基因突变蛋白质效应.docx

1、基因突变蛋白质效应母源性3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症临床及基因突变分析【摘要】 目的 报告5例母源性3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症（maternal 3-methylcrotonyl-coenzyme A carboxylase deficiency，MCCD），通过基因突变分析证明其临床诊断。 方式 将串联质谱新生儿筛查发觉3-羟基异戊酰肉碱（C5-OH）增高的5例新生儿及其母亲纳入研究。用尿气相色谱质谱分析进行MCCD临床诊断；基因突变检测及功能分析明确诊断。 结果 （1）发觉5例无病症母亲血C5-OH浓度明显增高，尿3-羟基异戊酸、3-甲基巴豆酰甘氨酸增高，诊断为良性MCCD。其新

2、生儿血C5-OH浓度增高，3例随访后浓度慢慢下降或达正常。（2）发觉4种MCCC1基因新变异：1680A（25%）、c.203CT/、C/、+5GT和2种MCCC2基因突变c.1406GT/469L（新变异）及 c.592CT/。新变异可能阻碍蛋白结构和功能。结论 对筛查血C5-OH增高的新生儿母亲应常规检测以诊断母源性MCCD。MCCC1基因突变多见。【关键词】3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症；3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶；基因突变；质谱分析3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症（3-Methylcrotonyl-coenzyme A carboxylase deficiency，MCCD）（OMI

3、M 210200/210210）是一种亮氨酸代谢障碍所致的常染色体隐性遗传的有机酸代谢缺点病，1970年由Eldjarn等第一次报导1。因基因MCCC1（MIM*609010）或MCCC2（MIM*609010）突变致使亮氨酸代谢途径中3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶（3-Methylcrotonyl-coenzyme A carboxylase，MCC）缺乏，3-甲基巴豆酰辅酶A不能转化成3-甲基戊烯二酰辅酶A而堆积，致使血3-羟基异戊酰肉碱（3-hydroxy-isovalerylcarnitine，C5-OH）增高、尿3-甲基巴豆酰甘氨酸（3-methylcrotonyl-glycine，3-

4、MCG）和/或3-羟基异戊酸（3-hydroxy isovalerate，3-HIVA）代谢产物增多。患者的临床表型变异较大，多数无病症，少数可表现为严峻的神经系统受损2。部份发达国家于20世纪90年代初应用串联质谱（tandem mass spectrometry，MS/MS）开展新生儿筛查，统计显示MCCD发生率约为1/36 0002-4。国内研究相对滞后，咱们自2003年起率先在国内开展MS/MS新生儿筛查，对血C5-OH浓度增高的新生儿，常规对其父母进行MS/MS分析，迄今已发觉5例母源性MCCD。而国内除个别MCCD病例报导外5-6，尚未见母源性MCCD及基因研究报导。本文报导5例母

5、源性MCCD临床、生化表型及转归，和基因突变分析结果，以从分子生物学水平证明其临床诊断。1 对象与方式 对象 2003年至2021年9月，咱们对491 700名新生儿采纳MS/MS进行遗传代谢病筛查，发觉60余例新生儿血C5-OH浓度高于正常切值 mol/L，对其父母进行MS/MS分析，发觉5例母亲（22 31岁）血C5-OH浓度明显增高（ ）mol/L，其中4例伴游离肉碱（free carnitine，C0）降低（ ）mol/L。5例母亲平素体健、孕期及临盆均无临床病症；临盆的新生儿筛查时血C5-OH浓度增高（ ）mol/L，临床无病症（表1）。 方式 临床诊断及随访：（1）采纳尿气相色谱质

6、谱仪（gas chromatography mass spectrometry，GC/MS）对血C5-OH增高相关的有机酸代谢病进行诊断与辨别诊断；（2）生物素酶活性测定以排除生物素酶缺乏；（3）生化检测包括乳酸、血氨、肝肾功能、血气、酮体等；（4）每3月 1年对5例新生儿随访，评估临床病症、生长及智能发育等，复查血MS/MS、尿GC/MS，了解临床转归。 基因分析 .1基因突变检测 在知情同意的原那么下，搜集外周血抽提父母及新生儿、50个正常对照者基因组DNA；参考文献7和Primer Premier 5软件设计引物，扩增MCCC1基因19个外显子和MCCC2基因17个外显子及两头内含子序列

