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1、基因工程原理中国农业科学院研究生院基因工程原理中国农业科学院研究生院摘要：（a） DNA分子的体外切割与连接技术; （b） DNA测序技术; （c） 基因克隆的载体的发展与应用; （d）大肠杆菌的转化技术; （e）琼酯糖凝胶电泳技术; （f） 核酸杂交技术， （a） 以mRNA材料出发，对于RNA病毒特别适用， c.无法进入溶菌周期，也不能形成噬菌体颗粒中国农业科学院究生院 基因工程原理复习题 一、名词解释 1. 原核基因（Prokaryotic gene）：由原核生物（如大肠杆菌）基因组编码的基因，以及高等生物细胞器线粒体基因组和叶绿体基因组等编码的基因，统称原核基因。2. 真核基因（Euk

2、aryotic gene）：真核生物基因组DNA编码的基因,以及感染 真核细胞的DNA病毒和反转录病毒基因组编码的基因，统称真核基因。3. .前导序列（Leader sequence）：又叫前导序列区或5-非翻译区（5-UTR），系指位于mRNA5-起始密码子之前的一段长数百个核苷酸的不翻译的RNA区段。4. 尾随序列（Tai1er sequence）：又称尾随序列区或3-非翻译区（3-UTR），系指位于mRNA3-终止密码子之后一段100多核苷酸的不翻译的RNA区段。5 复制子（Replicon）： 指有一个复制起始区（oriC）和起始基因的DNA复制单元。例如细菌染色体、病毒基因组、质粒基

3、因组等，凡其DNA能够进行复制的遗传单元，均称复制子。真核细胞基因组的复制子是指含有一个复制起始位点的DNA（RNA）的复制子特称复制单元。6. 增强子 （Enhancer）：又叫增强子序列或增强子元件，是真核基因中发现的一 种特异序列，能够在距离目标基因50kb以上的位置，从上游或下游的不同位置及方向增强该基因的转录活性。7. 沉默子（Silencer）在真核基因启动子中除了增强子之外，沉默子同样也是一种可远距离调控相关基因转录活性的顺式元件。与增强子一样，沉默子也能够从启动子的上游、下游甚至是基因内部三种不同的位置以及正向或反向，影响相关基因启动子的转录起始效率。同时沉默子往往是以组织特异

4、性或时间特异的作用方式，控制基因的表达作用。但与增强子的功能效应相反，沉默子只能抑制而不能激活相关基因的转录起始活性。8. 绝缘子（Insulator）亦即是增强子活性的物理边界元件（physical boundary element），它是一段能够抑制或隔离增强子功能效应的顺式转录调节序列。绝缘子的这种功能作用的发挥，取决于它所在的位置。如果它是位于增强子和启动子之间，便能够阻断增强子的功能效应；但当它是位于增强子-启动子区段的外侧，便不能够阻断增强子的功能作用。因此也有的作者将绝缘子称为隔离邻近增强子对启动子激活作用的中间隔栅（neutral barrier）。绝缘子的作用是与特异结合蛋白

5、IBP的结合发挥作用。它的意义：能阻断增强子超远距离的激活作用影响生物的发育顺序；真核绝缘子能保护顺序表达以防无义基因的表达。9. 调节子（Regulon）：指在大肠杆菌基因组中，其表达活性受同一种基因编码的蛋白质协同调节的，一组不连续相邻排列的结构基因。调节子与操纵子不同之处在于，后者的结构基因是彼此相邻排列的，而调节子的结构基因则是分散于染色体的不同部位，甚至是位于不同染色体上 10. 基因差异表达（Differential expression of gene ）： 真核生物在每一特定的发育阶段，或是某一特定类型的细胞中，一般只有15%的基因进行表达。这种在生物个体发育的不同阶段，或是在

6、不同组织和细胞中，发生不同基因按时间、空间进行有序表达的方式，叫基因的差异表达。11. 基因内互补（Intragenic complementaion）： 系指编码同样的多肽序列，但又各具一个不同 突变的两个基因联合产生出一种有功能活性的蛋白质多肽的生化过程。12. 基因图（Gene map）：描述染色体或DNA分子上不同基因的排列顺序及其间隔距离的线性图。它包括遗传图和物理图两种。遗传图（genetic map）：是根据遗传重组实验绘制的，用来表示同一染色体上不同基因（或特定DNA序列区）之间的排列顺序及其相对距离的线性图。其图距用厘摩(cM)表示。物理图（Physical map）：以精确

