一种吸管虫的生物学研究毕业作品.docx

1、一种吸管虫的生物学研究毕业作品毕-设业-计（20_ _届）一种吸管虫的生物学研究所在学院 专业班级 生物技术 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 摘要：本工作对出芽斑吸管虫的生物学进行了详细研究，包括形态学，分类学，生活史等。采集于自然水体的吸管虫在实验室条件下培养，通过体式显微镜和光学显微镜观察该类生物的生活史、活体形态学等特征，用蛋白银染方法揭示其游泳体的纤毛图式，核器结构等结构。出芽斑吸管虫虫体杯状或梨形，活体大小为100-250 100-300 m。有吸管状吸管6-10根，针状吸管30-50根。柄中空而透明，长度约为300-1600 m，通常具有横向环纹和纵向沟纹。大核呈

2、冠状，有不规则分枝。游泳体通常为椭球形或耳状，具马蹄形纤毛区，动基列22-33，动基列片断10-20，大核为“C”形。对本种的鉴定应基于活体体形和大小，吸管的数目和分布，以及柄的形状等特征。关键词：纤毛虫；出芽斑吸管虫；形态学；分类学Abstract: Here is a detail research about Ephelota gemmipara, including morphology, taxonomy and life history. The samples were collected from in the natural water and cultured in lab

3、. Observation of the life history, morphology characteristics of living cells using stereomicroscope and optical microscope. Protargol impregnation can reveal its cilia pattern of swarmers, macronucleus. Pyriform or cup-shaped body about 100-250 100-300 m in vivo, colorless to brown; six to ten suct

4、orial tentacles and 30-50 prehensile tentacles; about 300-1600 m long hollowed interiorly stalk transparent, sometimes transversely striated or longitudinally edged; macronucleus crown-shaped and irregularly branched; swarmer with ellipsoidal or ear-shaped body, with 22-33 somatic kineties arranged

5、in horseshoe-shape, fragment kineties about 10-20 rows, and macronucleus C-shaped.Keyword: Ciliate; Ephelota gemmipara; Morphology; Taxonomy1引言1.1 研究目的及意义随着文明的发展，人类的进步，科学技术的不断发展，生物科学也正式迈入现代生物科学的新时代。现代生物科学的主要研究内容主要包括对生物有机体在分子、细胞或个体水平上通过一定的技术手段进行设计操作，改良物种质量和生命大分子特性等工作。近年来，基因工程、细胞工程、酶工程等现代生物技术的各个方面都取得了

6、巨大成就，整体研究水平飞速提高。原生动物是最原始的真核生物。其原始性不但表现在结构水平上，即停留在单细胞或其群体的水平，不分化组织；同时表现在营养方式的多样性上，包括自养、异养或混合营养。原生动物的生殖通常为无性生殖，且生殖周期相对于其他高等动物来说十分短暂。虽然原生动物是最原始的真核生物，但其自身即为一完整的生命体，可以独立地执行高等动物所具备的各种基本生理功能，加上其较短的生命周期、取材和培养十分简便、相对于其他高等动物细胞而言，单细胞的原生动物的细胞结构十分复杂，因此，纤毛虫原生动物在许多生物学研究领域被作为最理想的实验材料而广泛应用。吸管类纤毛虫原生动物是纤毛门原生动物中的“另类”，因

7、其生活史复杂，生殖方式为典型的无性出芽生殖。生命周期明确分为成体和幼体阶段，成体与幼体的形态完全不同，如成体通常为以透明中空的柄固附或外栖性生活，体表没有纤毛，管状或针状触手成簇或周身分布，以其他原生动物或小型生物为食；幼体(游泳体)可自由游泳，全身或部分被有纤毛，无柄和吸管，其形态与纤毛门其他类群十分相似(陈相瑞，2009)。吸管类纤毛虫的生物学特点决定其可作为良好的实验生物，通过动物发生率原理揭示生物进化中的一系列问题。1.2 研究历史、现状及趋势有关纤毛虫的研究可追溯到17世纪后期，1674年列文虎克用自制显微镜首次发现并描述了各类纤毛虫，至今己有300多年的历史(宁应之等，1996)。

