整理棕色蘑菇活性成分的初步研究.docx

1、整理棕色蘑菇活性成分的初步研究棕色蘑菇活性成分的初步研究吴爽（天津农学院农学系）1 前言棕色蘑菇( Agaricus brunnescens Peck) 俗称棕蘑,隶属于担子菌纲(Basidiomycotina) ,伞菌目(Agaricales), 蘑菇科(Agaricaceae) , 蘑菇属(Agaricus)。棕色蘑菇菌盖棕褐色,不会因褐变引起商品质量下降,又无需使用化学护色、漂白剂处理,从而保证了食品的营养和安全;其子实体的营养、口感和香味更接近于野生口蘑,受到欧美及世界发达国家和地区消费者的青睐,也是我国鲜食的优质蘑菇品种。真菌多糖是从真菌子实体、菌丝体、发酵液中分离出的由10个分子以

2、上的单糖通过糖苷键连接而成的高分子多聚物，是一类可以控制细胞分裂分化、调节细胞生长和衰老的活性多糖，是当今医药和食品工业共同关注的焦点。国内外已从高等担子菌中筛选到200多种有生物活性的多糖物质，目前市场上投放的真菌多糖类保健品已有上百种之多。真菌多糖在免疫功能的调节、肿瘤的抑制、抗衰老及调节血压、血脂等方面都有着重要的作用。1.1 真菌多糖的结构 真菌多糖的结构可分为一级结构、二级结构、三级结构和四级结构。一级结构包括糖基的组成、排列顺序、相邻糖基的连接方式、异头物构型及糖链有无分支、分支的位置与支链的长短等。真菌多糖的一级结构主链是均糖链，主要有：葡聚糖（Glucan），以（13）糖苷键连

3、接为主，兼有少量（14）或其它糖苷键，侧链是以（16）或（13）健合的葡萄糖低聚物。如香菇多糖（Lentinan）、裂褶菌多糖（schizophyllian Polysaccharide）的一级结构都属于这种连接1。甘露聚糖（Mannan），主要由-糖苷键连接为主链，如冬虫夏草多糖（Polysaccharide of Cordyceps Sinensis）为（12）糖苷键连接2，银耳多糖（Tremella polysaccharide）和黑木耳多糖（Auricularia auricularpolysaccharide）为（13）糖苷键连接3。二级结构指多糖骨架链间以氢键结合所形成的各种聚合体

4、，这只关系到多糖分子中主链的构象，不涉及支链的空间排布4。三级结构是指由多糖的糖残基中的羟基、羧基、氨基及其它基团间通过非共价相互作用而形成的有序、规则的空间构象。四级结构指多聚链间以非共价键结合形成的聚集体。1. 2 真菌多糖的结构与生物活性的关系1. 2. 1分子量大小对生物活性的影响 分子量大小是多糖具备生物活性的必要条件，这可能与多糖分子形成的高级构型有关。多糖发挥生物学活性通常需要其分子质量在一定范围内：多糖分子量越大，分子体积越大，不利于多糖跨越多重细胞膜障碍进入生物体内发挥生物学活性；但分子量过低，无法形成产生活性的聚合结构。高分子量的（13）-D-葡聚糖的高度有序结构（三股螺旋

5、）对于调节免疫活性至关重要，而只有分子量大于9.0104的分子才能形成三股螺旋，三股螺旋结构靠-葡萄糖苷键的分支来稳定5。而且不同多糖产生生物学活性的最佳相对分子质量的范围不同。 一般认为，分子量大于16kD时才有抗肿瘤活性。如分子量为16kD的虫草多糖有促进小鼠巨噬细胞吞噬作用的活性，而分子量为12kD的虫草多糖就失去此活性2。分子量大于100kD且有三股螺旋的裂褶菌多糖具有较强的抗肿瘤活性，而分子量小于50kD的裂褶菌多糖无任何生物活性。1 .2. 2 主链连接方式对生物活性的影响 长期的实验表明，在多糖骨架链上占优势的（13）连接的-D-葡聚糖，往往具有抗肿瘤活性5。小核菌多糖、香菇多糖