7、的物理长度为单位，一般以核苷酸数表示不同基因在染色体或DNA分子上的排列顺序及其间隔距离的实际长度的线性图。13. 基因簇（Gene cluster）与基因家族（Gene family）：系指原核生物基因组中，由不同或相关的一组相合基因组成的一种特殊的排列组合方式。同一基因簇的各个基因在遗传上往往是紧密连锁，它们可以是属于同一操纵子的不同结构基因，也可以是不同操纵子的不同结构基因；它们可以是同一基因家族的不同成员，也可以是不同基因家族的不同成员。基因家族（Gene family：由同一生物中同一始祖基因经过重复突变进化而来，具相似的结构、相似的产物和相似的功能。它们的特征：（1）多重姓；（2）

8、紧密连锁（3）表型及功能方面的相关性；（4）核苷酸序列的一致性。14. 基因克隆（Gene cloning）：基因克隆又叫DNA克隆，它是指将外源基因插入到克隆载体上形成重组DNA分子群体，并转化到大肠杆菌寄主细胞中进行复制繁殖，以便从大分子DNA或DNA片段中分离纯化目的基因或特定的DNA片段的实验操作，叫做基因克隆或DNA克隆。15. 融合基因（Fusion gene）：亦称重组基因、杂种基因或嵌合基因。通常是指通过自发突变形成或利用DNA重组技术构建的。是一类具有来自两个或两个以上不同基因的核苷酸序列的新型基因。融合基因可以形成融合蛋白，但融合基因不一定都形成融合蛋白。16. 基因剂量

9、（Gene dosage）：指的是一个细胞所拥有的同一种基因的拷贝数。基因剂量实验是建立在局部二倍体菌株的基础上，专门来检测基因拷数的增加，对其编码产物合成速率之影响的分子遗传学的研究技术。17. 裂口（Gap）：双链DNA分子上的某一条链丢失一个或连续数个核苷酸造成的单链断裂。缺口（Nick）：双链DNA分子的某一条链的相邻核苷酸之间丢失一个磷酸二酯键造成的单链断裂。18. 切丁酶（Dicer）：亦有人译为RNAi核酸酶。是一种RNase样（RNase like）的核酸内切酶。能把双链RNA（dsRNA）分子切割成2123bp的小分子干扰RNA 。这是一种需要ATP的过程。19. 异裂酶（N

10、eoschizomer）： 指一组来源不同，但具有相同的识别序列和不同的切割位点的一组核酸内切限制酶称异裂酶 20. 同尾酶（Isocaudarner）：一组来源不同，识别序列各异，但能够切割形成相同黏性末端的核酸内切酶。21. 同裂酶 (Isoschizomer) 是一类来源不同，而识别序列相同，切割能产生相同的黏性末端的核酸内切酶。22. 拓朴异构酶（T0poisomerase）：在原核和真核细胞中发现的，具有催化单链DNA或双链DNA产生瞬时断裂的功能。具有切割与连接的双重功能，导致双链构型的改变。在抗癌研究中，发展抑制拓扑异构酶的活性的抗癌药物好的开发研制具有重要意义。23. 质粒DN

11、A迁移作用（Plasmid mobilization）：指由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程。由于结合型质粒的mob基因产生的迁移蛋白可作用于与其共存的非迁移型质粒的nic位点所产生的迁移作用，称质粒DNA迁移作用。24. 柯斯载体（Cosmid）：是一类人工构建的，含有噬菌体DNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。它既具有噬菌体的特性，也具有质粒载体的特性。并且具有高容量的克隆能力，其DNA可以体外被包装到噬菌体的外壳内。25. 噬菌体展示载体（Phage display vector）：根据单链噬菌体表面表达的蛋白质或多肽的噬菌体表面展示技术，当把外源基因插入在该载

