新生霉素.docx

1、新生霉素新生霉素(novobiocin)是香豆素类抗生素的代表药物，对DNA回旋酶有很好的抑制作用，对多种癌细胞有抑制作用，并能与抗癌药联合应用，逆转抗癌药的耐药性。主要用于耐药性金葡菌引起的感染，如肺炎、败血症等，对严重感染疗效较差。易引起细菌耐药性，故宜和其他抗菌药物配伍应用。又称回旋酶，促旋酶，旋转酶。属于解链酶(unwinding enzymes)类中的一种，属拓扑异构酶II(type II topoisomerase；topo II)，该酶首先在大肠杆菌中发现。分别由两个亚基和两个亚基组成，分子量4105(其中，亚基分子量约1.05105，亚基分子量约9.5104)。它的作用是在水解

2、ATP的同时能使松弛态环状DNA转变为负超螺旋DNA。这一作用很复杂，涉及三个步骤：(1)首先DNA回旋酶与DNA结合，使环状DNA扭曲而形成一个“右手结”结构，在这一过程中形成一个稳定的正超螺旋，同时又引入一个负超螺旋；(2)然后该酶在右手结的背后打断双链DNA，并将其搭在另一条双链的前面，这样就将右手性正超螺旋变为左手性负超螺旋；(3)最后将断点连接起来。DNA负超螺旋的引入能使打断碱基对所需的能量降低约4.1kJ mol-1，有利于将DNA双链分开。在复制过程中，当DNA新链在模板上形成后，DNA回旋酶将复制好的DNA双链变为天然的负超螺旋的构型，此过程需ATP水解供能。若缺乏ATP，则

3、该酶催化负超螺旋松弛。1、DNA拓扑异构酶的生物学特性 DNA拓扑异构酶（Topo）普遍存在于各类生物种群中，包括病毒、原生动物、真菌、植物、昆虫、两栖类、鸟类及哺乳动物的正常和肿瘤细胞中，是调节核酸空间结构动态变化，控制核酸生理功能的关键酸，其生理学特性与肿瘤相关性的研究引起人们的广泛关注拓扑性是指具有在形状或图像逐一连续变化时保持不变的特性。DNA具有该性质。在闭环DNA中，无论DNA在双螺旋结构的基础上如何盘绕扭曲而构成复杂的空间结构，其咸基对组成、数目、顺序均不改变。DNA的拓扑导构体分打结（knotting）与解结，连环（catenating）与解连环、超螺旋与松弛等几种类型。70年

4、代初，Wang首先从细菌中发现并分离出抗扑异构酶（Topo），证实它能够催化DNA拓扑异构体之间的相互变换，是分子量约为100kD的单般入蛋白。拓扑异构酸（Topo）也称回旋酶（gyrase），它含有2个A亚基，2个B亚基，分别称为gyrA和gyrB。Topo首先发现于 1980年，之后Miler等很快从Hela细胞核中得到均一的酶。 DNA Topo是分子量为131180kD的多肽二聚体，在一定条件下可进一步降解成具有酶活性的小分子多肽，它们在结构上有相关性，并且这些分子量较小的多肽具有同样的酶活性。 DNA Topo的生物学作用可以两种方式体现，一是调节控制DNA的超螺旋状态及打结或解结D

5、NA的环连体状态，从而间接地影响细胞内核酸代谢过程。二是直接参与那些需打断并重新连接DNA分子链的细胞过程，DNA的重组、惨复、转录及复制过程。此外，Topo还参与转导、姊妹染色体互换等生物过程。 Topo和Topo是根据DNA Topo对单链DNA还是双链 DNA作用而划分的、前者介导一条链的断裂，而后者介导两条链的断裂，二者各包含若干亚型。 人的Topo是一个由单拷贝基因（位于第20号染色体）编码的单亚基蛋白。分子量为100kD。Topo催化DNA单链的断链-再连接反应，不需要高能辅助因子，因而不能催化需能的超螺旋结构。Topo从共价闭环DNA移除负超螺旋，是大肠杆菌的必须酶。在链片断反应

