999感冒灵主要药效学及其作用机制研究.docx

1、999感冒灵主要药效学及其作用机制研究999感冒灵主要药效学及其作用机制研究观察999感冒灵全方中中药组分与化学药组分配伍后在药效学作用上的协同作用，并研究其作用机制。分别在冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增加、二甲苯致小鼠耳肿胀和角叉菜胶致大鼠胸膜炎非特异性炎症模型和酵母菌致大鼠发热模型和肺炎克雷白杆菌细菌生物被膜（Klebsiellar pneumonia，KPN）模型上，比较感冒灵全方、化学药组分和中药组分的抗炎、解热作用的异同。结果显示，与模型组比较，感冒灵全方组小鼠伊文思蓝渗出量明显减少，小鼠的耳肿胀度明显减小，化学药组分和中药组分组均未见显著性差异；感冒灵全方组、化学药组分组、中药组

2、分组大鼠胸腔渗出液TNF和IL1浓度明显降低，感冒灵全方组大鼠血清TNF，IL1和IL8，化学药组分组大鼠血清TNF，IL8和中药组分大鼠血清IL8浓度明显降低；感冒灵全方组和化学药组分组大鼠分别于药后48 h体温升高值明显减小，中药组分组大鼠的体温升高值无明显差异。感冒灵全方在551375 gL-1、中药组分在45225 gL-1、西药组分在10 gL-1时可显著降低细菌生物被膜的活菌量。扫描电镜显示，感冒灵全方（55 gL-1）和西药组分（10 gL-1）可破坏KPN生物被膜，中药组分（45 gL-1）可在一定程度上破坏KPN生物被膜。结果表明，感冒灵全方具有明显的抗炎和解热作用，对成熟K

3、PN生物被膜具有破坏作用。感冒灵化学药组分和中药组分在抗炎和抑制成熟KPN生物被膜内活菌量方面显示明显的协同作用，但在解热方面未观察到明显的协同作用。标签：999感冒灵；炎症；炎性因子；肺克雷白杆菌（KPN）；细菌生物被膜AbstractTo observe synergistic effects of 999 Ganmaoling （GML） and its Chinese/Western materia medica （CMM and WMM） on pharmacodynamic action and to study underlying mechanisms， their antii

4、nflammatory， antipyretic effects were compared by assaying the increased capillary permeability induced by glacial acetic acid in mice， ear swelling induced by Xylene in mice， nonspecific pleurisy induced by carrageenan in rats， and yeast induced fever in rats Crystal violet （CV） and microbial activ

5、ity （XTT） assay were used to evaluate the inhibition of GML and its CMM and WMM on KPN biofilm formation， and scanning electron microscopy （SEM） was applied for observing KPN biofilm morphology changes The results showed that compared with control group， GML could reduce exudation amount of EvansBlu

6、e and the degree of Ear swelling significantly， and CMM and WMM have no significant effects The concentration of TNF and IL1 of rat pleural effusion in GML， CMM and WMM group decreased significantly The concentration of TNF， IL1 and IL8 in GML group， TNF， IL8 in WMM group and IL8 in CMM in rats seru

7、m decreased significantly The body temperature in rats decreased significantly in GML and WMM group after 48 h of administration CMM group showed no significant difference in rat body temperature compare with control Compared with control group， GML （551375 gL-1） could inhibit KPN biofilm formation

8、and reduce number of viable cells in the KPN biofilm CMM （45225 gL-1） and WMM （10 gL-1） could also inhibit KPN biofilm formation and reduce number of viable cells （P001） Result of SEM also showed that GML （55 gL-1） and its CMM （45 gL-1） and WMM （10 gL-1） could interfere the bacterial arrangement of

9、KPN biofilm and extracellular matrix GML and its CMM &WMM could inhibit the formation of KPN biofilm， CMM &WMM in GML showed synergism and complementation in inhibit KPN biofilm Results showed that GML had obvious antiinflammatory and antipyretic effects and could destruct KPN mature biofilm WMM and

10、 CMM showed obvious synergistic effect against inflammation and inhibition of KPN biofilm formation and reduction of number of viable cells but no same effects against feverkey words999 Ganmaoling； inflamation； inflammatory cytokines； Klebsiella bacillus（KPN）； bacterial biofilmdoi：10.4268/cjcmm20160

