增强阿糖孢苷的抗肿瘤活性研究.docx

1、增强阿糖孢苷的抗肿瘤活性研究浙江大学远程教育学院本科生毕业论文（设计）开题报告题 目 增强阿糖胞苷抗肿瘤作用的研究 专 业 09秋药学 学习中心 长兴医学 姓 名 杨洋 学 号 709228227004 指导教师 何洁 2014 年 4 月 14 日摘要：通过对阿糖胞苷的代谢过程进行调节或对肿瘤细胞生物学行为进行调节， 均可增强其抗肿瘤作用 。代谢过程调节包括抑制脱氧胞苷脱氨酶和增强脱氧胞苷激酶活性。生物学调节包括：应用造血生长因子和蛋白激酶C活化剂以及应用反义技术，下调bcl-2基因表达。，转染miR 15a寡核苷酸人人淋巴瘤细胞系Raji，可负性调控BCL-2的表达，进而诱导Raji细胞的

2、凋亡。AraC合并应用EGCG可增强对人白血病HL-60细胞的抗肿瘤活性。CBP与rbGM-CSF类似，可能通过促进耐药AML细胞进A增殖周期，从而增强AML细胞对Ara-C的敏感性。针对bcl-2mRNA翻译起始区和蛋白编码区两个靶点的反义寡核苷酸能增强Ara-C诱导AL、CLL细胞的凋亡。关键字：阿糖胞苷，代谢调解，生物调节，Pre-miR-15a，没食子酸酯，脐血血浆（CBP），Bc1-2反义寡核苷酸目录增强阿糖胞苷抗肿瘤作用的研究 4一、阿糖胞苷的说明 4二、阿糖胞苷代谢过程的调节 4（一）抑制脱氧胞苷脱氨酶 5（二）增强dCK 的活性 5三、生物学调节 6（一）造血生长日子 6（二）

3、细胞内信号传导系统调节 6（三）应用反义技术下调be12基因表达 6四、Pre-miR-15a增强Raji细胞对阿糖胞苷的敏感性 6五、表没食子儿茶素没食子酸酯增强阿糖胞苷对HL-60细胞的抗肿瘤活性 7六、脐血血浆（CBP）增强阿糖胞苷抗白血病效应 8七、Bc1-2反义寡核苷酸增强阿糖胞苷诱导原代白血病细胞凋亡 8参考文献： 9增强阿糖胞苷抗肿瘤作用的研究一、阿糖胞苷的说明阿糖胞苷（英语：Cytarabine或Cytosine arabinoside）是一种化学疗法药物，主要用于治疗恶性血液病，如急性粒细胞白血病和非霍奇金氏淋巴瘤。阿糖胞苷又被称为Ara-C，名字来源于英文全称“Arabin

4、ofuranosyl Cytidine”两个单词的开头。它通过干扰DNA合成来消灭癌细胞。这种药物的化学结构是胞嘧啶与阿拉伯糖结合成的核苷，因此得名“阿糖胞苷”。 阿糖胞苷主要在肝内经胞苷脱氨酶脱氨而转变为无活性的阿糖尿苷，口服后在肠内易脱氨失效；癌细胞易产生抗药性。可能因脱氨酶含量增加使大量阿糖胞苷脱氨成为无效的阿糖尿苷之故。一次大剂量静脉注射，大约15分钟内即从血中消失，因此必须静脉滴注或分次静脉注射才能维持有效血液浓度。易通过血脑屏障，脑脊液中浓度约为血浓度的40%，因脑脊液中脱氨酶含量低，其生物半衰期长达211小时。主要由胆汁入肠和经肾排泄。24天后从尿中排出70一90%，主要为代谢物

5、。阿糖脆苷(Ara c)是急性髓细胞白血病(AML)等肿瘤化疗中最有效的药物之一。白血病细胞对Ara C可产生原发性或继发性耐药。大剂量AraC(HD AraC)治疗难治性白血病已获得大于50的完全缓解(cR)率，但缓解期短，常发生严重的毒性反应。因此，寻找能增强Ara C抗肿瘤作用的途径和方法就能恢复肿瘤细胞对Ara C的敏感性，可望提高肿瘤的治愈率和长期生存率。另外也可以在保证疗效的前提下，减少Ara C的用量，从而减轻其毒性反应。二、阿糖胞苷代谢过程的调节 Ara C只能在正常脱氧胞苷(dCR)补救台成途径中的酶作用下转变为三磷酸阿糖胞苷(Ara CTP)。Ara-CTP为Ara-C的活