6、中Topo转化DNA分子上共价磷酸化酪氨酸磷酸二酯键的能量，产生一个转化的酪氨酸残基和一个磷酸化酪氨酸中间体也被发现，对Topo和两种类拓扑异构酶在旋转酶GyrA亚基和Topo的ParC亚基上酪氨酸是必须的。这种破坏和连接DNA链的机制也在许多位点特异的重组酶中发现，后者用酪氨酸或丝氨酸作为高能磷酸蛋白连接到DNA。整个Topo的催化过程不需要ATP供能，生理浓度的ATP甚至可以抑制Topo的活性，而另一方面 ToPo可被多价阳离子如组蛋白、多聚精氨酸、多聚胺等活化。 人的Topo由170kD（Topo）和180kD（Topo）两种形式组成。是不同转运过程的产物：Topo由人的17号染色体编码

7、，Topo则于3号染色体编码，二者均可以与DNA形成稳定的共价复合物。Topo首先以非共价键方式与DNA 底物相结合，在DNA碳骨架上产生短暂的双链断裂，这一反应必须有二价阳离子如Mg2+，Mn2+的参与，接着酶在ATP的作用下，通这断裂缺口处在双螺旋上过渡。在比过程中，Topo 经历巨大的构型转换，然后将DNA重新连接起来，在Topo 将键合的ATP水解之后，酶又恢复原来的催化活性。DNA 的断裂-重连接循环是真核细胞Topo的核心功能，在断裂- 再连接的平衡反应中，Topo介导的DNA断裂产物可通过迅速加入蛋白变性剂如SDS而被分离出来。 Topo和Topo对细胞DNA复制的贡献不尽相同。

8、例如，某些Topo基因缺陷的大肠杆菌突变株，只表现了比正常菌稍慢的生长速度，提示Topo并非细菌繁殖所必需的酶，而 Topo则无论对于原核或真核细胞的NDA复制，都是不可缺少的。DNA Topo在细胞周期中无明显含量的变化，但在某些肿瘤细胞中，Topo含量高于正常组织。S期细胞中Topo 活性增高。DNA Topo同工酶有同源二聚体，磷酸化位点， ATP结合位点，DNA结合区都很相似。同工酶在细胞周期含量无变化，同工酶在S期增高。DNA Topo作用DNA效能大于Topo。 DNA Topo除与DNA链断裂有关外，还具有许多其他的生物学效应。真核细胞DNA Topo调节染色质的拓扑结构并控制多

9、种基因的表达影响DNA复制及转录，真核细胞DNA Topo 能在体外引起SV40染色体成环，在细胞内还能引起染色质超螺旋，这对研究染色质结构和功能是非常重要的。在真核细胞中，DNA超螺旋对转录的影响已得到证实。还有证据表明超螺旋反应可能与包围DNA的酶密切相关。 2、DNA拓扑导构酶与肿瘤化疗 筛选有效的抗癌药一直是肿瘤治疗的重要工作。研究有选择性靶点为药物筛选提供更有效的条件。以DNA为靶点的烷化剂，对细胞周期没有选择性，毒性大。抗代谢药物，针对核酸含成，常常对DNA合成、RNA转录都有影响。核酸含成因素较多，药物选择性也很广泛。而以Topo为靶点，选择性抑制增殖期DNA复制细胞，集中杀伤肿

10、瘤细胞，有很好的选择性。 Topo抑制剂，通过抑制酶的活性，干扰DNA的遗传代谢，从而发挥抑制肿瘤细胞生长的药理作用，主要通过两种机制：一是促进Topo介导的DNA断裂反应；Topo抑制剂的抗癌作用并不在于抑制酶本身的活性，而在于促使酶-DNA断裂复合物的形成，使平行反应趋向于酶-DNA断裂复合物，延长其半衰期并使其稳定，从而导致DNA链的断裂。而细胞死亡的最终原因可能是由于DNA断裂的错误修复或是由于可断裂复合物的形成及稳定存在激活了细胞内一系列导致细胞死亡的过程。有研究表明，可断裂复合物的形成促进了DNA的异常重组，这种异常重组进一步激活了细胞中致死性蛋白酶的表达。以Topo为靶的抗癌，通