6、、裂褶多糖都是该骨架的葡聚糖，香菇多糖和裂褶菌多糖是被研究最多的具有免疫调节活性的（13）-D-葡聚糖，两者均被用作免疫药理制剂。从香菇中分离的香菇多糖，主链是-（13）-D-葡聚糖，主链上约有23的葡萄糖残基通过C-6分支点连有侧链6。从银耳中分离得到的银耳孢糖（TSP-2aTSP-2c），其结构都是以（13）-D-甘露聚糖为主链，并在O-2、O-4、O-6位上有分支点，它们都能刺激人外周单核细胞产生IL-1a、IL-6、IL-8的数量增加，具有显著的免疫活性3。1. 2. 3 分支度对生物活性的影响 支链的分支度（degree of branch，DB），是指平均每个糖单位所具有的分支数目

7、。分支度大小与多糖生物活性关系并不是一种线性关系，分支度适中的多糖往往具有较高的活性，而分支度过大或过小都无法使多糖生物活性达到理想状态。具有生物活性的真菌多糖的分支度变化较大，一般为0.020.75。研究结果表明，只有分支度在0.20.33的那些（13）-D-葡聚糖才具有较强的生物活性7。如活性很强的香菇多糖和裂褶菌多糖仅在C-6上有分支，分支度为0.33。DB为0.310.36的灰树花多糖、DB为0.2的猪苓多糖均显示出较强的免疫活性。1. 2 .4 支链及支链基团对生物活性的影响支链的分支度和性质对-（13）-葡聚糖的免疫活性也有较大影响。支链分支度较高的-（13）-葡聚糖生物活性较强，

8、如冬虫夏草的胞外多糖CS-81002可促进巨噬细胞的吞噬功能，不同程度的酸水解可使CS-81002的分子量下降，分支减少，并降低了对巨噬细胞的促进作用2。 经13C核磁共振谱分析推断，连接在-（13）-D-葡聚糖骨架上的多羟基基团，对抗肿瘤活性起重要作用。从黑木耳子实体中分离得到一种无生物活性的葡聚糖B，对其进行过碘酸氧化、硼氢还原及温和水解，得到降解的水溶性多糖，该多糖在其0-6上共价连接多元羟基，显示出较强的生物活性，具有很强的抑瘤活性8。茯苓多糖是茯苓菌核的主要成分，易溶于稀碱而不溶于水。主链是一种线性-（13）糖苷键连接的葡聚糖，支链由910个葡萄糖残基通过-（16）糖苷键连接。该多糖

9、基本没有抗癌作用，但通过适当的溶剂处理使之转变成溶于水的多糖，就具有了抗肿瘤活性。如用4molL的尿素溶液在70处理多糖4h，其三级结构发生变化，将其中的一些-（16）支链用类似过碘酸氧化、Smith降解的方法将其切去，成为U一茯苓多糖后，就获得了具有强烈抗肿瘤活性的多糖，称为次茯苓多糖；如果再将次茯苓多糖羧甲基化，其活性就更高9。1.3 真菌多糖的主要药理作用1. 3. 1真菌多糖的抗肿瘤活性 许多真菌多糖都具有抗肿瘤活性。云芝多糖可有效地抑制S180肿瘤生长，给小鼠灌胃，口服5001000mgkg，抑制率达31.9632.99；腹腔给药25mgkg，抑瘤率为34.85。刘瑞等12研究显示，

10、用云芝多糖提取物（800mgkg）灌胃给药7d，可显著抑制皮下接种的鼠肝癌HepA细胞的生长，抑瘤率达44.50；可提高血清中IgG的含量，显著促进胸腺T淋巴细胞转化增生，抑制小鼠肝内鼠抗人P53单克隆抗体、鼠抗人VEGF单克隆抗体的表达，具有显著的肿瘤抑制作用。云芝多糖是一种免疫调节剂和免疫增强剂，它是通过调节和增强机体的免疫功能，特别是增强T淋巴细胞的功能而发挥抗肿瘤作用的。 灵芝多糖能明显延长S180、U14腹水型荷瘤小鼠生存期，延长荷瘤小鼠的生命。灵芝多糖的抗肿瘤作用是由机体的免疫系统介导的。灵芝多糖在体内既可诱导巨噬细胞、T细胞释放肿瘤坏死因子-（TNF-）、干扰素-（INF-）等细