11、805999感冒灵颗粒是由中药和化学药配伍组成的中西药复方制剂，其中中药部分有三叉苦、岗梅、金盏银盘、薄荷油、野菊花等4味中药；化学药部分则有马来酸氯苯那敏、咖啡因、对乙酰氨基酚等3种化学药。它临床用于治疗感冒引起的头痛、发热、鼻塞、流涕、咽痛等上呼吸道感染症状。组方中中药多为岭南地区习用清热解毒类中药，组方中化学药组分也是治疗上呼吸道感染的常用的化学药主要成分，该方取中、西药的优势配伍用药，并大幅降低了对乙酰氨基酚等化学药的用量。本文观察其中、西药组分配伍用药的合理性，在抗炎、解热和对成熟KPN生物被膜内活菌量及形态方面是否具有协同作用。1材料999感冒灵全方（批号20130409002），

12、999感冒灵颗粒中药干膏粉（批号2013040901），对乙酰氨基酚（批号1040867），咖啡因（批号TC2011022），马来酸氯苯那敏（批号110434）（华润三九医药股份有限公司）；阿司匹林（北京曙光药业有限责任公司生产，批号090508）；泰诺（酚麻美敏片）（上海强生制药有限公司生产，批号121030823）。肺炎克雷伯杆菌（Klebsiella pneumonia，KPN）临床株从湖北中医药大学第一附属医院呼吸道患者痰液中分离、纯化，并经Vitck 32全自动微生物鉴定/药敏分析仪鉴定，实验编号HB6。角叉菜胶（Sigma，批号021M0038V）；冰醋酸（天津市华东试剂厂，批号2

13、0091228）；伊文思蓝（国药集团化学试剂有限公司，批号71016588）；IL1放免试剂盒（批号0423），IL6放免试剂盒（批号0520），IL8放免试剂盒（批号201405）（北京北方生物技术研究所）；胰蛋白胨，酵母提取物（英国OXOID公司）；硫酸卡那霉素，二甲基亚砜（DMSO），XTT，PMS，结晶紫（Sigma）；氯化钠，葡萄糖，乙醇（国药集团化学试剂有限公司）。Varioskan Flash多功能酶标仪（美国Thermo公司）；J6B型离心机（美国Beckman公司）；Xh6080放免仪（西安核仪厂）；ELX50自动洗板机（美国伯腾）；HWS150恒温恒湿培养箱（上海森信）；M

14、LS3750高压灭菌锅（日本三洋）；Sky110恒温震荡培养箱（上海苏昆）；V1100分光光度计（上海美谱达）；iMark酶标仪（美国伯乐）；SU1510扫描电子显微镜（日本日立）；Cressington 108离子溅射仪（英国）。小鼠，ICR种，雄性，体重1820 g，或2530 g，SPF级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号SCXK（京）20120001。大鼠，SD种，雄性，体重150170 g，或180200 g，SPF级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号SCXK（京）20120001。饲养条件：中国中医科学院医学实验动物中心动物房，实验设施许可证SYXK（京

15、）20100034。屏障系统，人工光照，12 h明暗周期，温度控制在2026 ，相对湿度控制范围为40%70%，换气次数不少于15次/h。2方法21抗炎作用211对冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增加的影响60只小鼠按体重随机分成6组，即正常对照组、模型组、阳性对照药阿司匹林组、感冒灵全方组、感冒灵化学药组、感冒灵中药组。除正常对照组和模型组外，其他各组按剂量灌胃给予相应的药物，其中感冒灵全方组给予1543 g（生药）kg-1，感冒灵化学药组给予019 gkg-1，感冒灵中药组给予1538 g（生药）kg-1，阿司匹林组给予008 gkg-1。连续给药3 d，1次/d。在给药第3天，药后30 m

16、in于动物腹腔注射1%醋酸，001 mLg-1，30 min后于小鼠尾静脉注射05%伊文思蓝，002 mLg-1，20 min后脱颈椎处死小鼠，将2 mL生理盐水注入腹腔，轻柔腹部30次后，收集腹腔液，再用4 mL生理盐水分2次洗涤腹腔，每次2 mL，分别收集腹腔液，合并3次的腹腔液后定容至8 mL；将腹腔液经3 000 rmin-1离心15 min，取上清液用多功能酶标仪在590 nm处比色，读取吸光度（A）；并以不同浓度的伊文思蓝为标准，绘制标准曲线，计算小鼠腹腔液中伊文思蓝含量，对各组动物伊文思蓝渗出量进行比较。212对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响50只小鼠按体重随机分成5组，即模型组、阿司