6、性物质与三磷酸脱氧胞苷(dCTP)竞争掺入DNA链中抑制DNA的合成。而既能通过补救合成途径又能通过从头合成途径生成的dCTP。对脱氧胞苷激酶(deoxycyfidinekinase，dCK)有负反馈调节作用使Ara CTP生成减少。调节以上两个台成途径中关键酶的活性，可增加Ara CTP的生成增强Ara-C抗肿瘤作用1。（一）抑制脱氧胞苷脱氨酶血浆中大部分AraC，主要由肝脏中的dCR脱氨酶催化成为代澍产物阿糖尿苷(Ara-u)。标准剂量Ara-C (200mgm 静脉滴注)与dCR脱氨酶的抑制剂四羟基尿嘧啶(TetrahydrouridineTHU)台用时血浆浓度增高。由此推测细胞内Ara

7、 CTP随之增高。目前尚无证据说明标准剂量Ara-C和THU联合应用能改变Ara -C的治疗效果。（二）增强dCK 的活性由dCK催化AraC磷酸化成为Ara CMP，是Ara CTP形成的限速步骤。抑制dCTP从头合成途径中各个关键酶的活性都可使dCTP池缩小，对dCK的负反馈调节减弱，或者直接增加dCK基因表达，均可使dCK酶活性增加1。1、减弱dCTP对dCK的负反馈调节（1）抑制天门冬氨酸转氨基甲酰酶：N一磷酸乙酰基-l-天门冬氨酸抑制天门冬氨酸转氨基甲酰酶活性使细胞内的三磷酸尿苷(UTP)、三磷酸胞苷(CTP)和dCTP池缩小。合用PALA和Ara- C，使人类白血病细胞(HL-60

8、 中DNA的Ara-CTP掺入量增加。值得注意的是Ara-C作为磷酸基受者时，UTP有可能为磷酸基供者。因此，人类白血病细胞中PALA导致的dCTP池缩小而使Ara-C磷酸化率增高，将宵可能被磷酸基供者池的同时缩小所抵消。（2）抑制CTP合成酶：3-deazauridine(3-DU)在转变为核苷酸形式后，对CTP合成酶具有很强的抑制作用。实验表明，0.1 aM 的Ara -C和10M 的3-DU，对HL-60的杀伤率均小于10 ；而当两者同时使用时，杀伤率大于99 ，提示两者有协同作用。dCK功能缺陷的耐药白血病细胞不能利用补救途径中的激酶来扩张dCTP池，故比野生型细胞对3-DU的细胞毒性

9、更为敏感。2、增强dCK的基因表达 （1）使dCK基因低甲基化：研究表明，正在转录时的dCK基因，为低甲基化而在非转录时为高甲基化。5-氮杂胞苷(5-azacytidine，5-AzaC)为一抗代谢物，通过非竞争性抑制DNA甲基转移酶而阻止胞苷甲基化，导致DNA低甲基化。因而可使小鼠和人的白血病细胞dCK基因重新表达。Avramins等在17例HD AraC无效或HDAraC和缓解后复发的儿童ALL中，序贯使用原剂量Ara- C和5-AzaC。结果显示，16例中有15例病人的细胞内AraCTP有不同程度增高，DNA合成能力减低，DNA甲基化水平降低约一半。 （2）野生型dCK基因转移：dCK功

10、能缺失是常见的一种Ara-C耐药机理。dCK基因突变则是其主要原因。Stegmann等将野生型dCK cDNA，转入dCK基因突变的鼠Ara-C耐药白血病细胞中表达，可使AraC的细胞毒性完全恢复。三、生物学调节（一）造血生长日子造血生长固子(HGF)，诸如干细胞因子(SCF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒单细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素-3 (IL-3)等，增强Ara-C细胞毒性的作用机理为：刺激白血病细胞由静止期进入增殖期，有利于细胞周期持异性药物杀伤肿墙细胞。可选择性地改变Ara-CTP与dCTP比而影响治疗效果。Tanaka等发现先用GM-CSF处理16小时再用Ara

