琼脂糖电泳.docx

1、琼脂糖电泳琼脂糖电泳琼脂糖电泳技术一、琼脂糖凝胶电泳可以：（1）用于DNA切胶回收；（2）用于DNA分离；（3）用于佐证DNA是否重组、质粒等是否切开以及其他分子生物学研究。二、DNA分子量标准的制备采用EcoR或Hind酶解所得的DNA片段来作为电泳时的分子量标准。DNA为长度约50kb的双链DNA分子，其商品溶液浓度为0.5mg/ml，酶解反应操作如上述。HindIII切割 DNA后得到8个片段，长度分别为23.1， 9.4， 6.6， 4.4， 2.3， 2.0， 0.56和0.12kb。EcoRI切割lDNA后得到6个片段，长度 分别为21.2， 7.4， 5.8， 5.6， 4.9和

2、2.5kb。三、琼脂糖凝胶的制备1、取5TBE缓冲液20ml加水至200ml，配制成0.5TBE稀释缓冲液，待用。2、胶液的制备：称取0.4g琼脂糖，置于200ml锥形瓶中，加入50ml 0.5TBE稀释缓冲液，放入微波炉里(或电炉上)加热至琼脂糖全部熔化，取出摇匀，此为0.8%琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜，以减少水份蒸发。3、胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏(宽约1cm)紧密封住。将封好的胶槽置于水平支持物上，插上样品梳子，注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。向冷却至50-60的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(E

3、B)溶液使其终浓度为0.5g /ml(也可不把EB加入凝胶中，而是电泳后再用0.5g/ml的EB溶液浸泡染色)。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧，待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内，使胶液形成均匀的胶层。倒胶时的温度不可太低，否则凝固不均匀，速度也不可太快，否则容易出现气泡。待胶完全凝固后拨出梳子，注意不要损伤梳底部的凝胶，然后向槽内加入0.5TBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。因边缘效应样品槽附近会有一些隆起，阻碍缓冲液进入样品槽中，所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液。4、加样：取10l酶解液与2l 6载样液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中。若DNA含量偏低

4、，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要更换tip头，以防止互相污染，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。5、电泳：加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电源。控制电压保持在60-80V，电流在40mA以上。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时，停止电泳。6、染色：未加EB的胶板在电泳完毕后移入0.5g/ml的EB溶液中，室温下染色20-25分钟。7、观察和拍照：在波长为254nm的长波长紫外灯下观察染色后的或已加有EB的电泳胶板。DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩，以免损伤眼睛。 经照相机镜

5、头加上近摄镜片和红色滤光片后将相机固定于照相架上，采用全色胶片，光圈5.6，曝光时间10-120秒(根据荧光条带的深浅选择)。8、DNA分子量标准曲线的制作：在放大的电泳照片上，以样品槽为起点，用卡尺测量DNA的EcoR和Hind酶切片段的迁移距离，以厘米为单位。以核苷酸数的常用对数为纵坐标，以迁移距离为横坐标，在坐标纸上绘出连结各点的平滑曲线，即为该电泳条件下DNA分子量的标准曲线。9、DNA酶切片段大小的测定：在放大的电泳照片上，用卡尺量出DNA样品各片段的迁移距离，根据此数值，在DNA分子量标准曲线上查出相应的对数值，进一步计算出各片段的分子量大小(若用单对数坐标纸来绘制标准曲线，则可根

6、据迁移距离直接查出DNA片段的大小)。反之，若已知DNA片段的大小亦可由标准曲线上查出它预计的迁移距离。10、DNA酶切片段排列顺序的确定：根据单酶切，双酶切和多酶切的电泳分析结果，对照DNA酶切片段大小的数据进行逻辑推理，然后确定各酶切片段的排列顺序和各酶切位点的相对位置。以环状图或直线图表示，即成该DNA分子的限制性内切酶图谱。注意1.酶切时所加的DNA溶液体积不能太大，否则DNA溶液中其他成分会干扰酶反应。2、酶活力通常用酶单位（U）表示，酶单位的定义是：在最适反应条件下，1小时完全降解1mg lDNA的酶量为一个单位，但是许多实验制备的DNA不象lDNA那样易于降解，需适当增加酶的使用