17、匹林组、感冒灵全方组、感冒灵化学药组、感冒灵中药组。除模型组外，其他各组按剂量灌胃给予相应的药物，其中感冒灵全方给予1543 g（生药）kg-1，感冒灵化学药组给予019 gkg-1，感冒灵中药组给予1538 g（生药）kg-1，阿司匹林组给予008 gkg-1。连续给药3 d。在给药第3天，末次给药1 h后，将二甲苯涂于小鼠左耳前后两面，004 mL/只，制备耳肿胀模型，以右耳为对照。致炎后4 h，将小鼠断颈处死，沿耳廓基线剪下左右两耳，用9 mm直径打孔器分别在同一部位打下耳片，用组织天平称重。每鼠的左耳片质量减去右耳片质量即为肿胀程度。计算并比较各给药组的肿胀抑制率。213对角叉菜胶致大

18、鼠胸膜炎的影响60只大鼠按体重随机分成6组，即假手术组、模型组、阿司匹林组、感冒灵全方组、感冒灵化学药组、感冒灵中药组。除假手术组、模型组外，其余各组动物按剂量给予相应的药物，其中感冒灵全方组给予1070 g（生药）kg-1，感冒灵化学药组给予013 gkg-1，感冒灵中药组给予1050 g（生药）kg-1，阿司匹林组给予006 gkg-1，假手术组、模型组给予等量的蒸馏水。连续给药4 d，1次/d。于第3天给药30 min后，除假手术组外，其余动物胸腔注射1%角叉菜胶，02 mL/只，制备急性胸膜炎模型。假手术组注入等量生理盐水。第4天给药30 min后，即注射角叉菜胶后18 h，将大鼠麻醉

19、，腹主动脉取血，收集血清。并用剪刀将右侧胸腔肋软骨处剪开一小口，从该口向胸腔注入1 mL Hanks溶液（含肝素20 UmL-1），轻柔按摩胸腔，然后用吸管由小口处吸出液体。将收集的灌洗液3 000 rmin-1离心15 min，取上清液，冻存。采用放射免疫方法检测大鼠血清中的TNF，IL1，IL8，IL6和胸膜腔渗出液中IL1，IL8，TNF含量。22解热作用50只大鼠，实验前1 d和实验当天早上测肛温2次，取2次平均值作为大鼠的基础体温。按基础体温随机分为5组，即模型组、泰诺组、感冒灵全方组、化学药组、中药组。每组10只。除模型组外，各给药组动物按剂量灌胃给予相应的药物，其中感冒灵全方组给

20、予1200 g（生药）kg-1，感冒灵化学药组给予014 gkg-1，感冒灵中药组给予1200 g（生药）kg-1，泰诺组给予106 gkg-1，模型组给予等量的蒸馏水，连续给药3 d。给药第3天，药后各组大鼠立即于背部皮下注射20%酵母菌悬液（10 mLkg-1），造模后4 h再给药1次。于药后4，5，6，7，8，9 h对各组大鼠的体温进行测定，计算体温升高值，比较组间差异。23对KPN成熟生物被膜内活菌量的抑制作用231药液及培养基的配制称取999感冒灵全方11 g，加入LB培养基10 mL，配制成110 gL-1药液，022 m微孔滤膜过滤除菌，置于4 冰箱保存备用。按照999感冒灵中药

21、组分及西药组分在全方中比例，分别称取999感冒灵中药组分09 g、西药组分02 g，加入LB培养基10 mL，配制成90，20 gL-1药液，022 m微孔滤膜过滤除菌，置于4 冰箱保存备用，其中西药组分溶液中含适量DMSO。精密称取硫酸卡那霉素加入适量LB培养基，溶解后配制成160 mgL-1溶液，4 冰箱保存备用。232KPN培养及成熟生物被膜模型建立选取单个KPN菌落接种于LB 培养基，37 恒温振荡培养箱培养24 h。参考文献5方法建立细菌生物被膜模型，用含05%葡萄糖的LB培养基调整KPN菌液浓度为A600=005，接种于96 孔板，37 培养24 h，形成成熟的KPN生物被膜。23

