免疫亲和柱分离、高效液相色谱法测定花生和玉米中黄曲霉毒素的研究J色谱，1995，13(4)：23824012李佐卿，谢东华，孙大为等免疫亲和柱HPLC荧光检测酒中黄曲霉毒素B1、B2 、G1、G2 J光谱实验室，2001，8(1)：2831 13文镜玉米中黄曲霉毒素B的硅镁吸附柱层析分离纯化及HPLC的定量分析J食品科学，1996，17(1)：687014柳洁，何碧英高效液相色谱法测定食品中黄曲霉毒素的方法研究J现代预

23、防医学，2002，29(2)：13714015宋欢液相色谱法测定饲料中的黄曲霉毒素BJ山西农业大学学报，2001，21(3)：25725816Octave J F Jr，Gary P K，George M W，et a1B-Cyclodextrin post-column fluorescence enhancement of aflatoxins for revelephase liquid chromatographic determination in CO121JJ AOAC，1988，71(4)：72572817黄惠明，徐群英，胡敏黄曲霉毒素检测方法研究的概述J中国卫生检验杂志，20

24、01，11(4)：51051218陈达民微柱法快速测定饲料中黄曲霉素的总量J饲料工业，1993，14(1)：293019S D Holladay问接酶联免疫吸附试验检测黄曲霉毒素抗体的评价J贵州畜牧兽医，1993，17(1)：464720赵晓联，赵春城，钮伟民等酶联免疫吸附法测定黄曲霉毒素B。误差分析J中国卫生检验杂志，2001，11(4)：473 47421G H PooleThe potential of hyperspectral imaging for the detection of aflatosinAIn：Corn refiners associmion(eds)Proceedi

25、ngs of the 2nd Fungal Genomics，3rd Fumonisin Elimination and 15th Atlatoxin Elimination WorkshopsCTexas，2002555522David Casasent，Xue Wenchen，Songyot Nakariyaku1Hyperspectral methods to detect aflatoxin in whole kernel COrnAIn：Corn refiners association(eds)Proceedings of the 2nd FungM Genomics，3rd Fu

26、monisin Elimination and 15th Atlatoxin Elimination WorkshopsCTexas，2002565623Glen C Rains，W Joe Lewis，David M WilsonTrained wasps as chemicM detectors：application for aflatoxin mimed issuesAProceedings of the 2nd FungM Genomics，3rd Fumonisin Elimination and 15th Aflatoxin Elimination WorkshopsCTexas20025757