11、过作用于易解离复合物而发挥作用，这一奇特的对DNA损伤作用说明药物作用于DNA的代谢过程，导致细胞死亡。二是对基因转录的影响；TopoD是真核细胞基因转录的重要组成部分，拓扑构型对于选择性基因转录的控制至关重要。癌基因是近年来发现的细胞内特殊的 DNA序列，该基因的表达与细胞癌变及恶性细胞的维持密切相关。一些以DNA Topo为靶点的药物可以干扰癌基因的表达从而抑制癌细胞的增殖。 Topo抑制剂与Topo抑制剂的作用机制有所不同。 DNA-Topo对单链的连接作用，具有保护、修复DNA的完整性。DNA-ToPo切断DNA中的一条链，造成缺口，为DNA分子旋转，伸屈作为支点。在双链DNA有一条链

12、已存在缺口时，Topo有催化双链DNA断裂的功能。在DNA复制中， DNA螺旋松解复制，DNA链呈Y字型，形成复制叉。复制叉中新复制键在叉部有一缺口，在药物、Topo的共同作用下，会产生又部双链DNA断裂，细胞凋亡。这种双链DNA断裂与复制叉多少有关。Topo在细胞周期中没有明显的含量变化，但是，在某些肿瘤细胞中，Topo含量高于正常组织。S 期细胞Topo活性增高，S或细胞对Topo抑制剂的敏感性比G1和G2期细胞高1000倍。在结肠癌、膀胱癌Topo含量增高时，应用喜树碱类药物，显示出抑制肿瘤生长的效果。 DNA Topo的作用在于介导DNA双键解螺旋（断裂和再连接），在通常情况下，DNA

13、 Topo与DNA形成一种易断复合物，药物能够捕获这种复合物使其稳定，从而干扰DNA Topo 介导的DNA再连接反应导致DNA单链或双链断裂，影响 DNA复制，发挥细胞杀伤作用。同工酶在细胞周期没有含量变化，同工酶在S期增高。DNA Topo作用DNA效能大于Topo，应用Topo抑制剂，会集中杀伤S期细胞。S期为 DNA合成期，这也使药物集中杀伤增殖细胞，达到治疗肿瘤的目的。 Topo抑制剂抗肿瘤药物主要是喜树碱及其衍生物。喜树碱是1966年由Wall从珙桐科植物喜树中分由得到的生物碱。它具有较强的细胞毒性。对胃癌、肝癌、膀胱癌和白血病等恶性肿瘤有较好的疗效，但其副作用显著，如引起骨髓抑制

14、、呕吐和腹泻等，加之水溶性差，后逐渐被其行生物所替代。如Irinotecon（CPT-11），有非常好的水溶性，抗癌谱较广，对结肠癌、胸腺癌、小细胞肺癌和白血病疗效显著。NSC-603071（9- 氨基喜树碱），主要作用细胞靶是Topo，水溶性较好，在北美对该药进行了期临床实验，发现其毒性呈剂量依赖性，在2 3h的半衰期过后，毒性很快消失。Topotecan在喜树碱B环上连有N，N-二甲氨基甲基例链，对胸、肺、卵巢癌有显著疗效。近年来，亦用于恶性神经胶质瘤的治疗。副作用为血毒症，中性白细胞减少，呕吐和腹泻等。 Topo为靶的抗癌药较多，根据作用方式不同分为嵌入型和非嵌入型。嵌入型抑制剂是以分子