8、对土壤纤毛虫的研究起始于1838年，由Ehrenberg首次发现并描述了一些土壤纤毛虫种类（Ehrenberg，1838）。随后Martin、Sandon、Kahl等相关学者不断研究探索并陆续发表了有关土壤纤毛虫分类学和生态学的研究成果，使信息不断完善，更具系统性。20世纪60年代以前，国际上对纤毛虫的研究处于“经典期”，即只对虫体大小、外形、行为等方面的特征进行观察研究。到6070 年代，国际间对纤毛虫的研究工作进入“转型期”， 即由经典的建立在活体观察水平上的研究转入到应用现代技术对“纤毛图式”、超微结构以及分子生物学特征等进行揭示，取得了阶段性的发展（宋微波等，2000）。80年代后，生

9、物学家在纤毛虫分类学研究中开始应用电镜技术，尤其是进入21世纪后，分子生物学手段的广泛运用，对纤毛虫研究多年来遗留下来的大量混乱和错误的清理提供了有利的帮助。我国对纤毛虫研究起步于本世纪20 年代，生物学家开始主要在黄海至南海的广大海域对各类自由生活以及海胆体内共栖生活的纤毛虫之分类学、地理分布及生态学等领域进行开拓性的工作（宋微波等，2009）。但由于生物技术、现有研究资料与研究背景等方面的限制，对纤毛类原生动物的研究相对落后，仍处于初级阶段，所涉及的内容仅限于形态分类学、系统学、细胞发生学、病害学和生态学等几个方面，很多方向尚未得到开发。吸管类纤毛虫的研究历史迄今约有250年的历史，对该类

10、生物的研究最早见于Pallas（1766）对结节壳吸管虫的描述，在随后的200多年中，国外大量学者通过经典研究手段对该类群进行了较为系统和详细的研究。纤毛虫原生动物的研究自上世纪50年代进入新阶段，主要是各种银染方法的运用，以及70年代后扫描、投射电镜等现代生物技术的运用，使该类生物的研究飞速发展。但吸管类纤毛虫处于成体阶段时，体表无纤毛，结构相对简单，不同种间在特征方面又有很大的相似性，而蛋白银等现代银染技术应用于该类群的分类学中还有很多难处，因此使其研究工作一直滞留于传统方法(活体或固定样品进行观察)。 早期分类学依据吸管虫的形态学（触手位置，是否具外壳，是否有柄等）将其分为七个科，而近年

11、来生物学家则根据其无性生殖的芽体形成方式不同进行分类，共分为三类：一类为外出芽方式的外生亚目，一类为内出芽方式的内生亚目，一类为外翻亚目。Guicher（1951）通过经典手段对吸管类纤毛虫的外翻亚目做了相对系统的研究，Matthes（1988）等人在前人的基础上，对历史资料与其自身研究成果进行了整理与理清，完成了该类群的唯一一本巨著Suctoria und Urceolariidae。我国对该类生物的研究一直为空白，直到本世纪初方见零星报道。如陈相瑞等人在2005年对青岛沿海生境内吸管虫原生动物的动物区系做了相对完善的研究，吴利、陈相瑞等于2006年对武汉东湖淡水水体内若干类吸管虫的形态学做

12、了简单描述。2吸管类纤毛虫的特征吸管虫在自然界广泛分布，包括淡水和海水的种类，大部分还可附生于其他生物体表(Roberto, 2006; Ricardo, 2010)。吸管虫是纤毛门中高度特化且数量最丰富的类群，约占纤毛虫种类总数的7左右（宋微波等，1999）。在Corliss的分类系统中，吸管类纤毛虫隶属于纤毛门，动基片纲，吸管亚纲、吸管目（Corliss，1979）。几乎全部的吸管虫为固附或外栖性生活，无性生殖以出芽为主，根据出芽的三种不同方式，分为外生、内生和外翻3个亚目。由于吸管虫的生殖方式很特殊，所以其生活史可以明确分为成体和幼体两个阶段。成体时体表无纤毛和胞口；部分或周身分布营摄食