11、胞因子，抑制、杀死肿瘤细胞；也可通过树突状细胞（DC）诱导的特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL）活化，进一步发挥细胞毒作用，而这一作用与灵芝多糖明显促进CTL细胞的IFN-mRNA转录及蛋白表达以及显著促进CTL中的颗粒酶B在基因转录和蛋白水平表达有关13。1. 3. 2 真菌多糖的免疫调节作用 实验证明，多数真菌多糖的抗肿瘤作用是作为生物反应调节剂，通过增强宿主免疫调节功能即宿主介导抗肿瘤活性来实现的。真菌多糖可通过多条途径、多个层面对免疫系统发挥调节作用。大量免疫实验证明，食药用真菌多糖不仅能激活T、B淋巴细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞等免疫细胞，还能活化补体，促进细胞因子的生成，对免疫系统发挥

12、多方面的调节作用14。香菇多糖可以明显增加小鼠胸腺重量，电镜下可见胸腺网状内皮细胞增生，体积增大，细胞中线粒体数目增多，体积增大，表明其功能旺盛，说明香菇多糖可以增强细胞免疫；香菇多糖对脾脏的重量无明显影响，但电镜下可见脾脏中浆细胞数目增多，以成熟浆细胞为主，浆细胞中粗面内质网扩张呈泡状或环形，腔内电子密度降低，充满合成的抗体蛋白颗粒，表明其功能十分旺盛，证明香菇多糖也可以增强机体体液免疫14。1. 3. 3 真菌多糖的降血糖作用 食用菌多糖降血糖的机制主要有4种15：促进胰岛素分泌，增加血清胰岛素含量。注射虫草多糖（CSP-1）连续一周后，正常小鼠血糖水平显著降低，高血糖小鼠的血清胰岛素水平

13、显著性升高，这提示CSP-1能刺激胰腺分泌胰岛素及降低胰岛素代谢。改善胰岛素抵抗。胰岛素抵抗是指机体对胰岛素产生抵抗，所以组织不能正常利用葡萄糖，而需要超常量胰岛素才能获得常量胰岛素的生理功能。黄志江等运用体外细胞培养法发现人工虫草多糖能促进胰岛素抵抗的脂肪细胞对葡萄糖的摄取水平，并认为其降血糖作用与促进外周组织的葡萄糖代谢、改善胰岛素抵抗有关。加速肝葡萄糖代谢。香菇多糖就是通过调节糖代谢、促进肝糖原合成、减少肝糖原分解而起到降血糖、改善糖耐量作用的。这主要表现为高低剂量组的香菇多糖都有明显的降血糖作用，能明显改善高血糖大鼠的糖耐量，提高肝糖原含量。减少或减缓对葡萄糖的吸收。香菇多糖吸水性强，

14、它能在胃肠道内形成凝胶以调节小肠对葡萄糖的吸收及减缓葡萄糖向小肠绒毛膜的扩散，因此香菇多糖具有调节血糖平衡、改善糖耐量的作用。 真菌多糖除了以上生物活性外，还具有抗氧化、抗病毒、抗疲劳、抗辐射、抗血栓、抗凝血、降血脂、降血压、改善记忆等作用。1.4 真菌多糖的提取工艺1. 4. 1 多糖的提取 真菌多糖按溶解性不同可分为几个种类，如灵芝多糖种类很多，有水溶性多糖、水不溶性多糖、酸性多糖和碱性多糖等10。提取的方法按提取溶剂的不同可以分为热水浸提法、微波辅助热水浸提法、酸提法、碱提法、有机溶剂提取法、双酶提取法、复合酶提取法、超声波催化酶法等，其中较常用的是水提法和碱提法。水溶性多糖可采用水提法