7、；按常规方式和反映条件进行PCR扩增、测序，Chromas软件进行突变分析（参考MCCC1 GenBank：；MCCC2 GenBank：）。.2基因新变异分析：（1）正常对照者100个等位基因的相关片段测序分析以排除多态性可能。（2）PCR-限制性片段长度多态性分析（PCR-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）：采纳BstX、AlwN两种限制性内切酶对c.203CT/、C/错义突变酶切分析。（3）逆转录PCR测序：提取患者RNA，经试剂盒TaKaRa PrimeScript RT Master逆转录成cDNA进行测序分析，以验证

8、剪切突变+5GT。（4）采纳软件Clustal（）对不同物种MCCC1和MCCC2氨基酸序列比对分析，以了解新型错义突变位点氨基酸的保守性。（5）PolyPhen-2（）、SIFT（）、UniProt（）和PDB（）软件分析新变异是不是对蛋白质的结构和功能产生阻碍。2 结 果 临床诊断及随访 母亲MCCD诊断 5例母亲血MS/MS检测结果显示C5-OH浓度增高或伴C0降低，血异戊酰烯肉碱、丙酰肉碱、丙酰肉碱/乙酰肉碱浓度均正常；4例尿GC/MS结果显示3-MCG增高为 272，3-HIVA增高为 499（表1），无3-羟基丙酸、甲基枸橼酸、3-羟基-3-甲基戊二酸、3-甲基戊烯二酸、2-甲基-

9、3-羟基丁酸及酮体等排出；生物素酶活性正常；依照上述排除其它C5-OH增高相关的有机酸代谢病，结合临床无病症，诊断为良性MCCD。 子女诊断及随访 5例新生儿筛查时血C5-OH浓度（ ）mol/L，诞生2周召回时降至（ ）mol/L（下降%），2例尿GC/MS分析显示3-HIVA或3-MCG略高，结合临床无病症、生化检查正常，诊断为母源性MCCD。例1和例2别离于生后岁及4月随访时，血C5-OH降至正常；例4生后月末次随访时，血C5-OH由 mol/L降至 mol/L（下降%）；例2生后3周复查尿GC/MS时，尿3-HIVA降至正常；例4尿3-MCG仍微量排出；余2例未复查血尿。所有新生儿末次

10、随访年龄（1-38）月时仍无临床病症，生长及智能发育正常。 基因分析 基因突变 4例母亲及子女同意了基因分析：突变检出率为%（7/8）；共检出4种MCCC1突变：其中1680A突变频率最高，占%（2/8），其他3种为c.203CT/、C/和+5GT，均未见报导。共检出2种MCCC2突变：c.1406GT/469L（未报导）及c.592CT/（已报导）。 4例子女均携带来源于母亲的一个杂合突变。（表1，图1）表1 5例MCCD母亲及子女生化和基因突变结果 病例血C5-OH浓度血C0浓度尿3-HIVA尿3-MCG母突变1母突变2子女突变子女转归（C5-OH浓度）母 子/女母 子/女母 子/女母 子

11、/女核苷酸改变 突变效果核苷酸改变 突变效果 1 ND499 N60 Nc.203CT* *1680A* 插入突变同突变1岁降至正常 2 N N NC* *+5GT* 剪切突变同突变14月降至正常 3 ND N35 Nc.592CT c.1406GT* 469L* 同突变1未随访 4 N N272 1680A* 插入突变同突变1月下降49 % 5 NND NND NNDNDND未随访 正常值 mol/L10-60 mol/LT突变型和野生型逆转录测序； 1d：例3母子MCCC2突变；1e：例4母女MCCC1突变 基因新变异分析.1 正常对照者100个等位基因中未检出5种新变异，排除多态性可能。