15、结构中的平面部分，如类似嘌呤或嘧啶碱基的多环结构嵌入到Topo与DNA结合部位的双链之间、从而干扰了酶将DNA断端重新连接的反应，并使DNA损伤，导致细胞死亡。代表药物是蒽环类，如阿霉素、柔红霉素等。非嵌入型抑制剂的作用模式尚不清楚，可能是直接作用于Topo或仅作用于DNA的一条链以影响酶的功能。代表药物是鬼臼素类。其衍生物etoposide和tenipo- side对治疗支气管小细胞癌最有效，etoposide最近用于治疗神经系统恶性肿瘤取得较好的疗效。对于Kapopsi肉瘤和 AIDS有关肿瘤也有效。副作用有白细胞减少，降血压，发热等。 3、DNA拓扑异构酶与肿瘤耐药 肿瘤耐药是化疗主要障

16、碍之一。目前已经了解肿对耐药主要包括以下几个方面：多药耐药基因（MDR）扩增及P-糖蛋白表达。DNA Topo的变化。GSH/GST解毒酶系统作用增强。抗代谢产物等等。 肿瘤细胞的多药耐药性（multidrug resistance，MDR）是指对所接触的一种化疗药物耐药的同时对另外一些与之化学结构、作用机制完全不同的化疗药物的交叉耐药。与MDR相关的基因称DNR基因。一种MDR细胞系可以存在一种或几种耐药机制，不同的MDR细胞系耐药机制可以不同。Nooter等根据耐药机制的不同，将MDR细胞分成三种的表现形式： 典型MDR：指细胞膜上由于P-糖蛋白的过度表达，细胞对药物的积聚能力减弱，外排增

17、加。非典型MDR：该型与细胞内的DNA Topo质或量的改变有关。它与细胞对药物的积聚能力无关。非P-gpMDR：该型与典型MDR非常类似，细胞对药物的积聚能力也减退，外排增加，但无P-gp的过度表达，而MRP的过度表达可能是它的耐药机制之一。 DNA Topo抑制剂耐药机制主要归纳有以下三个方面： 耐药细胞相关基因的改变。DNA Topo活性或含量的改变。 DNA Topo调控因素的变化。 Topo介导的MDR的主要特征有：对许多天然药物呈现抗药性。膜-活性药物不能提高抗肿瘤药物的细胞毒作用。药物在细胞内积聚与保留没有变化。mdr1与P-gp 表达未见增加。Topo含量及活性均有所下降。 抗

18、癌药物可以促使Topo介导的DNA断裂，形成可切割复合物，促进DNA异常重组，进一步激活致死性蛋白酶的表达，如复合物减少则可导致耐药的发生。Cole通过对起源于人小细胞肺癌（SCLC）细胞株-H69的耐ADM株的研究发现，其MDR1基因表达水平较敏感株低，细胞株中药物聚集及外排，DNA修复均无明显差异，但Topo的水平则明显低于敏感株，推测：Topo数量的减少而导致耐药。Giacconc研究了 8株人肺癌细胞株中Topo基因的表达与其对VP-16（鬼臼乙叉甙）、ADM的药敏性的关系，发现7株细胞林中Topo基因的表达明显减少，与其相对耐药明显相关，未发现该基因扩增，表明该基因编码的蛋白的调节是

19、一种翻译局调节。耐 ADM的SCLC细胞株GLC4-ADR150中，Topo活性的减低亦导致耐药。Mirski通过对耐VP-16的人SCLC细胞株H209/ VP-16的研究表明，该株中Topo6.1kb mRNA较敏感株减少10倍以上，4.8kb mRNA仅在耐药株中存在，说明Topo质量的改变可导致耐药的发生。Eijdems发现，起源于人的非小细胞肺癌（NSCLC）细胞株的耐ADM的细胞株SW-1573/ADM 中Topo。表达不稳定，对化疗较Topo敏感。Binasch 发现，耐药的SCLC细胞株NCL-H69中，TopoP170基因的一个等位基因的3端有DNA重排，部分有扩增，除了有正