15、，即用水加热浸提，将水提液过滤，滤液浓缩，然后边搅拌边加入4倍体积95的乙醇，待沉淀完全后过滤，沉淀相经乙醇、丙酮、乙醚洗涤，或经流水透析再冷冻干燥便可得到多糖粗制品。水不溶性多糖一般用酸或碱法提取，常用试剂有三氯乙酸、稀盐酸、草酸铵、氢氧化钠等。影响真菌多糖得率的因素很多，如提取时间、浸提比、提取次数、温度、pH值、溶剂和搅拌等都能影响真菌多糖得率。如香菇多糖的提取大多采用不同温度的水和稀碱溶液，并尽量避免在过于酸性的条件下操作，因为强酸性能引起糖苷键的断裂，形成较多的单糖和低聚糖，从而使还原糖含量升高和多糖含量下降10。 多糖总量测定采用苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法、间接碘量法。最常用的方法

16、是苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法。本实验采用苯酚-硫酸法，以获取最佳的提取工艺；同时对棕色蘑菇中多糖的抗氧化活性进行初步研究。2. 实验方法2.1 实验材料2.1.1 药材来源班立桐老师提供的棕色菇。2.1.2 实验仪器JH754 紫外可见分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司LXJ-HB 离心机 上海安亭科学仪器厂JY88- 超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司电子天平 FA2004 中华人民共和国上海金科天平2.1.3 实验试剂所需药品及溶剂：葡萄糖、EDTANa2、FeSO4、苯酚、Tris、邻苯三酚、磷酸二氢钾、无水乙醇、丙酮、三氯甲烷、乙醚、浓硫酸、浓盐酸、正丁醇、H2O2、乙酸

17、乙酯等。显色液：硫酸苯酚显色液2.1.4 实验器材玻璃比色皿、石英比色杯、试管、三角瓶、量筒、移液管、记号笔、烧杯、离心管、试管架、锥形瓶、布氏漏斗、玻璃棒等。2.2 实验方法2.2.1 真菌多糖的提取2.2.1.1 药品预处理用电子天平准确称取1g棕色菇，进行研磨。2.2.1.2 超声波破碎提取准确称取苇蘑1g放入50mL的离心管中，按适当料液比向离心管中加入一定体积蒸馏水，在恒温水浴锅中以一定得温度加热5min，然后放入超声波细胞粉碎机中超声提取。（由于超声波细胞粉碎机不具备加热功能，因此在超声过程中要每间隔5分钟对料液进行加热，以便维持料液在恒定的温度13。）超声处理一定时间后，把离心管

18、放入离心机中离心10min后取上清液；再向离心管中加入等体积的蒸馏水，充分混匀后再超声处理同样的时间，然后离心取上层清液。两次清液合并，并测量体积。2.2.2 超声波破碎提取真菌多糖提取条件的优化用正交试验对提取因素：超声时间、超声功率、料液比、超声温度进行优化。选用L1644正交表，不考虑因素间的交互影响。因素水平设计如表1表1 正交试验的因素和水平水平A/料液比B/超声时间(min)C/超声温度（）D/超声功率（W）11：10530502 1：2015501003 1：30257015041：4035902002.2.3 硫酸苯酚定糖法测定多糖含量142.2.3.1 配制显色液配置5%苯酚

19、溶液，在电子天平上准确称取5g苯酚，用100mL的容量瓶定容配成5%的苯酚溶液。（溶剂为蒸馏水）（显色液的颜色为棕黄色）2.2.3.2 显色温度的确定 分别吸取一定量的标准葡萄糖溶液样品，分别置于4支比色管中。加水至2mL，再加1mL5%苯酚和5mL硫酸，摇匀后分别于0、25、50、75、100、显色20分钟，冷却后测吸光度，结果上述温度下吸光度分别为：0.543、0.665、0.584、 0.478、0.432。在 25 条件显色可以达到最大的吸光度，所以测多糖含量时显色温度以25为最佳。2.2.3.3 制作标准曲线（1）在电子天平上准确称取葡萄糖0.1g，用100mL的容量瓶定容配成1.0