12、.2 PCR-RFLP分析：新变异c.203CT和C用BstX、AlwN两种内切酶进行酶切，结果提示BstX将对照者及父亲酶切产生136 bp、117 bp两个片段，c.203CT突变的等位基因由于不能被酶切而产生1个253 bp片段，故携带此杂合突变的母子将酶切产生253 bp、136 bp和117 bp 三个片段（图2a）；AlwN将对照者酶切成137bp、128 bp两个片段，C突变的等位基因不能被酶切而产生1个265 bp片段，携带此杂合突变的母子经酶切产生265 bp、137 bp和128 bp三个片段，未取得父亲DNA（图2b）。图2 PCR-RFLP酶切图 2a：BstX对例1

13、c.203CT突变酶切；2b：AlwN对例2 c.572TC突变酶切；P：母亲患者；Z：子女；F：父亲；N：对照者.3 剪接突变+5GT经逆转录cDNA反向测序，结果显示外显子6显现148个碱基杂合缺失而引发剪接错误（图1c）。.4不同物种氨基酸序列比对：2种MCCC1错义突变（c.203CT/，C/）及1种MCCC2错义突变c.1406GT/469L经6个不同物种与人类基因相应位点氨基酸比对分析，MCCC1第6八、191位和MCCC2第469位均为高度保守氨基酸（图3）。图3 3种新错义突变在不同物种中的氨基酸序列比对.5 PolyPhen-二、SIFT、UniProt和PDB分析 3种新型

14、错义突变经PolyPhen-2评分 1，SIFT评分均为0，突变致使蛋白的侧链结构发生转变，可能改变蛋白构象而致病：（1）c.203CT/突变位于生物素羧化作用部位（蛋白质活性部位），突变致使68位丙氨酸变成缬氨酸，侧链结构改变并与73位缬氨酸主链形成新氢键，氨基酸残基较野生型增大（图4a）；（2）C/突变位于ATP结合和生物素羧化作用部位（蛋白质活性部位）且位于肽链-螺旋结构区，突变致使191位亮氨酸变成脯氨酸，侧链结构改变并与187位丝氨酸主链形成新氢键，氨基酸残基较野生型减小（图4b）；（3）c.1406GT/469L突变位于羧基转移酶部位，突变致使469位精氨酸变成亮氨酸，侧链结构改变

15、与468位丙氨酸主链间氢键消失，氨基酸残基较野生型减小且具有更强的疏水性，电荷显中性（野生型带正电）（图4c）。图4 蛋白质二级结构图 红色：突变位点氨基酸主链；粉色：侧链；绿色虚线：氢键；粉色虚线：突变产生的新氢键；4a：c.203CT/野生型和突变型；4b：C/ 野生型和突变型；4c：c.1406GT/469L野生型和突变型3 讨论MCCD的临床表型不同较大，又分为有病症型，无病症型和母源型3种。严峻者在新生儿期表现为喂养困难、阵发性呕吐、腹泻，抽搐、嗜睡、昏迷、呼吸暂停、生长发育迟缓、肌张力异样等；临床以无病症型多见2-4；母源型较少，即母亲为MCCD，因其增高的C5-OH通过母乳或胎盘

16、传输给新生儿8，致使新生儿筛查时血C5-OH增高，对父母检测后才发觉母亲是MCCD患者。有些母亲患者在禁食或高蛋白质饮食下、尤其在孕期可显现肌病、肝酶增高、脂肪肝和易疲劳等病症。Gibson等9率先报导了4例MCCD母患共14次孕期及临盆史，其中仅1例曾显现上诉病症。Koeberl等10报导4例MCCD母患，除1例曾在高蛋白饮食后显现呕吐外，其余均无病症。母源性MCCD新生儿通常生后筛查时血C5-OH浓度不同程度增高，随访一段时刻可恢复正常9-11。本文在国内第一次报导了5例母源性MCCD，母亲为良性MCCD，受阻碍的新生儿诞生3天血C5-OH不同程度增高，随访后慢慢下降或达正常（最长随访至3