20、常的 6.2kb的TopomRNA表达外，可以检测到一7.4An的Topo mRNA表达，该RNA缺少Topo170基因的编码片段的3-末端的一部分，约1000个核苷醉，编码结构改变了的Topo而导致耐药。由此可见，DNA Topo的活性减低、数量减少，质量改变及生物学特性的改变是肿瘤产生耐药性的重要原因。 由Topo介导的耐药细胞无mdr基因的扩增和过量表达称不典型多药耐药（at-MDR）。引起at-MDR的抗癌药物主要是Topo抑制剂。铂类抗癌药及烷化剂不引起这类耐药。 at-MDR细胞和许多Topll抑制剂交叉耐药，但对长春新碱类敏感。 at-MDR细胞内抗癌药物聚集量及外排（efflu

21、x）并无改变，mdr基因也无扩增和过量表达，但细胞内Topo活性均有下降。引起Topo活性下降的环节不同。事实上，某一耐药细胞常有几种机制同时参与耐药形成。如耐VP-16287倍的 KB细胞系，其药物聚集量下降50，Topo活性下降50%，酶量下降约28。有的细胞系除Topo表达下降外，同时还有 mdr和谷胱甘肽转移酶基因的过度表达。 大量事实表明，细胞内Topo含量越高，则对Topo抑制剂的敏感性越高，对DNA损伤越严重。许多at-MDR细胞系包括SCLC细胞系，其Topo活性和表达量下降24倍，就可明显引起药物诱导致Topo介导的DNA断裂下降。对许多不同组织学和形态学特征的肺癌细胞系（5

22、SCLC，3 NSCLC）的研究也发现Topo表达量下降与药物敏感性下降有关。SCLC的Topo量和活性比NSCLC明显增高，致使前者对VP-16和ADM的敏感性是后者的20倍，该结果与临床上SCLC对化疗四感而NSCLC原发耐药相一致。观察临床耐药肿瘤Topo表达与耐药的关系示临床肿瘤较体外耐药模型对Topo抑制剂的耐受程度明显增加，且撤药后持续时间也较长。但细胞内Topo含量与化疗敏感性仍有相关性，如慢性淋巴细胞白血病。研究实体瘤如膀胱癌和睾丸肿瘤细胞得出类似结果。 Topo介导的at-MDR细胞发生Topo量和质的改变，酶水平的降低导致DNA断裂减少和细胞毒性降低；结构的改变可影响药物诱

23、导的断裂复合物的稳定性。不同的耐药细胞可以从不同的环节改变Topo的调控。 通过Topo产生抗药性的机制包括抗肿瘤药物引起此酶的定量减少及定性改变，多数对Topo抑制剂（喜树碱和其衍生物）和Topo抑制剂（表贵臼脂素、玫瑰树碱、蒽环类、口丫啶）抗药的癌细胞中，此酶相应基因的突变位于酶活性部位的 5端，此区域在真核及原核生物的Topo中都同样完好的保留着。已证实当Topo中的活性减低时，Topo的活性补偿性增高或反之，因此有效的治疗方案可能将是一些拓扑酶的抑制剂增效另一些Topo抑制剂。 总之，DNA Topo是能够改变DNA空间结构状态。而又不引起其化学结构发生改变的复杂酶系。包括Topo和Topo 两种状态的Topo可以完成细胞内的多种反应，并参与核酸代谢及在保持染色体和细胞核结构完整方面起着重要作用。 DNA Topo与肿瘤细胞的分化，增殖关系密切，DNA Topo抑制剂能选择性杀伤增殖的肿瘤细胞，对DNA Topo和其抑制剂的研究对新药开发都有一定的指导意义。DNA Topo作为许多抗肿瘤药物的靶点，在肿瘤多药耐药中起重要作用，耐药细胞通过不同环节调节其酶表达量及活性，维持其耐药表型。深刻认识其在肿瘤耐药中的意义，有助于解释复杂的耐药现象，同时也有助于开发和利用以Topo为靶点的药物，制定逆转at- MDR（非典型多药耐药）的对策。