22、3微孔板法检测999感冒灵全方及其组方对成熟KPN生物被膜的影响按22项下方法在96 孔板中培养出成熟生物被膜后，吸出孔内菌液，加入无菌水洗去残留细菌与培养基，分别加入倍比稀释的999感冒灵全方（终浓度55043 gL-1）、999感冒灵中药组分（终浓度45035 gL-1）、999感冒灵西药组分（终浓度10008 gL-1）和硫酸卡那霉素（ 终浓度40031 gL-1），空白对照组（control） 加入等量LB培养基，溶剂对照组则按照999感冒灵西药组各浓度梯度中所含DMSO浓度分别加入等量含DMSO的LB培养基，每组3个复孔，放入37 培养箱继续培养24 h。参考文献1，分别进行CV和X

23、TT染色。其中，CV检测适用于测定全部生物被膜，包括活菌、死菌及胞外基质，染色方法：药物作用24 h后，吸去上清，用09%生理盐水清洗2次，洗去悬浮细菌，每孔加入04% CV溶液200 L，室温下静置10 min；09%生理盐水清洗2次，去除未结合的CV；每孔加入200 L无水乙醇溶液溶解结晶紫，酶标仪在595 nm处读取吸光度（A）；XTT检测适用于测定生物被膜中活菌量，染色方法：药物作用24 h后，吸去上清，每孔加入160 L LB培养液，然后加入40 L XTTPMS溶液（WSTPMS 91），37 孵育2 h，酶标仪在450 nm处读取吸光度（A），校正波长655 nm。234感冒灵全

24、方及其组方对成熟KPN生物被膜影响的形态观察24孔板中放入已经灭菌的盖玻片作为载体，按照22项下方法培养成熟KPN生物被膜，使生物被膜生长于玻璃片上，吸取上清，洗去悬浮细菌，分别加入2 mL 999感冒灵全方组（终浓度55 gL-1）、999感冒灵中药组分（终浓度45 gL-1）、999感冒灵西药组分（终浓度10 gL-1）和硫酸卡那霉素组（终浓度40 mgL-1），空白对照组加入等量LB培养基，溶剂对照组参考等浓度999感冒灵西药组所含DMSO浓度加入，置37 培养24 h。样本用PBS 清洗2次，洗掉悬浮细菌，25%戊二醛固定，梯度乙醇逐级脱水，真空冷冻干燥、喷金，扫描电子显微镜下观察，拍

25、照。24统计方法数据均以s表示，多组间比较采用SPSS 130单因素方差分析比较组间差异。3结果31对冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增加的影响与正常对照组比较，模型组小鼠腹腔伊文思蓝的渗出量明显增加（P001），说明造模成功；与模型组比较，阿司匹林组和感冒灵全方组小鼠的伊文思蓝渗出量明显减少（P005），差异显著；化学药和中药组小鼠的伊文思蓝渗出量虽有所减少，但无显著性差异（表1）。32对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响与模型组比较，感冒灵全方组和阿司匹林组小鼠的耳肿胀度明显减小（P005），肿胀抑制率分别为387%，351%；化学药和中药组小鼠的耳肿胀度虽有所减小，但无显著性差异，其肿胀抑制率分别为

26、264%，158%（表2）。33对角叉菜胶致大鼠胸膜炎的影响与假手术组比较，模型组大鼠胸腔渗出液中TNF和IL1含量、血清中TNF，IL1，IL8，IL6含量明显升高（P001或P005）；与模型组比较，阿司匹林组、感冒灵全方组、化学药组、中药组大鼠胸腔渗出液TNF和IL1含量明显降低（P001或P005）；阿司匹林组和感冒灵全方组大鼠胸腔渗出液IL8含量虽有降低趋势，但无显著性差异（表3）。34对酵母菌致大鼠发热的影响与模型组比较，感冒灵全方组、泰诺组、化学药组大鼠体温在药后58 h均明显降低（P001），药后48 h体温升高值也明显减小（P001）；中药组大鼠体温未见明显差异（表5，6）。

27、35对成熟KPN生物被膜的影响351生物膜内活菌量与空白对照组比较，硫酸卡那霉素在400081 mgL-1均不能降低成熟KPN生物被膜中的总菌量和活菌量，差异无统计学意义；感冒灵全方在55043 gL-1也不能降低生物被膜内总菌量，差异无统计学意义；但在551375 gL-1可显著降低生物被膜内活菌量，具有统计学意义（P001， P005）；感冒灵中药组分在45035 gL-1也不能减少生物被膜内总菌量；但在45225 gL-1可显著减少生物被膜内活菌量（P001）；感冒灵西药组方仅在10 gL-1时降低生物被膜内活菌量（P001），但对生物被膜内总菌量无降低作用；DMSO溶剂对照液在10个浓