20、mg/mL的葡萄糖溶液。取1mL上述溶液定容至10mL，即为0.1mg/mL的葡萄糖溶液。并分别稀释成0，0.01，0.015，0.02，0.025，0.03，0.035，0.04mg/mL浓度梯度的葡萄糖作为基准物。（2）每种浓度的葡萄糖溶液取1mL分别加入5mL显色液振荡混匀，然后于25水浴中加热30min，流水冷却后于754型分光光度计490nm处测光密度值。（3）以葡萄糖浓度为纵坐标，光密度值为横坐标作标准曲线。见表2表2 葡萄糖标准曲线项目01234567葡萄糖浓度（mg/mL）00.010.0150.020.0250.030.0350.04显色液（mL）55555555吸光度(A)

21、00.10.1420.1920.2460.2780.3200.380 图1 标准曲线图2.2.4 清除超氧阴离子()能力的测定2.2.4.1 试剂的配制Tris-HCl缓冲液(pH=8.0，50mmoL/L)：取Tris0.6lg，EDTANa2 0.037g用双蒸水溶解至98mL左右，用HCI调节pH=7.90(用pH计校正)最后定容至l00mL。HCI溶液(10mmoL/L)：取100L浓盐酸定容至100mL即可。邻苯三酚溶液(50 mmoL/L)：称取邻苯三酚0.063g，用10 mmoL/L HCI溶液溶解，定容至10mL，避光，冷冻保存。2.2.4.2方法：采用邻苯三酚法38 。 操

22、作步骤：分别取10l 浓度为10mg/mL 上述15种植物提取物样品10l，加入3ml PH为8.2的tris-Hcl缓冲液，25水浴20min。水浴结束时，各样品管中加入7mmol/L的邻苯三酚溶液3ml，反应4min后加入28l、10mol/L的盐酸终止反应，以tris-Hcl缓冲液调零，在420nm处测吸光度值，根据抑制率判断样品对清除的能力。每份样品重复测定5次。抑制率%=A对照（A样品A样品空白）/ A对照100% A对照为不加样品的反应体系，A样品为加入样品的反应体系，A样品空白为不加邻苯三酚的反应体系。2.2.5 清除羟自由基(OH)能力的测定2.2.5.1 试剂的配制 H2O2

23、溶液（8.8mmol/l）：取H2O217.08l加蒸馏水定容至25ml。 FeSO4溶液（10mmol/l）：取FeSO438mg加蒸馏水定容至25ml。 水杨酸溶液（10mmol/l）：取水杨酸34.53mg加蒸馏水定容至25ml。2.2.5.2方法：采用水杨酸法39。 操作步骤：分别取10mg/mL上述15种植物提取物样品10l，分别加入8.8 mmol/L H2O2 1ml,10mmol/L FeSO4 1ml, 10 mmol/L 水杨酸1 ml。加H2O2启动反应，37反应0.5 h。以蒸馏水作参比，在510 nm下测吸光度。每份样品重复测定5次。清除率（%）（A0-(A1-A2)

24、）/A0100其中A0为对照液的吸光度，A1为加入样品后的吸光度，A2为不加显色剂H2O2样品溶液的吸光度。2.2.6 维生素C的测定（紫外快速测定法）2.2.6.1 原理 维生素C又称抗坏血酸，广泛存在于水果及蔬菜中，柑桔、番茄、辣椒、苹果、鲜枣、猕猴桃、豆芽、甘蓝、洋葱、菌类等果蔬中均具有较高的含量。由于维生素C具有较强的还原性，对光敏感，氧化后的产物称为脱氢抗坏血酸，脱氢抗坏血酸仍然具有生理活性。进一步水解则生成2，3-二酮古洛糖酸并失去生理活性。食品中的维生素C主要以前2种形式存在，通常以二者的总量表示食品中维生素C的含量。测定维生素C的方法很多，常用的有2，6-二氯靛酚滴定法、荧光法

25、、高效液相色谱法、紫外分光光度法等。紫外测定法是维生素C快速测定的方法，操作简单，不受其它还原性物质等成分的干扰。其原理是根据维生素C具有对紫外光产生吸收、对碱不稳定的特性，在243nm处测定样品液与碱处理样品液两者吸光度值之差，并通过标准曲线，即可计算出维生素C的含量。2.2.6.2 试剂配置（1）10%HCl：取133mL浓盐酸，加水稀释至500mL； （2）1% HCl：取22mL浓盐酸，加水稀释至100mL； （3）1mol/L NaOH溶液：称取40g 氢氧化钠，加蒸馏水，不断搅拌至溶解，然后定容至1000mL。2.2.6.3 操作步骤(1) 维生素C标准溶液的配制： 在分析天平上准