12、体的基因或基因的编码序列中，正确表达出融合蛋白的这类特殊用途的噬菌体载体。26. 穿梭质粒载体（S huttle plasmid vector）： 简称穿梭载体，或叫双功能载体。是一类人工构建具有两种不同的复制起点和选择记号，因而可在两种不同寄主细胞（如大肠杆菌和酿酒酵母）中进行复制与存留的质粒载体。27. M13克隆体系的优点： a. 可方便地产生外源单链DNA； b. 重组子可用组织化学方法检测； c. lacZ基因上具多克隆位点，便于外源DNA插入； d. 可定向克隆外源基因； 28. 质粒载体的结构特点： a. 具复制起点（ori）； b. 具抗生素抗性基因（选择用）； c. 具若干核

13、酸内切酶的单切点； d. 较小的分子量和较高的拷贝数。29 启动子封堵（Promoter occlusion）：由一个上游启动子驱动的转录作用，当其通读过下游启动子时，便会使该启动子的功能受到抑制的现象，叫做启动子封堵。30.型核酸内切酶的特点：a. 不具有多亚基结构（单一切割功能）；b. 能识别双链DNA分子中靶子序列c.切割形成不同长度的限制片段; d由于不对称切割，能形成粘性末端; e 酶切反应不需能量ATP。31. 表观遗传信息层（Epigenetic layer of information）：它是贮藏在围绕DNA分子周围并与DNA分子结合的蛋白质及化学物质中。表观遗传信息如同RNA

14、基因一样令人困惑，甚至比RNA基因更为重要。32. 分子伴侣（Molecular chaperone）： 专指一类多功能蛋白质，它能促使某些蛋白质按正确方式组装或折叠，而它本身却不是最终形成功能蛋白质的组成部分，此类蛋白质特称为分子伴侣。33. RNA干扰（RNAi）：近年来研究发现，当一些小分子量的外源双链RNA进入寄主细胞后，便可促进与其同源的内源mRNA发生特异性的降解作用，从而高效而特异地阻断体内相应基因的活性，在细胞内发挥基因的剔除作用。这种现象叫RNA干扰。34. 生命体遗传信息的三个层次是： 第一层次是由编码蛋白质的基因组成，如人类基因组的基因编码序列占总DNA序列的不到2%；

15、第二层次：仅由编码RNA而不编码蛋白质的基因组DNA组成。这一部分DNA叫做非编码的DNA，它的转录产物称为非编码的RNA（不包括tRNA、rRNA和snoRNA），其相应的基因称为RNA基因。这类基因隐藏在巨大的非编码的染色体DNA序列当中。因此过去亦被称为隐藏基因（cryptic gene）； 第三层次：表观遗传信息层（epigenetic layer of information）。它贮藏于围绕在DNA分子周围并与DNA结合的蛋白质及其他化学物质中。表观遗传信息如同RNA基因一样令人兴奋，甚至比RNA基因更为重要。35. 全局调节（Global regulation system） 原核

16、生物如细菌细胞为了适应环境条件的大范围的重要变化，单靠一个操纵子作局部的调节显然是不够的，它还需一种能够同时调节许多相关操纵子的，特殊调节体系。这种调节体系称全局调节体系。它是由许多单一的调控途经，交织组成的一种复杂的调控网络，来应付外界环境的压力的同时，能适时快速作出反应。36 共线性 （Collinearity）：所谓共线性包括如下4种不同的情况： 其一是指位于同一条染色体DNA分子或是同一条DNA分子上，不同基因的位置排列关系。这种情况有时特称为同线性（Synteny）。其二是指不同物种的相关染色体DNA分子之间，基因排列顺序的一致性。其三是指位于DNA分子与其转录本RNA分子之间，核苷

17、酸碱基排列顺序的一 致性。其四是指位于DNA分子或mRNA分子上遗传密码子的排列顺序，与相应的蛋白质多肽链上氨基酸排列顺序之间的一致性。37. 基因工程诞生的理论基础和技术基础是什么？ （1） 理论基础： （a） 上世纪40年代明确了遗传物质携带者是DNA，而不是蛋白质;明确了基因的载体。（b）上世纪50年代相继揭示了DNA双螺旋结构模型和半保留复制机理，从而解决了基因的复制。（c） 上世纪50 世纪末和60年代初相继提出了中心法则和操纵子学说并成地破译了遗传密码子，从而解决了遗传信息的流向和基因表达问题。（2） 技术基础： （a） DNA分子的体外切割与连接技术; （b） DNA测序技术;