13、的管状或针状触手，触手为中空的管状，末端膨大成球状吸盘。触手具有收缩性，能分泌毒液，其上通常生有突出小体，称系缚式刺丝泡，借以捕食其它纤毛虫或它类原生动物（陈相瑞，2009）。多数种类的吸管虫具有无伸缩性的柄。幼体(游泳体)全身或部分被有纤毛，无柄和吸管，但可自由游泳。该类纤毛虫对环境要求很苛刻，正因为如此，海洋中该类群相对稀少，从Ehrenberg于1833年描述第一种吸管虫(结节壳吸管虫)至今，约两个世纪所报道的和描述的吸管虫中淡水种类约400种。3实验材料3.1 仪器眉毛笔、吸管、培养皿、载玻片、盖玻片、多孔凹玻片、胚胎皿、解剖镜、光学显微镜、微分干涉显微镜、加热板。3.2 试剂冰醋酸(

14、CH3COOH)甲醛(HCHO)乙醇 (C2H5OH)苦味酸(NO2)3 C8H2OH氯化高汞（HgCl2）亚硫酸钠(Na2SO)4对苯二酚（C4H4O2）甘油(C3H8O4 )麝香草酚(C10H14O)次氯酸钠(NaClO)硫代硫酸钠(Na2S2O3)硝酸银(AgNO3)二甲苯（C8H10）凡士林4实验方法4.1 标本采集4.1.1 采集工具准备(1) 500和1000ml广口瓶各一个，用于盛放载玻片的染色缸(数量视采集点设置而定)；(2) 装PFU (海绵块约7x7x7 cm)的密闭塑料袋或具盖水桶一个；(3) 另准备拖浮网，若干个由培养皿改制成的潮湿房(分离培养用)。4.1.2 采集地点

15、 采集地点为胶州湾养殖区。4.1.3 标本采集 在本工作中，我们针对的是周丛生吸管虫，借用PFU块或载玻片框法进行采集。 应用载玻片框时，选择游人不易到达处，将框沉入水中(可视情况选择不同深水层悬置)并作好标记。通常视水中虫体多寡而让其在水中暴露1至数周。取出时应尽量避免搅动，以染色缸取原位水小心将玻片插入缸内带回。 借用PFU块进行采集时，海绵块(PFU)应事先坠以重物，浸入水中后挤干内部的气泡。根据需要调节海绵块的深度，上端固定于水面标志物上。还需注意： 1)需先行视水质状况而选择放置日期； 2) 浸入水中需先行反复挤压数次以去除气泡。4.2 分离由于虫体经采集后是一非正常的、高度浓缩了的

16、群落结构，因此分离和处理应力争在数小时内进行，以避免所获种类消亡。在解剖镜下进行，根据虫体的大小而选用不同口径的微吸管将所需虫体挑选至已备好的培养皿或多孔凹玻片内(对于虫体数量不多时推荐后者)。当用多孔凹玻片分离虫体时，为防止干涸，分离后的玻片即应置于潮湿房内。如不能立刻分离时， 则加培养水(或清洁水)至样品内(至少等量)以稀释并暂时于低于原水环境5-10的培养箱内保存(此步不应超过24小时)。 一经分离后即刻应对分离标本进行编号，以备查。编号为年-月-日-序号：2010-10-23-1； 2010-10-23-2，同时标明采集人、地点、主要生境特征（如温度、盐度等）等。分离后，从次日起每日对

17、所分离虫体进行检查，以了解存活情况，同时在必要时进行剔除杂质、其他混入生物等，必要时应及时转移培养水体，补充饵料或进一步的分离、纯化工作。分离后的原始水样应力求较长时间地保存，目的在于发现其他数量较少而尚未被发现的种类。故保持每日镜检1-2次的频度。对此水样在必要时应做稀释（如高污染或过富水样）或适当的降温处理（如原来水体如此）。4.3 培养 根据培养虫体的单一程度可至少将培养类型分为三种，即粗培养，纯培养和克隆培养，本实验是对吸管虫生态学研究的种类鉴定，我们采用粗培养法：直接吸取原采集样入培养皿中，镜下去除大型后生动物及多余的沉积物，加适量米粒或剪开的麦粒以致富细菌(水较富时也可不加)。然后