7、量。反应液中加入过量的酶是不合适的，除考虑成本外，酶液中的微量杂质可能干扰随后的反应。3、市场销售的酶一般浓度很大，为节约起见，使用时可事先用酶反应缓冲液（1）进行稀释。另外，酶通常保存在50%的甘油中，实验中，应将反应液中甘油浓度控制在1/10之下，否则，酶活性将受影响。4、观察DNA离不开紫外透射仪，可是紫外光对DNA分子有切割作用。从胶上回收DNA时，应尽量缩短光照时间并采用长波长紫外灯(300-360nm），以减少紫外光切割DNA。5、EB是强诱变剂并有中等毒性，配制和使用时都应戴手套，并且不要把EB洒到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。6、当EB

8、太多，胶染色过深，DNA带看不清时，可将胶放入蒸馏水冲泡，30分钟后再观察。四、原理：琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳的最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。五、一、试剂配制1. 5TBE缓冲液：450 mmol/L Tris-硼酸，10 mmol/L EDTA，p

9、H值8.0。使用时将上述储存液稀释10倍至0.5TBE缓冲液，可同时作为电泳及制胶用的缓冲液。二、制胶1. 根椐制胶量及凝胶浓度，在加有一定量的电泳缓冲液的三角锥瓶中，加入准确称量的琼脂糖粉（总液体量不宜超过锥瓶的50%容量）。琼脂糖粉末与0.5TBE buffer的比例（w：v）参考表1，常用琼脂糖浓度为0.7-1%。表1 琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围琼脂糖浓度最佳线形DNA分辨范围（bp）0.50%1 00030 0000.7% 80012 0001%50010 0001.20%4007 0001.50%2003 0002%502 0002%5%201 0002. 在锥瓶的瓶口

10、上盖上保鲜膜或牛皮纸，并在膜或纸上扎些小孔，然后在微波炉中加热溶解琼脂糖。加热时，当溶液沸腾后，请戴上防热手套，小心摇动锥瓶，使琼脂糖充分均匀溶解。此操作重复数次，直至琼脂糖完全溶解。3. 使溶液冷却至50-60左右，如需要可在此时加入溴化乙锭溶液（终浓度0.5 g/ml）或按照1 L / 30 mL的比例加入DNAgreen染料，并充分混匀。4. 将琼脂糖溶液倒入制胶模中，然后在适当位置处插上梳子。凝胶厚度一般在35 mm之间。制胶模如下图所示，小胶倒入25-30 mL左右琼脂糖溶液，大胶则60-70 mL左右，若需切胶回收，凝胶可适当加厚。5. 在室温下使胶凝固，大约30分钟1小时。1.

11、5TBE缓冲液放置时间过久会沉淀，因此一次性不要配太多。工作用电泳缓冲液为0.5TBE缓冲液，取5TBE缓冲液贮存液稀释，现配现用。2. 用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须统一。3. 琼脂糖粉在微波炉中加热时间不宜过长，每次当溶液起泡沸腾时停止加热，否则会引起溶液过热暴沸，造成琼脂糖凝胶浓度不准，也会损坏微波炉。溶解琼脂糖时，必须保证琼脂糖充分完全溶解，否则，会造成电泳图像模糊不清。4. 凝胶不立即使用时，请用保鲜膜将凝胶包好后在4下保存，一般可保存25天。蛋白质和核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，根据这个原理可将其分开。电泳缓冲液的pH在69之间，离

12、子强度0.020.05为最适。常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。琼脂糖凝胶约可区分相差100 bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20 kb，利用脉冲电泳，可分离高达107bp的DNA片段。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。三、上样1. 取适量样品与6上样缓冲液混匀（如：1 l样品与5 l6上样缓冲液），用微量移液枪小心加入样品槽中。2. 上样量根据样品浓度可适当调整，若DNA含量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量（一般小孔40 l 为上限，大孔200 l 为上限，具体和制胶膜规格相关）。3. 每加完一个样品要更换枪头，以防止互相污染，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。四、电泳1.加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电源。控制电压保持在110 V，电流在40 mA以上。2. 当条带移动到距凝胶前沿约2 cm时（约40 min），停止电泳。3. 紫外下拍照并观察。