11、-C，白血病细胞的Ara-CTPdCTP比正常细胞增加7倍。G-CSFiL-3融合蛋白PIXY321，能增加Ara-c诱导的白血病细胞凋亡。SCF分别与G-CSF、GM-CSF和IL-3合用时。均能增强Ara-c对白血病细胞的杀伤作用，其中包括继发于骨髓增生异常综合征的白血病细胞 。与G-CSF和GM-CSF比较，IL-3的作用最强，而对正常骨髓细胞的毒性作用最弱1。（二）细胞内信号传导系统调节蛋白激酶c (PKC)活化剂Bryostatin 1与Ara-c合用对HL-60细胞杀伤作用增强。电泳见180200bp的DNA片段增多，提示Bryostatln1可能调节白血病细胞中的信号传导系统。加

12、强了Ara-C相关的细胞凋亡或程序化死亡。（三）应用反义技术下调be12基因表达AMI原始细胞的bcl-2基因高表达，导致临床化疗效果不佳。Bcl-2基因主要是通过防止程序化死亡而使细胞生存期延长。Keith等用针对bcl-2基因转录起始部位序列的反义寡核苷酸，使17例AML病人中7例的白血病细胞bcl-2基因表达明显下降，从而使这些原始细胞对Ara-c诱导的程序化死亡的敏感性增加。该方法可能具有临床应用前景。四、Pre-miR-15a增强Raji细胞对阿糖胞苷的敏感性MicroRNA(miRNA)是22个左右核苷酸组成的内源性RNA，通过切割mRNA或翻译抑制两种机制，在转录后水平对基因表达

13、进行负性调控。它广泛地参与细胞的生长、发育、分化、增殖和凋亡。我们前期的研究表明，转染miR 15a寡核苷酸人人淋巴瘤细胞系Raji，可负性调控BCL-2的表达，进而诱导Raji细胞的凋亡2。目前的研究提示，miRNA可能与肿瘤细胞对化疗药物的敏感性或耐药性有关3。我们的研究表明，在转染表达pre-miR-15a重组质粒后，细胞内miR-15a的表达水平显著增高，明显高于空白对照组和阴性对照质粒组。转染pre-miR-15a人Raji细胞后，Ara-C的IC50 值明显降低，且Ara-c对细胞活力的抑制作用明显增强。同时，转染pre-miR-15a的Rajj细胞在使用Ara-C后出现大量凋亡小

14、体，凋亡率明显增高，提示pre-miR-15a可以通过调控BCL-2的表达而改变Raji细胞对Ara-C的敏感性。与普通的胃癌细胞株SGC7901相比，多耐药胃癌细胞株SGC7901VCR中miR-15b和miR-16表达显著上调，利用反义技术抑制miR-15b和miR-16的表达后，可明显增加SCG7901VCR对化疗药阿霉素、长春新碱、VP-16和顺铂的敏感性4。综上所述，本实验表明，pre miR-15a寡核苷酸可增强naji细胞对阿糖胞苷的敏感性。五、表没食子儿茶素没食子酸酯增强阿糖胞苷对HL-60细胞的抗肿瘤活性在肿瘤治疗研究领域，生化调节剂或生化调节药物受到广泛关注。生化调节剂作用

15、于生化代谢的特定环节或分子靶点，可提高药物的抗肿瘤活性或降低其毒性5 。对中药与其他天然药物抗肿瘤生化调节剂的筛选与研究，确定了茶多酚、丹酚酸A、抗生素C3368-A、抗生素C3368-B以及肉桂酰胺等具有生化调节剂的活性6-10。茶多酚是一个多组分的提取物，以表没食子儿茶素没食子酸酯(一)epigallocatechin-3-gallate(EGCG)含量最高，占儿茶素的80左右。EGCG是一个很有前途的生化调节剂。Khafif等的体外试验发现EGCG与姜黄素合用对发育异常的口腔粘膜白斑细胞和鳞状细胞癌细胞的生长抑制有协同作用11。Suganuma等发现EGCG增强苏灵大和他莫昔芬的防癌作用

16、，减少后两种药物的剂量，降低毒性。苏灵大用于预防、抑制家族性结肠息肉病患者的结肠腺瘤形成，但是由于其毒性过大在剂量上受到限制。试验表明浓度高达100 mol/L 的苏灵大也不能诱导人肺癌细胞PC-9细胞的凋亡，而合用75mol/L EGCG后，10 mol/L浓度的苏灵大即可以诱导PPC-9细胞的凋亡12。而研究表明10 g/ml EGCG 自身对HL-60细胞几无抗肿瘤作用，但对005 g/ml AraC诱导的人白血病HL-60细胞增殖抑制、G1期阻断、S期抑制、细胞凋亡作用均具有增强作用，并能通过取消核苷的补救作用而增强AraC的抗肿瘤活性。六、脐血血浆（CBP）增强阿糖胞苷抗白血病效应A