18、每日检查1-2次，以清除某些快速繁殖的不欲保留的种类，并每日更新约半量的培养水。4.4 活体观察活体观察方法主要用以获取纤毛虫活体细胞的分类学特征，包括大小、外形、运动特征、纤毛器、伸缩泡、食物泡、内质颗粒及射出体等, 以弥补单纯染色的不足。4.4.1 具体步骤(1) 用毛细吸管吸一小滴虫体于载玻片上，加盖玻片(四周涂以少许凡士林以避免直接压在虫体上)；(2) 观察与标本原始数据的记录（采集地、日期、编号）：在低倍镜下测量 (应至少选取大、中、小三个不同个体以得到虫体变幅的信息)，观察并记录虫体的大小、外形、运动特征；(3) 中倍镜下观察(轻压盖玻片以减缓虫体运动)：纤毛及纤毛器、伸缩泡、内质

19、情况、色素体的有无及体色；(4) 油镜下观察(轻压盖玻片至虫体无法运动为止)，此时应特别注意细胞的表膜结构、纤毛特征、射出体的有无/分布/形态、伸缩泡的形成及变化过程、食物泡和内质/表膜下颗粒分布特点等分类学特征。4.4.2 活体观察记录在记录用纸上对所观察标本予以编号 （如2010-12-5-01）（同时尽可能给出一日后可辨别的名称）：采集人，地点，日期，生境特征（盐度、水温、pH等）。体长体宽(应至少选取大、中、小三个不同个体) 推荐观察不少于5个个体。a. 在低倍镜下观察并记录（10 X物镜）：绘多幅小图分别显示观察到的虫体特征，拍照。b. 在中倍镜下观察并记录（20-40 X物镜）：伸

20、缩泡、内质情况、色素体的有无及体色。纤毛器分布特征、长度等。c. 在油镜下观察并记录（100 X物镜）：注意细胞的表膜结构，如射出体的有无/分布/形态、皮层下颗粒分布特点等、纤毛器特征、伸缩泡的形成及变化过程、食物泡、确定虫体体色来源、内质（结晶体），必要时拍照。4.5 蛋白银染色蛋白银染色技术最早为一组织染色法，Bodion 于1937年首先将之应用于原生动物上，经过几十年来不断的改进，已成为纤毛虫纤毛图式显示的最重要和最基本的方法。本方法主要用以显示虫体的皮层及内部结构，如纤毛下器、毛基体、核器及各种表膜下纤维系统等，而银线系统则不被染色。本实验我们采用Wilbert之蛋白银法。4.5.1

21、试剂配制(1)Bouin液：3份冰醋酸(CH3COOH)，1份甲醛溶液(HCHO)，15份苦味酸(NO2)3 C8H2OH；(2)饱和升汞液：氯化高汞(HgC12 )溶于水制成饱和溶液；(3)显影液：100ml蒸馏水，0.1g对苯二酚（C4H4O2），5g亚硫酸钠(Na2SO)4；(4)蛋白胶：蛋清滤液加等量甘油(C3H8O4 )，放少许麝香草酚(C10H14O)，05保存。4.5.2具体步骤(1) 用Bouin液或饱和升汞(HgCl2)将虫体于胚胎皿中固定5-10min；(2) 用蒸馏水洗3-4次(Bouin液以水洗至无色为准)；(3) 以最细微吸管小心将虫体“吹”至胚胎皿中心；(4) 用0

22、.1-0.2%的次氯酸钠(NaClO)微量直接供至虫体处以漂白至“透明”(约1-2min) (用HgCl2固定时，标本往往漂白效果略差)；(5) 蒸馏水洗两次(清洗完全为止)；(6) 将胚胎皿中蛋白银浓度控制在约0.5%， 加盖后在50-60的加热板上保持3050min (视不同种类的嗜染状况及虫体大小而调整时间)；(7) 用0.1-0.2 %的显影液在室温下显影1-5min (或更短)；(8) 镜检结束，用5%的硫代硫酸钠(Na2S2O3)定影约5min；(9) 蒸馏水洗一次(此时应清洁虫体)，将虫体转入载玻片上并与等量的蛋白胶混匀，用眉毛笔调体位(在必要时如需腹面朝上等)，除去余液，至加热