26、确称取抗坏血酸10mg，加2mL 10%HCl，再蒸馏水定容至50mL，混匀，即为200g/mL维生素C标准溶液。(2) 测定并制作标准曲线：取具塞刻度试管8支，依序加入100g/mL维生素C标准溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0mL，分别补加蒸馏水至10.0mL，摇匀。以蒸馏水为空白，在243nm处测定标准系列维生素C溶液的吸光度。以维生素C的量（g）为横坐标，对应的吸光度（A243）为纵坐标作标准曲线。见表3 表3 维生素C标准曲线项目01234567标准液体积（mL）00.20.40.60.81.01.21.4维生素C含量（g）04080120160200

27、240280吸光度(A)00.1220.2540.4060.5550.7310.8400.980（3）样品中维生素C含量的测定：用正交表分析结果的最优水平制备样品提取液。取0.10.2mL提取液，放入盛有0.20.4mL10%HCl的10 mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度后摇匀。以蒸馏水为空白，在243nm处测定吸光度。(4) 待测碱处理液的制备与测定：分别吸取0.10.2mL提取液、2mL蒸馏水和0.60.8 mL1mol/L NaOH溶液依次放入10 mL容量瓶中，混匀，15min后加入0.60.8 mL10%HCl，混匀，加蒸馏水定容至刻度。以蒸馏水为空白，在243nm处测定吸光度。（也

28、可以碱处理待测液为空白，在243nm处测定样品提取液的吸光度。）（5）计算：由待测液及碱处理待测液的A243值之差，查标准曲线，计算样品中维生素C的含量；或者直接以碱处理待测液作空白测得的样品提取液的吸光度值查标准曲线，计算样品中维生素C的含量。式中：C由标准曲线查得的维生素C含量（g）； V样品提取液定容体积（mL）； V1测定时吸取样品提取液的体积（mL）； W称取样品的质量（g）。3. 实验结果3.1 棕色蘑菇正交试验结果四水平四因素的正交试验的设计见表1。根据棕蘑多糖的测定方法可得正交试验方案与结果。见下表43.2 棕色蘑菇多糖的含量测定在正交试验的最佳提取条件下测定真菌多糖的含量，准

29、确称取棕蘑1g放入50mL离心管中，向其中各加入30mL蒸馏水。在恒温水浴锅50下加热5min，然后进行超声15min，超声后离心取上清液，再加入30mL蒸馏水混匀后在恒温水浴锅50下加热5min，然后进行超声15min后离心取上清液。两次上清液合并，并记下体积。取1mL离心得到的上清液，稀释50倍。再取稀释液1mL加入5苯酚1mL、浓硫酸5mL，然后振荡混匀，在沸水浴中显色20min，冷却至室温，此时溶液颜色为棕黄色。再在754型分光光度计490nm处测光密度值。多糖含量=上清液体积稀释液稀释倍数多糖浓度/样品重量100表4 正交试验方案与结果序号A（W）B（）C（min）D溶液（mL）吸光

30、度（A）多糖含量（）1503051:1018.50.4830.04725050151:20360.5170.09935070251:3052.20.2090.05745090351:40670.0480.017510030151:3055.50.2180.06461005051:4074.80.0980.039710070351:1013.80.3980.0298100环境的两个特点：9025意愿调查评估法（简称CV法）是指通过调查等方法，让消费者直接表述出他们对环境物品或服务的支付意愿（或接受赔偿意愿），或者对其价值进行判断。在很多情形下，它是唯一可用的方法。如用于评价环境资源的选择价值和存在价值。1:20300.1730.028建设项目环境影响评价技术服务机构（以下简称“环评机构”）应当按照建设项目环境影响评价资质管理办法的规定申请建设项目环境影响评价资质（以下简称“环评资质”），经国家环境保护部审查合格，取得建设项目环境影响评价资质证书后，方可在环评证书规定的资质等级和评价和范围内从事环境影响评价技术服务。9