心肌缺血再灌注时Gsα和Giα蛋白含量mRNA水平变化及意义.docx

1、心肌缺血再灌注时Gs和Gi蛋白含量mRNA水平变化及意义心肌缺血再灌注时Gs和Gi蛋白含量mRNA水平变化及意义【摘要】 目的：研究新生豚鼠心肌缺血再灌注时Gs和Gi蛋白含量及其mRNA水平的变化以及与心功能变化的关系. 方法： 30只新生豚鼠随机分为3组，建立离体心脏左心做功模型. 组： 离体心脏缺血90 min；组：缺血时予Thomas 号液；组：缺血时予冷血心停搏液. 各组均再灌注60 min. 检测心功能指标，Gs和Gi蛋白含量及其mRNA水平的变化. 结果： 组和组在再灌注时的心功能明显受损，组在再灌注结束时无明显变化. 组和组在缺血后和再灌注后Gs蛋白含量分别为缺血前的%, %,

2、%和%，Gs mRNA水平分别为缺血前的%, %, %和%，明显降低()；Gi蛋白含量分别为缺血前的%, %, %, %，Gi2 mRNA水平分别为缺血前的%, %, %和%，显着升高(). 组在再灌注后Gs和Gi蛋白含量及其mRNA恢复至缺血前的水平. 结论： Gs和Gi蛋白的平衡遭受破坏可能是未成熟心肌缺血再灌注损伤发生的机制之一.【关键词】 心肌缺血；心肌再灌注损伤；GTP结合蛋白质类；心麻痹液；豚鼠0引言鸟嘌呤核苷酸偶联蛋白(G蛋白)在细胞信号转导过程中起着“电话交换机(switchboard)样”作用1，与心脏病理生理过程密切相关2. 对心肌缺血再灌注过程中G蛋白变化的研究有益于增强

3、对心肌缺血再灌注损伤的认识，是一值得探讨的课题. 有关未成熟心肌缺血再灌注时兴奋性鸟核苷藕联蛋白亚基(Gs)和抑制性蛋白亚基(Gi)蛋白含量的变化及其mRNA水平的变化鲜见研究报道3，我们拟以新生豚鼠为研究对象，利用离体工作心脏模型，运用Western印迹分析和Northern印迹分析等方法对此进行研究.1材料和方法材料 实验分组和模型：02 d龄新生豚鼠，雌雄不拘，体质量5080 g. 实验随机分为3组. 建立离体心脏顺灌左心做功模型4： 取豚鼠心脏,将主动脉断端套于主动脉插管上，行Langendorff逆灌，灌注液为KH液，心脏复跳. 行左房插管,停止逆灌，经左房顺行灌注. 停止顺灌，组于

4、20全心缺血90 min，组(Thomas组)和组在缺血开始、第30 min和第60 min时经主动脉分别逆灌10 Thomas 号液和冷血心停搏液. 之后，三组均给予37氧合KH液逆灌，使心脏复跳，尔后再灌60 min. 抗体和cDNA探针 RM/1Gs蛋白多克隆抗体和AS/7 Gi蛋白多克隆抗体；大鼠Gs和Gi2 cDNA探针，长度分别为1737 bp和1748 bp.方法心功能指标测定在缺血前和再灌注15， 30， 45和60 min时，将左心室测压管连接于MPAIV型多导生物信号分析系统，测定各组左室收缩峰压、左室舒张末压、左室内压正负相最大变化速率、心输出量.印迹分析将冷冻心肌组织置

5、于4预冷的含1 mol/L MgCl2， 25 mol/L三氨甲烷/盐酸， mol/L甲苯磺酰氟和1 mol/L二硫苏糖醇的心肌匀浆液中，匀浆制备膜蛋白，-70贮存备用. 120 g/L十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，每一样品上样75 g，以电转移的方式转移至硝酸纤维素膜上. 将膜封闭后，与抗Gs和抗Gi反应1 h，洗去抗体后将膜置于1500的碱性磷酸酶标记的IgG中反应1 h，Tris缓冲盐溶液充分洗涤，以NBT+BCIP显色，最后摄片记录.印迹分析以Trizol液提取心肌总RNA，用紫外分光光度法测定并计算其浓度和纯度，将RNA样品上样至10 g/L变性琼脂糖胶上电泳，毛吸法转移至硝酸纤