23、板烘片约10min；(10) 常规脱水封片(70%酒精起80%90%95%100%100%无水酒精和二甲苯混合液(1:1)二甲苯二甲苯，以上过程每步约2-5min, 其中在无水酒精中每步应不少于5min，以确保彻底脱水)。5结果与讨论5.1 出芽斑吸管虫5.1.1形态学描述出芽斑吸管虫成体组成包括了一长柄。活体大小约为100-400100-300m，但一般梨状(图1B；3A，C，E)。最宽部分在前端，逐渐朝着尾部缩小，圆形或稍扁平状断面。具有两种类型的吸管：5-8根指状吸管，长约20到30m，有收缩性，通常集中于身体顶端的地区(图1B；3A，C，E)；30 - 50根针状吸管的触手达200m，

24、细长而尖锐。在活体观察中我们观察到很多虫体表面有大量的球形颗粒，通常聚集在虫体的上半部分，围绕吸管状触手呈冠状分布(图1B；3A)。柄是透明的，而中空，长约300-1600 m，与虫体连接处最宽，向朝着柄基部逐步缩小(图1B，H；3G)；基部没有特殊的附属物(图3D，箭头)，通常有横向环纹有规律地排列在柄表面(图1E；3H)。细胞质无色，但每次喂食后通常变成深灰色且不透明的，因虫体内含物太多及虫体体形较大等原因造成的。大核不规则分支(图1B，J；4E)。没有观察到小核。观察到一个或两个收缩液泡，每个收缩液泡都有一个排泄孔，直径15 - 30m (图1B；3A；4G，H)。卵球形的包囊，直径约2

25、00m。包囊壁无色、透明和凝胶状(图1A；3F)。5.1.2 生殖和幼体描述许多出芽斑吸管虫的活体是通过外出芽生殖产生的，同时有多个芽体产生于体顶端(图2C；3J，L，O，P；4A，B)。首先，在母体顶端长出动纤毛，然后逐渐形成乳突状芽体，随着芽体的增大，母体大核延伸到每个芽体中(图2C；4J)。经数小时后，芽体成长为游泳体，脱离母体，于水中自由游动。游泳体活体大小约70-110 35-50 m，呈长卵形或耳状，前端钝圆，向末端逐渐变细。背部有4-8根末端膨大的触手，每根长约12m (图1C；3M 箭头指示)。在蛋白银制片中观察不到末端膨大的触手，却可发现数根吸管状触手和大量的针状触手(图2B

26、，J；5B，G)。在顶端有一列弓形的动基列，纤毛长约12m (图1C，箭头表示；D，箭头表示；3N，箭头表示)。腹侧平整，纤毛呈马蹄型排列，长约6m (图1D；3R)，在末端有一密集区是大量的动基列片段，该区纤毛长约8m。细胞质是无色的，通常包含许多直径 1m的细小颗粒。一个或两个伸缩泡，每个直径为6 - 8m之间，位于游泳体的前端(图1 C 双箭头；3M 箭头)。游泳体运动缓慢，在吸附于基质上，并长出一个柄之前，通常会在父母周围或在基质上爬行约1-2个小时。游泳体动基列数目及外观特征在不同种群间稍有不同(表1)。在第一个种群中，在腹侧大约有22-33列体动基列，呈长马蹄形排列，最外层大概有4

27、-8列体动基列几乎环绕虫体一周，但最后被末端的动基列片段截断；内侧的动基列从外到内逐渐减短，最外层左边缘的末端的几列体动基列排列稀疏，大约有3-8列 (图 2A，I；5A，C)。游泳体末端密集地排列着约10-17列动基列片段 (图1I；2B，J；5B，D)。在身体顶端的背面有一“弓”字形的动基列。大核为带状“C”形，两端和中间的一部分膨大(图 2B，J；5B，G)。在蛋白银制片中，通常有1个伸缩泡开口位于虫体的顶端附近(图2B， J；5B，双箭头指示)。帚胚在细胞中呈不规则环形，在蛋白银染后可以很明显的看到（图1I； 2A；5F，箭头表示) ，但帚胚的主要功能不确定。相比之下，在第二个种群中，