17、ra-C是一种s期特异性抗癌药物，其疗效与s期AML细胞的数量成正比。近年来文献报道，用造血生长因子如IL-3、G-CSF、GM-CSF等对AML细胞和正常人骨髓细胞进行处理后，S期细胞数均明显增加。实验结果发现，用CBP或rh-GM-CSF对AML细胞处理48小时后，S期细胞数增加13-14，说明CBP或rhGM-CSF具有刺激AML细胞进入增殖期的作用，故认为CBP和rhGM-CSF能增强耐药AML细胞对Ara-C的敏感性，其机制与增加s期AML细胞数有关。CBP中富含多种造血生长因子，包括较高水平的G-cSF、GM-CSF、M-CSF等，也含有一定量的IL-3、IL-6，并能诱导G0期细

18、胞进入增殖周期15。最近，Carow等研究发现，CBP中还可能存在一种或几种尚未认知的造血因子，具有刺激脐血和骨髓中造血干细胞的自我更新和增殖的作用，且效果略优于rhGM-CS16。可见CBP中造血生长因子不仅含量较高，而且种类较多，可能对各阶段干细胞均有刺激作用，因此，利用CBP来增强AML细胞对Ara-C敏感性的设想是可行的。研究结果显示，CBP与Ara-C合用时，Ara-C对耐药AML细胞的毒性明显增加，具有耐药逆转效应。以rhGM-CSF作对照研究发现，CBP不但具有类似作用，且较之略优，这可能是由于CBP中有GM-CSF、G-CSF及IL-3等多种造血因子，相互之间有协同作用的缘故。

19、七、Bc1-2反义寡核苷酸增强阿糖胞苷诱导原代白血病细胞凋亡研究表明17：约50 的肿瘤细胞都有bc1-2基因的高表达，bcl-2基因几乎表达于除红细胞系外的所有造血细胞系。Bc1-2蛋白表达的高低与肿瘤细胞对多种化疗药物敏感性密切相关，bc1-2基因的过度表达可明显降低化疗药物引起的细胞凋亡18-19。大量的研究证实，针对bc1-2mRNA翻译起始部位的反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide，AS-ODN)可抑制许多肿瘤细胞中bcl-2的表达，促进细胞的凋亡，提高肿瘤细胞对化疗的敏感性20-21。我们在前一阶段的研究中22-23，通过采用RNAstruct

20、ure 35程序模拟bcl-2 mRNA二级结构来设计反义作用靶点，已经在bcl-2 mRNA翻译起始区和蛋白编码区发现了2个有效反义作用靶点。并且证实针对这两个靶点的AS-ODN能增强HL-60和K562细胞对阿糖胞苷(araninosyl cytosine，Ara-c)、柔红霉素、足叶乙甙的敏感性。研究证实：bcl-2基因在大多数人类肿瘤中都有较高程度的表达，并且与放疗和化疗耐受有密切关联。众多的事实表明：通过反义技术降低bcl-2基因表达的水平可以明显地抑制白血病细胞的生长活性，促进细胞凋亡，使肿瘤细胞对抗癌药物更加敏感19-20。两个不同寡核苷酸能够降低Bcl-2蛋白的表达水平，增强A

21、L或CLL病人白血病细胞对Ara-C的敏感性，促进细胞凋亡。这些结果提示：以AS-ODN作用于bcl-2基因，可以增强癌细胞对化疗药物的敏感性，提高化疗药物的治疗效果。Campos等人报道24在AS-ODN存在的情况下，Ara-c与柔红霉素均能更有效地杀伤细胞。Keith等人亦证实25AS-ODN通过抑制Bcl-2蛋白的表达可以诱导原代培养的急性髓白血病细胞的凋亡，增强急性髓白血病细胞对Ara-c的敏感性。参考文献：1：国外医学辅血且血蒗学分册1996年第19卷第2期；2：谌琴，何冬梅，张洹，miR-15a和miR-16-1诱导人淋巴瘤Raji细胞株的凋亡J暨南大学学报，2008，29(6)：

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