6、维素膜上，80真空烘干. 硝酸纤维素膜50杂交过夜后，在预杂交液中加入50 mg/L鲑鱼精DNA和32P标记的cDNA探针，50杂交过夜. -70放射自显影，最后对X胶片进行扫描分析. actin cDNA作为内参照.和蛋白质含量的确定Western 印迹分析的结果用测得的目标带的吸光度面积表示，尔后按占缺血前的百分比进行统计. Northern 印迹分析则将所测值用内参照actin校正后再按占缺血前的百分比进行统计分析.统计学处理： 各组以缺血前值为100%，并计算缺血后和再灌注后实测值分别与缺血前值的百分率. 数值以xs表示，用重复测量方差分析进行统计处理，为有统计学意义.2结果心脏功能的

7、变化再灌注时，组和组的LVPSP, +dp/dtmax, -dp/dtmax和CO在各时相点均显着降低，而 LVEDP显着升高；组在再灌注60 min时各心功能指标均恢复至与缺血前相当的水平；组和组的LVPSP, +dp/dtmax, -dp/dtmax和CO在各时相点均显着低于，而 LVEDP显着高于组心肌Gs蛋白和Gi蛋白含量的变化三组缺血前的Gs和Gi蛋白水平无明显差异. 缺血后，组和组Gs蛋白水平显着低于缺血前()，Gi蛋白水平显着高于缺血前和组，两组之间尚无明显差异；再灌注后，组的Gs和Gi蛋白水平与缺血前无明显差异，且分别明显高于和低于组和组. Gs蛋白呈现出Mr 45103和52

8、103两条蛋白带，Gi蛋白呈现出一Mr 41103蛋白带(Fig 1). 表2新生豚鼠心肌Gs蛋白和Gi蛋白的变化心肌Gs mRNA和Gi2 mRNA水平的变化三组缺血前的Gs mRNA和Gi2 mRNA水平无明显差异(). 缺血后，组和组的Gs mRNA和Gi2 mRNA水平明显低于和高于缺血前和组. 再灌注后，组Gs mRNA和Gi2 mRNA水平与缺血前无明显差异()，且分别明显高于和低于组和组3讨论心肌缺血再灌注损伤及其保护一直受到重视5，6. G蛋白作为细胞信号转导过程中的“电话交换机”4，在许多心肌病理过程中发挥作用5. 未成熟心肌缺血再灌注时G蛋白的变化鲜见研究报道6. 本组研究

9、结果显示，组心肌缺血后的Gs蛋白水平明显降低，再灌注后Gs蛋白量虽有所恢复，仍明显低于缺血前. GsmRNA的表达与Gs蛋白含量的变化平行. 缺血后Gi2 mRNA水平升高，再灌注后虽有所下降，仍明显高于缺血前，并由此引起Gi蛋白量在缺血后和再灌注后的升高. 由此推测，Gs和Gi的平衡遭受破坏是未成熟心肌缺血再灌注损伤发生的机制之一.Thomas 号液对未成熟心肌缺血再灌注损伤的作用尚有争议7，冷血心停搏液对成熟和未成熟心肌均具良好保护作用8. 本结果提示，组缺血再灌注后的Gs mRNA水平和Gs蛋白含量明显降低，而Gi2 mRNA水平和Gi蛋白含量显着增加. 组缺血后Gs mRNA和Gs以及

10、Gi2 mRNA和Gi蛋白水平虽有变化，但在再灌注后恢复至与缺血前相当的水平. 可见，Thomas 液对未成熟心肌缺血再灌注无有效保护可能是由于该液失于对未成熟豚鼠心肌细胞G蛋白的保护，冷血心停搏液对未成熟豚鼠心肌的保护作用与其对G蛋白的保护有着密切的关系. 这从另一个角度说明了Thomas 液和冷血心停搏液的不同心肌保护作用的可能机制.【参考文献】 1Neer EJ. Heterotrimeric G protein: Organizers of transmembrane signals J. Cell, 1995；80(2): 249-257.2 Booz GW, Day JN, Bak

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13、hin J Pathophysiol, 1999；15(2): 191-192.5马兰香,贾国良,张清,等. 高、低剂量极化液对缺血/再灌注心肌保护作用的对比研究J. 第四军医大学学报,2003;24(22): 2087-2090.Ma LX, Jia GL, Zhang Q, et al. Comparative study on myocardial protection by high dose GIK and low dose GIK during myocardial ischemia and reperfusion J. J Fourth Mil Med Univ, 2003;24

14、(22): 2087-2090.6赵建洪,程彦斌,张正义,等. 吗啡对大鼠急性心肌缺血/再灌注损伤的保护作用及其对心肌细胞凋亡的影响J. 第四军医大学学报,2004;25(16): 1460-1463.Zhao JH, Chen YB, Zhang ZY, et al. Protective effects of morphine on acute myocardial ischemiareperfusion injury in rat and its influence on apoptosis of cardiomyocytes J. J Fourth Mil Med Univ, 2004

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