28、度范围内也均不能减少生物被膜内总菌量和活菌量（图1，2）。结果提示，一旦KPN细菌生物膜成熟，硫酸卡那霉素对生物膜内细菌不能产生任何抑制作用；而感冒灵全方及中、西药组分则均可在一定程度上对生物膜内的活菌产生抑制作用。药物质量浓度单位mgL-1。图1999感冒灵及其中、西药组分对KPN细菌生物被膜成熟过程中总菌量的影响（CV法）Fig1The effects of GML， CMM and WMM on total bacterial number in the process of KPN bacterial biofilm maturation药物质量浓度单位mgL-1；与空白对照组比较*P

29、001，*P005。图2999感冒灵及其中、西药组分对KPN细菌生物被膜成熟过程中活菌量的影响（XTT法）Fig2The effects of GML， CMM and WMM on live bacterial number in the process of KPN bacterial biofilm maturation352扫描电子显微镜观察空白对照组细菌相互聚结、成团块样，菌体表面可见清晰的膜样结构、表面粗糙，菌体间分布大量黏液样物质；硫酸卡那霉素组（40 mgL-1）细菌聚集成团块状，菌体表面粗糙，也可见清晰的膜样结构存在，菌体间也可见黏液样物质，与空白对照组细菌形态、结构相似；9

30、99感冒灵全方组（55 gL-1）细菌排列相对松散，菌体表面较为光滑，基本观察不到膜样结构，菌体间基本观察不到黏液样物质分布；999感冒灵中药组分（45 gL-1）可见部分菌体表面较光滑，但仍可在部分菌体表面观察到较为清晰的膜样结构存在，菌体间有少量的黏液样物质分布；999感冒灵西药组分（10 gL-1）细菌呈团块状，但菌体表面较为光滑，菌体间有少量的黏液样物质分布，部分菌体呈现球形变；DMSO溶剂对照组菌体结构与空白对照组接近，菌体表面可见清晰膜样结构存在，菌体间有大量黏液样物质分布（图3）。结果提示，硫酸卡那霉素对成熟KPN细菌生物膜结构并无任何影响，而999感冒灵全方及中、西药组方均可在

31、一定程度上产生破坏KPN成熟生物膜结构的作用。4讨论感冒是由病毒或细菌引起的上呼吸道炎症。炎症是机体对损伤因子所发生的一种特异防御反应。炎症有急性和慢性炎性反应之分，感冒的炎症主要是急性炎症反应，为使实验结果更接近临床情况，本实验采用3种常用的急性炎症模型2比较感冒灵全方与其组方中相同剂量化学药和中药组分的抗炎作用。由于细胞因子在炎症的发生、发展过程中具有重要作用，故在试验中也比较研究了上述药物对炎性因子的影响，并结合细菌生物被膜研究方法，评价其抗菌作用特点。41对非特异性炎症及其炎性因子的抑制作用实验结果显示，在腹腔毛细血管通透性增加小鼠模型上，感冒灵化学药组分和中药组分均不能有效降低小鼠腹

32、腔伊文思蓝的渗出量（表1）；在小鼠耳肿胀试验中，感冒灵化学药组分和中药组分也不能明显抑制二甲苯致小鼠的耳肿胀度（表2）；这提示无论是中药部分或者化学药部分，单独使用没有显著的抗炎药理作用。但感冒灵全方在上述2模型的试验中却显示明显的抗炎作用。上述结果表明，感冒灵化学药组分和中药组分在抗炎方面上显示一定的协同作用。炎症反应的发生过程中，它们是主要影响炎症进程的细胞因子3。TNF由活化的单核巨噬细胞产生；经抗原刺激的T细胞、活化的自然杀伤细胞（NK细胞）和肥大细胞也可分泌TNF，其在细胞因子级联反应刺激其他细胞因子的合成过程中发挥着主要作用，可刺激增强中性多核白细胞的浸润、吞噬活性与氧自由基的产生、溶酶体的释放等，启动单核巨噬细胞释放IL6，IL8，PGE2等炎症介质，通过多种途径发挥其致炎作用，而后者反过来又增强组织细胞对TNF2的敏感性。TNF属内源性致热原，可引起发热，在炎症病理性损害和感染性休克中起重要作用，并被认为是导致内毒素休克的关键介质4。IL1由多种细胞（如单核巨噬细胞、中性粒细胞