18、（c） 基因克隆的载体的发展与应用; （d）大肠杆菌的转化技术; （e）琼酯糖凝胶电泳技术; （f） 核酸杂交技术。38. RNA编辑（RNA editing）： 在有些基因的转录后加工过程中，会有大量的尿嘧啶核苷酸（Us）加入到前体mRNA（pre-mRNA）的核苷酸序列中去，或是从pre-mRNA的核苷酸序列中删除下来，甚至还会发生核苷酸碱基的取代反应。这种在RNA转录本成熟、修饰过程中发生的核苷酸的加入、删除或取代的现象，叫做RNA编辑（RNA editing）。如此碱基饰变的结果，使得RNA转录本的核苷酸序列与其对应的DNA链的核苷酸编码序列并不完全匹配。由此饰变的mRNA所转译的蛋白

19、质多肽链的氨基酸序列结构，便与按照其基因的核苷酸序列推导出来的有所差别。39（1）微小RNA(microRNA，miRNA)： 是在真核细胞中发现的一类调节型的、非编码蛋白质的、小分子量的单链RNA。miRNA是由内源基因组编码转录成的Pri-miRNA被果蝇酶切割生成70-80nt的pre-miRNA，经自我折叠成双链的发夹结构，进入细胞质后被切丁酶进一步切割并除去单链环，形成2125bp双链体(miRNA：miRNA*)分子，双链体解离出单链的存留链miRNA同目标mRNA结合阻止翻译，另一条消失链miRNA*被降解。39（2）miRNA与siRNA的比较 相似点： （1） 分子结构十分相

20、似。长度均为2125的小分子量RNA、 5，-端都具有P基团、3，-端都具有0H-基团； （2） 都通过与RISC结合的方式发挥功能作用； （3） 终极作用都是抑制mRNA的翻译活性，而导致基因沉默。不同点： （1） 生物合成途径不同； siRNA主要是由外源导入的双链(dsRNA)经切割产生的、少数的是由内源dsRNA切割产生。miRNA则不然，它是由内源基因组编码转录成Pri-miRNA，被果蝇酶切割生成70-80nt的pre-miRNA，由于pre-miRNA存在回文结构自我折叠成双链的发夹结构由输出蛋白的作用进入细胞质后被切丁酶进一步切割加工成2125bp小片段并除去单链环形成双链mi

21、RNA，双链体(miRNA：miRNA*)分子，解离出单链的存留链miRNA同目标mRNA结合阻止翻译，另一条消失链miRNA*被降解。（2）抑制翻译的方式不同； siRNA是通过与目标mRNA编码区中的靶序列的结合引导RISC复合物中的切段酶，从靶序列的中间部位切割断裂mRNA分子，从而抑制翻译。miRNA与此不同，它是通过与目标基因mRNA的 3，-UTR序列中的结合位点的序列互补作用，促使mRNA失去翻译活性。因此在miRNA作用过程中，虽然目标蛋白质的数量减少了，但其mRNA的丰度却没有明显的变化。（3）碱基互补水平不同； siRNA与靶序列之间核苷酸碱基的互补水平达百分之百的完全匹配

22、。但miRNA则依材料来源的差异而有两种不同的情况。植物mRNA与靶序列核苷酸碱基也是百分之百完全匹配的、而动物的miRNA与其结合位点的核苷酸碱基则不是完全互补的，两者之间存在着若干非配对的碱基。40. 微量碱法分离纯化质粒DNA的原理有如下几点： （1）根据质粒DNA与染色体线性 DNA在拓扑学上的差异。质粒DNA（cccDNA）是共价闭合双链超盘旋构型的小分子DNA，而细胞染色体DNA在细胞裂解分离过程中断裂成线性DNA（LDNA），虽然在化学本质上没有本质区别，但在高级结构拓扑学上存在差异。（2） 差异碱变性，在pH 12.0-12.5高pH条件下，线性的DNA容易变性解链，而质粒DN