17、岁），均无病症，生长及智能发育正常，诊断为母源性MCCD（临时性）。因此，对新生儿筛查发觉血C5-OH增高者，需常规对其母亲检测以诊断母源性MCCD。MCCD与以下4种C5-OH增高疾病的辨别要紧依托尿GC/MS。（1）多种酰基辅酶A羧化酶缺乏症：除尿3-HIVA及3-MCG增高外，3-羟基丙酸、甲基枸橼酸、甲基巴豆酰甘氨酸及酮体增高12；（2）3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A裂解酶缺乏症：尿特异性3-羟-3-甲基戊二酸增高；（3）3-甲基戊二酰辅酶A水解酶缺乏症：3-甲基戊烯二酸、3-甲基戊二酸增高；（4）-酮硫解酶缺乏症：大量酮尿及2-甲基-3-羟基丁酸增高。咱们报告的MCCD母亲患者及其子女

18、的血、尿质谱分析均排除了上述其他4种有机酸代谢病。无临床病症的MCCD患者无需医治。关于有病症者可给予限制亮氨酸、蛋白质饮食，而甘氨酸或生物素医治通常无效；关于伴游离肉碱缺乏者需要补充左旋肉碱；急性发作期患者应给予葡萄糖、纠酸、维持电解质平稳等医治13。MCCC1和MCCC2基因突变都可致使MCCD。MCCC1定位3q25-27区，包含19个外显子，长度为2580 bp，编码725个氨基酸多肽。MCCC2定位区，包括17个外显子，长度为2304 bp，编码563个氨基酸多肽。MCCC1包括共价连接生物素的辅基及碳酸氢盐和ATP的结合位点，MCCC2则包括酰基辅酶A酶作用物的结合位点即要紧结合甲

19、基巴豆酰辅酶A3。目前已报导MCCC1和MCCC2基因突变各60余种14-16，c.1155AC（）为较常见的热点突变。2021年韩国第一次报导c.838GT（）为其热点突变，日本于2007年也报导1例携带此突变17。本研究发觉3例母亲携带2个基因突变，1例仅找到1个杂合突变，可能因另一突变隐藏于非编码区无法经PCR直接测序检出或其他不确信因素造成；新生儿均携带来自母亲的1个杂合突变，为杂合子。MCCC1突变为MCCD患者较常见的突变。已报导突变c.592CT/见于1例无病症新生儿筛查发觉的MCCD患者，该突变位于羧基转移酶位点使198位谷氨酰胺变成终止密码子，阻碍了蛋白结构和功能17。已发觉

20、的5种新变异均被证明可能对蛋白结构和功能产生阻碍：c.203CT/突变将产生新的氢键，氨基酸残基较野生型增大，可能无法匹配蛋白质的核心区域而阻碍蛋白的活性；C/突变也产生新的氢键，氨基酸残基较野生型减小，可能引发蛋白核心区域空缺，且突变后脯氨酸破坏-螺旋结构，对蛋白质结构造成严峻阻碍；c.1406GT/469L突变引发氢键消失，氨基酸残基较野生型减小，疏水性增强，电性改变可能造成和其他分子彼此作用消失；1680A引发突变位点后第9个氨基酸提早显现TAA终止密码子造成蛋白结构改变；剪切突变+5GT使外显子6杂合缺失引发剪切错误，造成蛋白结构改变。因此，上述5种未报导的变异极可能是致病新突变，需进

21、一步体外蛋白功能表达研究验证。已有的研究提示MCCD表型和基因型间无明确的相关性，调控基因和环境因素等也可能阻碍表型。例如，较常见的MCCC1突变可致使严峻的临床表型，但也可无病症，故难以通过基因型预测临床表型3,11。因本研究病例较少，临床无病症，难以分析基因型和表型的关联性，尚需积存更多的病例进行分析。参考文献1 Eldjarn L, Jellum E, Stokke O, et al. -Hydroxyisovaleric aciduria and -methylcrotonylglycinuia:a new inborn error of metabolism. Lancet, 197