28、约有22-29列动基列片段，13-20列动基列片段(图2I，J；5C，G) 。 5.2 讨论与比较1876年，Hertwig首次描述了出芽斑吸管虫，以Podophrya gemmipara为名，随后在活体形态方面被多次重新描述(Kent 1881-1882; Maupas 1881, 1883; Sand 1899; Wailes 1925; Wang 1932; Kahl 1934)。通过Charon-Lwoff方法，Guilcher(1951)对该种活体形态、出芽生殖方式及游泳体的纤毛图式做了较详细的描述，但没有给出明细的数据。结合现有的研究资料，我们总结得到出芽斑吸管虫的主要特征为：1)

29、成体活体大小约100 100 m -400 300 m 之间；2)管状触手6-10根，针状触手30-50根；3)游泳体呈耳状，纤毛图式呈马蹄形。出芽斑吸管虫的柄的表面是高度变化的，在文献中有多种描述，如下：整个柄具有横向条纹，在柄与体结合处有纵向条纹，末端膨大且变厚(图 7B) (Hertwig 1876)；柄表面具有横向条纹(Wang 1932)；柄表面光滑且有若干条纵向脊(Kahl 1934)。现在的工作中观察到至少有四种类型的柄：(1)茎表面光滑不拥有任何特别的特征(图 3I)； (2)多边形截面，具有8条纵向脊，柄表面布有横向环纹 (图 1F，G；3A，D)；(3)整根柄有横向条纹，但

30、没有纵向脊 (图 1E；3H)；(4)茎表面光滑，但偶尔也会有一个或两个环状结构(图 1H；3G)。在种群研究水平上，所有这些角色似乎都是保守的，因此柄表观特征作为物种水平的研究价值是不确定的。所有特征在种群间具有高度稳定性。本研究种群与原始描述的出芽斑吸管虫在主要特征上很相似(Hertwig，1876年)，如身体的形状和大小，两种类型的触手，柄的长度和外部形状，出芽无性生殖方式及海洋生境，所以对该种群的鉴定是毋庸置疑的。在同类群中，有3种斑吸管虫与出芽斑吸管虫在活体形态上相似，得名于冠形斑吸管虫E. coronata（Wright，1858），扁形斑吸管虫E. plana（Wailes，19

31、25）及小型斑吸管虫E. minima（Noble，1929）。其中，就体形和大小而言，冠形斑吸管虫与描述种最相似，但两者可以很明显地区分开来，前者只有针状触手而无管状触手，且针状触手分布于全身，针状触手集中于虫体体上半部分，围绕管状触手分布，成冠状) (图7D；Kent 1881)。扁形斑吸管虫与出芽斑吸管虫的区别是柄的形状及虫体是否侧扁，扁形斑吸管虫柄扇形，虫体侧扁，而出芽斑吸管虫柄圆柱状虫体横截面圆形(图 7A；Wailes 1925)。小型斑吸管虫与出芽斑吸管虫可根据活体体形大小，身体形状和柄长区分开来。小型斑吸管虫较小，只有22-110 m长，虫体呈球形或卵圆形，柄长在16-84 m

32、之间；出芽斑吸管虫体长100-300 m，体呈梨形或杯状，柄长在300-1600 m之间 (图7E；Noble 1929)。6 展望纤毛虫与我们的日常生活有着密不可分的关系，在环保、工业、农业、畜牧业、渔业、药业等诸多方面都发挥着不可忽视的作用，并有着重要的经济意义。我们研究的出芽班吸管虫也是周丛生纤毛虫的主要组成类群，周丛纤毛虫的群落结构具有良好的自我维持和修复能力；集约化海水养殖水体中周丛纤毛虫的物种多样性显著高于开放的近海岸水体；其优势种群丰度、群落结构参数和多个环境因子具有显著的相关性；不同时空群落结构间相似性及其参数能较好反映周丛纤毛虫的群落结构演替，并能较好的响应集约化海水养殖水体环境的变化(李继秋，2008；Gong，2005)。本实验由于没有对环境化学因子进行实验