23、A不易变性或很少变性。（3） 酸复性，在pH4.8条件下，cccDNA很快复性，而线性的染色体DNA不可逆的变性并与蛋白质、RNA形成沉淀物，通过离心可以把LDNA与cccDNA分开。cccDNA在上清液中。（4） 酒精沉淀cccDNA, 以2.5倍的95% 酒精沉淀质粒DNA，(浓度为66%沉淀最好)。保存在TE（pH8.o）缓冲液中，放置在20Co下保存备用。41. 图示ZAP载体的组成结构及优点： T3-MCS- T7 _ cos_ pBluescriptSK噬菌粒 _ _cos I LacZ T 结构组成：（1）含有具内删除特性的pBluescriptSK噬菌粒； （2）在pBlues

24、criptSK噬菌粒两端具有f1的起始子（I）和终止子（T）； （3）在pBluescriptSK噬菌粒内部具有两端带有T3和T7启动子的多克隆位点MCS； （4）在pBluescript的内部带有缺陷的LacZ基因； （5）在该载体的两端具有cos末端。ZAP的特点： （1）是一种具有内删除特性的插入型噬菌体载体， （2）可克隆10kb大小的外源DNA。（3）当外源DNA插入取向和读码结构正确，就能表达出融合蛋白质，并可用抗体筛选。（4）当外源DNA插入在多克隆位点，使半乳糖苷酶失活故可用Xgal显色的组织化学筛选重组子（白色为重组子）； （5）克隆的外源DNA可在体内随pBluescrip

25、t噬菌粒删除下来，省去了常规的亚克隆； （6）利用T3或T7噬菌体的RNA聚合酶，可方便地制备外源插入的DNA的任何一条链的mRNA。内删除源理：当含有外源DNA插入的重组ZAP载体，感染大肠杆菌F菌株，再用辅助噬菌体M13（或f1） 超感染。于是，在细胞内由此辅助噬菌体基因提供的反式作用蛋白质，便会识别位于ZAp载体上的f1起始子和终止子，并最终导致含有外源DNA插入的pBluescript噬菌粒在体内从ZAP载体上删除下来。最终被辅助噬菌体M13的蛋白质包装成单链DNA噬菌体颗粒，并被挤出寄主细胞。42. M13克隆体系中-半乳糖苷酶Xgal的显色原理 M13克隆体系包括M13克隆载体和M

26、13特殊的寄主菌株两部分组成。-半乳糖苷(LacZ)当它为四聚体时具有活性，可把无色的X-gal切割成半乳糖和深蓝色靛蓝，因此Xgal可作为-半乳糖苷酶活性的一种指示剂。由于LacZ基因分子量太大。依据基因内互补作用的原理。利用基因工程的方法，即将编码同样的蛋白质多肽链序列，但各自具突变的序列，当这种载体转入到特殊的寄主菌株中便组成具有功能活性的多肽的生化过程。根据这一原理，在M13克隆载体种上LacZHind片段具有-半乳糖苷酶第2-92位氨基酸，大肠杆菌F，因子上带有缺失了第11-42位氨基酸的缺陷性LacZ(简称M15基因)。当M13载体感染了这种M13特殊的寄主菌株如JM101后，便会

27、产生具有功能活性的-半乳糖苷酶，于是在含有指示剂Xgal和诱导物IPTG的培养基中，就会出现蓝色的噬菌斑。但当外源基因插入到M13克隆载体时，无法形成四聚体的具活性的LacZ，就不能切割Xgal，故白色噬菌斑为重组子。43. DNA标签法分离产物未知基因的原理及主要步骤 根据DNA插入突变作用原理，用已知的插入序列为探针，分离产物未知基因的方法。由于插入的DNA序列是己知的，人为地给目的基因加上标签 ，故称DNA标签法。主要步骤：（1） 当一段特定的DNA标签序列插入到野生型的基因的内部或其附近位点时，便会诱发该基因发生突变，形成突变体；（2） 用已知的标签序列作DNA分子探针，从突变体的基因