22、0, 2: 521-522.2 Stadler SC, Polanetz R, Maier EM, et al. Newborn screening for 3-methylcrotonyl-CoA carboxylase deficiency: population heterogeneity of MCCA and MCCB mutations and impact on risk assessment. Hum Mutat, 2006, 27: 748-759.3 Baumgartner MR, Almashanu S, Suormala TC, et al. The molecular

23、 basis of human 3-methylcrotonyl-CoA carboxylase deficiency. J Clin Invest, 2001, 107: 495-504.4 Frazier DM, Millington DS, McCandless SE, et al. The tandem mass spectrometry newborn screening experience in North Carolina: 19972005. J Inherit Metab Dis, 2006, 29: 76-85.5 Zhang XX, Mao DA, Luo XP, et

24、 al. 3-Methylcrotonyl-CoA carboxylase deficiency: 2 cases report and literature review. Chin J Pract Pediatr, 2005, 20: 507-508. 张星星，毛定安，罗小平, 等. 单纯型3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症2例并文献温习. 中国有效儿科杂志，2005, 20: 507-508. 6 Xue ZH. 3-Methylcrotonyl-CoA carboxylase deficiency: a case report. Chin J Contemp Pediatr, 2020,

25、 12: 157-158. 薛志华. 3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症1例. 中国今世儿科杂志, 2020, 12: 157-158. 7 , , , et al. Cloning of the human MCCA and MCCB genes and mutations therein reveal the molecular cause of 3-methylcrotonyl-CoA carboxylase deficiency. Hum Mol Genet, 2001, 10: 1299-1306.8 , , , et al. Elevated neonatal 3-OH isoval

26、erylcarnitine due to breast milk sources in maternal 3-MCC deficiency. Mol Genet Metab, 2020, 101: 84-86.9 Gibson KM, Bennett MJ, Naylor EW, et al. 3-Methylcrotonyl-coenzyme A carboxylase deficiency in Amish/Mennonite adults identified by detection of increased acylarnitines in blood spots of their

27、children. J Pediatr, 1998, 132(3pt1): 519-523.10 Koeberl DD, Millington DS, Smith WE, et al. Evaluation of 3-methylcrotonyl-CoA carboxylase deficiency detected by tandem mass spectrometry newborn screening. Inherit Metab Dis, 2003, 26: 25-35.11 Dantas MF, Suormala T, Randolph A, et al. 3-Methylcroto

28、nyl-CoA carboxylase deficiency: mutation analysis in 28 probands, 9 symptomatic and 19 detected by newborn screening. Human Mutat, 2005, 26: 164.12 Wang T, Ye J, Han LS, et al. Gene mutation analyses in Chinese children with multiple carboxylase deficiency. Chin J Med Genet, 2020, 26: 504-510. 王彤，叶军

29、，韩连书, 等. 12例多种羧化酶缺乏症的基因突变分析. 中华医学遗传学杂志，2020, 26: 504-510.13 Arnold GL, Koeberl DD, Matern D, et al. A Delphi-based consensus clinical practice protocol for the diagnosis and management of 3-methylcrotonyl CoA carboxylase deficiency. Mol Genet Metab, 2020, 93: 363-370.14 Cho SY, Park HD, Lee YW, et a

30、l. Clin Genet, 2021, 81: 96-98.15 J, , , et al. Uneventful clinical courses of Korean patients with methylcrotonylglycinuria and their common mutations. J Hum Genet, 2021, 57: 62-64.16 , , , et al. 3-Methylcrotonyl-CoA carboxylase deficiency: Clinical, biochemical, enzymatic and molecular studies in 88 individuals. Orphanet J Rare Dis, 2021, 7: 31.17 , , , et al. Novel mutations in five Japanese patients with 3-methylcrotonyl-CoA carboxylase deficiency. J Hum Genet, 2007, 52: 1040-1043.