28、组DNA文库中筛选出突变的基因；（3） 再利用筛选到的突变基因除标签序列以外的序列作探针，再从野生型的基因组DNA文库中筛选出目的基因。44. 用于克隆真核基因的大肠杆菌表达体系的优点和条件 大肠杆菌表达体系的优点： （1） 背景知识清楚，分子生物学、遗传学的基础研究，特别是表达调控知识丰富； （2） 具有完善安全的基因工程体系。包括安全的寄主菌株和载体系统； （3） 早期转基因表达调控研究扎实，许多基因如胰岛素基因、生长素基因等，都能在大肠杆菌中高效的有效表达； （4） 易工业化批量生产，培养方便、操作简单、成本低廉，特别对药用蛋白 发酵生产。实现真核基因在大肠杆菌中有效表达的条件： （1）

29、真核基因的编码序列必须是连续的cDNA，因为原核细胞中不具备剪辑加工的酶； （2）原核的启动子，最好是诱导型的强启动子； （3）以融合蛋白质的形式表达，稳定性好。45.酵母 双杂交体系的原理及其用途是什么？ 酵母双杂交体系简称Y2H。这是在上一世纪90年代初，在转录因子结构的基础上发展出来的一种敏感的体内鉴定基因的方法。可用来有效地分离与己知靶蛋白相互作的另一种蛋白质编码基因，也是分离与某种特定启动子调控元件结合的特异性转录因子的有效手段。如同许多真核生物的转录因子一样，酵母-半乳糖苷酶的转录因子GAL4也含有两个结构上可分开的、功能上相互独立的结构域，即DNA结合域(DNA_BD)和转录激活

30、域(AD)。应用DNA重组技术，可以把GAL4转录因子的这两个结构域分开。如果把它们放置在同一个酵母细胞中，所产生的GAL4 DNA-BD和AD多肽，彼此之间不会直接发生相互作用，所以不具有转录因子的功能活性，无法激活相关基因转录，。但是应用DNA重组技术，将两个分开的GAL4的 DNA-BD和AD，甚至分别来自两个不同的转录因子的DNA-BD和AD重组成一个转录因子(使之在空间上彼此靠近)则又可重新获得转录因子的功能活性，即可激活相关基因的转录。酵母双杂交体系就是根据这种原理建立的。酵母双杂交体系包括两种大肠杆菌-酵母菌的穿梭载体；和一种特殊的己经缺失了内源GAL4转录因子的酵母寄主菌株。第

31、一种穿梭载体叫DNA-BD质粒载体： 它具有色氨酸合成酶基因、把己知的靶基因按正确的读码结构和取向插入在该载体的多克隆位点上，便可与GAL4 DNA-BD多肽形成第一种杂种蛋白(X)。第二种穿梭载体叫AD质粒载体： 它具有亮氨酸合成酶基因（leu）、是用于构建cDNA表达文库的专用载体。克隆的cDNA片段按正确的读码结构和取向插入在该载体的多克隆位上（构成cDNA文库），cDNA编码的蛋白质便与GAL4的AD多肽融合成第二种杂种蛋白（Y）。酵母寄主菌株： 将上述两种杂种质粒共转化到酵母双杂交体系专用的寄主菌株特点：（1）这种菌株己经丧失了内源GAL4转录因子的能力；（2）具有LacZ和his3

32、的报告基因；（3）具有trp和leu的转化标记，即在缺少Trp和Leu的缺陷性培养基上无法生长的。将共转化的酵母细胞涂布在缺少亮氨酸(Leu）和色氨酸（Trp）的SD培养基上，如果由笫一种质粒表达的靶蛋白同第二种质粒表达的cDNA文库编码的一种蛋白质发生了相互作用，这样DNA-BD与AD就会在空间上彼此靠近，而且它具有色氨酸和亮氨酸的编码基因，因此在缺陷性的选择培养上能生长，于是便构成了有功能活性的GAL4转录因子，从而启动下游报告基因LacZ的表达，在含X-gal和诱导物IPTG的条件下，-半乳糖苷酶把X-gal切割，选择出蓝色阳性克隆。这有可能分离到含有与靶蛋白相互作用的另一种蛋白编码基因。酵母双杂交体系可以用于产物未知基因的分离、也可用于新基因功能的鉴定。46.表达载体的组成： （1） 原核启动子，最好是诱导型的强启动子，使外源基因蛋白表达量占总蛋白的10-30